蔬菜中敵百蟲丙溴磷滅多威克百威

1、蔬菜中敵百蟲、丙漠磷、滅多威、克百威、敵敵畏殘留的快速檢測（KJ201710）1范圍本方法規(guī)定了蔬菜中敵百蟲、丙澳磷、滅多威、克百威、敵敵畏殘留的快速檢測方法。本方法適用于油菜、菠菜、芹菜、韭菜等蔬菜中敵百蟲、丙澳磷、滅多威、克百威、敵敵畏殘留的快速測定。酶抑制（率）法（分光光度法）2原理在一定條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。正常情況下，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計在412nm處測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率。3試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為

2、GB/T6682規(guī)定的二級水。3.1 試齊I3.1.1 丙酮（CH3COCH3）。3.1.2 磷酸氫二鉀（K2HPO4）。3.1.3 磷酸二氫鉀（KH2P。4）。3.1.4 5,5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（C14H8N2O8S2）。3.1.5 碳酸氫鈉（NaHCO3）。3.1.6 碘化乙酰硫代膽堿（C7H16INOS）。3.1.7 pH8.0緩沖溶液：分別稱取11.9g無水磷酸氫二鉀及3.2g磷酸二氫鉀，溶解于1000mL水中，混勻。3.1.8 顯色劑：分別取160mg5,5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，4C冰箱中保存。3.1.9

3、底物：取125mg碘化乙酰硫代膽堿，加15mL蒸儲水溶解，搖勻后置于4c冰箱中保存?zhèn)溆?。保存期不超過兩周。3.1.10 乙酰膽堿酯酶：4C冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2 參考物質(zhì)3種有機磷和2種氨基甲酸酯類農(nóng)藥參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量見表1,純度均、98%。表1有機磷和氨基甲酸酯類參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CASlb錄號、分子式、相對分子質(zhì)量序號中文名稱央文名稱CAS<#分子式相對分子質(zhì)里1克白威Carbofuran1563-66-2C12H15NO3221.252滅多威Methomyl59669-26-0C5H10N2O2S162.233丙澳磷prof

4、enofos41198-08-7C11H15BQIO3PS373.634敵敵畏Dichlorvos62-73-7C4H7c1204P220.985敵百蟲Dipterex52-68-6C4H8c1304P257.443.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制3.3.1 克百威、滅多威、敵敵畏、敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1000pg/mQ:冷藏、避光、干燥條件下保存。3.3.2 丙澳磷標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100科g/m>L：冷藏、避光、干燥條件下保存。3.3.3 克百威、滅多威、敵敵畏、敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)中間液A(100科g/mL:精密移取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1000pg/mL(3.3.1)各1mL,分別置于10mL容量瓶中，用丙酮(3.

5、1.1)稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為100pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液A。3.3.4 克百威、滅多威、敵敵畏、敵百蟲、丙澳磷標(biāo)準(zhǔn)中間液B(1g/mL：精密移取標(biāo)準(zhǔn)中間液A(100g/mL(3.3.3)及丙澳磷標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100科g/mL(3.3.2)各1mL,分別置于100mL容量瓶中，用緩沖溶液(3.1.7)稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1g/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液B。4儀器和設(shè)備8.1 恒溫水浴鍋。8.2 天平：感量為0.1g。8.3 分光光度計或相應(yīng)商品化測定儀。8.4 環(huán)境條件：溫度15C35C,濕度W80%。5分析步驟1.1.3.3 試樣的提?。?.3.（1） 整株提取法選取韭菜、芹菜有代表性的樣品，

6、擦去表面泥土，稱取試樣3g(精確至0.1g)置于表面皿中，加入10mL緩沖?夜(3.1.7),殘缺面不得接觸緩沖液，輕輕振搖50次，靜置2min以上，取上清液備用。（3.3.（1） 整體測定法選取油菜、菠菜有代表性的樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，稱取3g（精確至0.1g）放入離心管中，加入10mL緩沖溶液（3.1.7）,振搖50次，靜置2min以上，倒出提取液，靜置3min5min,待用。1.2.3.3 測定步驟（3.3.（1） 對照液的測定先于反應(yīng)管中加入3mL緩沖溶液（3.1.7）,再加入適量酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37C水浴鍋中放置15min。加入0.1mL底物搖勻

7、，立即測定吸光度，3min后再測定一次，記錄反應(yīng)3min的吸光度值的變化？A0。（3.3.（1） 樣品液的測定先于反應(yīng)管中加入3mL提取液，其他操作與對照液操作（5.2.1）相同，記錄反應(yīng)3min的吸光度值的變化？At。1.3.3.3 質(zhì)控試驗每次測定應(yīng)同時進行空白試驗和加標(biāo)質(zhì)控試驗。（3.3.（1） 空白試驗稱取空白試樣，按照5.1和5.2步驟與樣品同法操作。（3.3.（1） 加標(biāo)質(zhì)控試驗1 韭菜、芹菜加標(biāo)實驗取空白試樣，擦去表面泥土，稱取5份試各3g（精確至0.1g）置于表面皿中，分別加入檢出限水平的有機磷和氨基甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)中間液B（1閔/mL）（3.3.4）,加入10mL緩沖液（3.1.

8、7）,殘缺面不得接觸緩沖液，輕輕振搖50次，靜置2min以上，取上清液備用。其余操作按照5.2步驟同法操作。1 油菜、菠菜加標(biāo)實驗取空白試樣，擦去表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，稱取5份試各3g（精確至0.1g）放入小離心管中，分別加入檢出限水平的有機磷和氨基甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)中間液B（1闈/mL）（3.3.4）,加入10mL緩沖溶液（3.1.7）,振搖50次，靜置2min以上，倒出提取液，靜置3min5min,待用。其余操作按照5.2步驟同法操作。6結(jié)果的表述6.1結(jié)果計算抑制率（）=（?A0-?At）/?A0M00式中：?Ao對照溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值；?At樣品溶液反應(yīng)3min吸光度

9、的變化值；結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。當(dāng)抑制率A50%時，表示蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留高于檢測限，判定為陽性，陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗2次以上。6.3質(zhì)控試驗要求空白試驗測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗測定結(jié)果應(yīng)均為陽性。7結(jié)論當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時，應(yīng)采用其他分析方法進行確證，進一步確定農(nóng)藥品種和含量。8性能指標(biāo)檢測限：敵百蟲0.1mg/kg,丙澳磷0.5mg/kg,滅多威0.2mg/kg,克百威0.02mg/kg,敵敵畏0.2mg/kg。靈敏度：靈敏度應(yīng)>95%特異性：特異性應(yīng)R85%。假陰性率：假陰性率應(yīng)<5%o假陽性率：假陽性率應(yīng)W15%。注：1.性能指標(biāo)計算

10、方法見附錄Ao2.吸光度變化？A0值應(yīng)控制在0.20.3之間。具體的酶量，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品說明書上標(biāo)識的使用量，測定？A0值。根據(jù)測定值，增加或減少酶量，使？A0值控制在0.20.3之間。檢測卡法9原理樣品中的有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留經(jīng)緩沖液提取，有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶（白色藥片）有抑制作用，抑制膽堿酯酶催化靛酚乙酸酯（紅色藥片）水解為乙酸與靛酚（藍(lán)色），從而導(dǎo)致速測卡顏色深淺的變化。通過空白顏色比較，對樣品中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行定性判定。10試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級水。試齊1J丙酮（CH3COCH3）。磷酸氫二鉀（K2

11、HPO4）。磷酸二氫鉀（KH2P。4）。pH8.0緩沖溶液：分別稱取11.9g無水磷酸氫二鉀及3.2g磷酸二氫鉀，溶解于1000mL水中，混勻。參考物質(zhì)同3.2。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制同3.3。固化有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的紙片（檢測卡）。11儀器和設(shè)備恒溫水浴鍋。天平：感量為0.1g。環(huán)境條件：溫度15C35C,濕度W80%。12分析步驟試樣的提取整株提取法選取韭菜、芹菜有代表性的樣品，擦去表面泥土，稱取試樣3g（精確至0.1g）置于表面皿中，加入10mL緩沖3夜（10.1.4）,殘缺面不得接觸緩沖液，輕輕振搖50次，靜置2min以上。整體測定法選取油菜、菠菜有代表性的樣品，擦去表面泥土，剪成1c

12、m左右見方碎片，稱取3g（精確至0.1g）放入小離心管中，加入10mL緩沖溶液（10.1.4）,振搖50次，靜置2min以上。測定步驟吸取2滴左右待測液于白色藥片反應(yīng)區(qū)域，在37C恒溫裝置中放置15min進行預(yù)反應(yīng)，預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤。將速測卡對折，手捏3min或置于37C恒溫裝置3min,保證紅色藥片反應(yīng)區(qū)域與白色藥片反應(yīng)區(qū)域完全疊合發(fā)生反應(yīng)。每次測定需有一個緩沖溶液的空白對照。質(zhì)控試驗每次測定應(yīng)同時進行空白試驗和加標(biāo)質(zhì)控試驗?？瞻自囼灧Q取空白試樣，按照12.1和12.2步驟與樣品同法操作。加標(biāo)質(zhì)控試驗韭菜、芹菜取空白試樣，擦去表面泥土，稱取5份試各3g（精確至0.1g）置于表面

13、皿中，分別加入檢出限水平的有機磷和氨基甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)中間液B（1閔/mL）（3.3.4）,按照12.1和12.2步驟與樣品同法操作。油菜、菠菜選取空白試樣，擦去表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，稱取5份試各3g（精確至0.1g）放入小離心管中，分別加入檢出限水平的有機磷和氨基甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)中間液B（1囚/mL）照12.1和12.2步驟與樣品同法操作。13結(jié)果判定白色藥片區(qū)域不變色或略有淺藍(lán)色為陽性結(jié)果；白色藥片區(qū)域變?yōu)樘焖{(lán)色或與空白對照卡相同，為陰性結(jié)果。通過對比空白和樣品白色藥片區(qū)域的顏色變化進行結(jié)果判定。目視判定示意圖見圖1。1無效白色藥片區(qū)域干燥，表明取樣量偏少，檢測結(jié)果無效。2陰性樣品白色

14、藥片區(qū)域顏色比空白對照卡顏色顏色相當(dāng)或為天藍(lán)色，表明樣品中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留低于方法檢測限，判定為陰性。3陽性樣品白色藥片區(qū)域不變色或略有淺藍(lán)色，表明樣品中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)殘高于檢測限，判定為陽性。圖1目視判定示意圖4質(zhì)控試驗要求空白試驗測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗測定結(jié)果應(yīng)均為陽性。14結(jié)論當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時，應(yīng)采用其他分析方法進行確證，進一步確定農(nóng)藥品種和含量。15性能指標(biāo)檢測限：敵百蟲0.1mg/kg,丙澳磷0.5mg/kg,滅多威0.2mg/kg,克百威0.02mg/kg,敵敵畏0.2mg/kg。靈敏度：靈敏度應(yīng)>95%特異性：特異性應(yīng)R85%。假陰性率：假陰性

15、率應(yīng)<5%o假陽性率：假陽性率應(yīng)W15%。注：性能指標(biāo)計算方法見附錄A16其他蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、菱白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時，采取整株蔬菜浸提。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項性能指標(biāo)。本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為NY/T761-2008蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定。附錄A快速檢測方法性能指標(biāo)計算表表A.1性能指標(biāo)計算方法樣品情況a檢測Z果b總數(shù)陽性陰性陽性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異(自X2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度(df)=1靈敏度(p+,%)p+=N11/N1.特異性(p-,%)p-=N22/N2.假陰f率(pf-,%)pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽T生率(pf+,%)pf+=N21/N2.=100-特異性相對準(zhǔn)確度，%c(N11+N22)/(N1.+N2.)注：a由參比方