酵母菌菌種保藏技術(shù)規(guī)程

1、酵母菌菌種保藏技術(shù)規(guī)程1范圍本規(guī)程規(guī)定了酵母菌菌種保藏的技術(shù)和程序。本規(guī)程適用于酵母菌菌種的保藏。2術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本規(guī)程2.1 定期移植法subculturing亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，待得到健壯的菌體后，于46c進(jìn)行保存并間隔一定時(shí)間進(jìn)行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。2.2 蒸儲(chǔ)水法preservationindistilledwater指將欲保藏的菌種細(xì)胞懸浮于無(wú)菌蒸儲(chǔ)水中，密封后置于46c保存的一種菌種保藏方法。2.3 液體石蠟法preservationinliquidparaffin亦稱礦物油保藏法，定期移植保藏法的輔助方

2、法。指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至待得到健壯的菌體后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個(gè)斜面，再直立放置于低溫（46C）干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。2.4 80C冰箱凍結(jié)法preservationat80C指將菌種懸浮于保護(hù)劑中，在-80c冰箱中凍結(jié)保存的一種長(zhǎng)期菌種保藏方法。2.5 液氮超低溫凍結(jié)法preservationinliquidnitrogen指懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于-196c的液氮或-150c左右的液氮?dú)庀嘀斜４娴囊环N長(zhǎng)期菌種保藏方法。2.6 真空冷凍干燥法freeze-drying指將欲保藏的菌種細(xì)胞或胞子懸浮于保護(hù)劑中，經(jīng)預(yù)凍后在真空條

3、件下使水分升華，再經(jīng)真空封存后保存的一種長(zhǎng)期菌種保存方法。3保藏準(zhǔn)備工作1.1.0 菌種待保藏的酵母菌菌種必須進(jìn)行分離純化，得到純培養(yǎng)后再進(jìn)行保藏。1.2.0 工具、材料接種針或接種環(huán)、吸管、鐐子、75%酒精棉球、酒精燈、試管架、量筒、燒杯、平皿、標(biāo)簽、波美計(jì)等。1.3.0 器皿1 試管選用平口試管，規(guī)格一般為15X150mmo1 安甑管制安甑管的材料應(yīng)為中性玻璃，質(zhì)地軟硬度要適當(dāng)。管的內(nèi)徑為8mm,長(zhǎng)度不小于100mm。1 冷凍管帶螺旋口的塑料冷凍管，其螺旋口分為外螺旋和內(nèi)螺旋兩種，規(guī)格為1.8mL。1.4.0 器皿的清洗菌種保藏工作所用的器皿要求清潔、透明、無(wú)破損、無(wú)裂痕。1 新玻璃器皿的

4、清洗新玻璃器皿表面常含有游離的堿性物質(zhì)，可先用去污粉或洗衣粉洗刷，再用自來(lái)水洗凈。然后浸泡于1%2%的鹽酸溶液中數(shù)小時(shí)，再用自來(lái)水沖洗干凈，最后用蒸儲(chǔ)水沖洗23次，干燥后備用。1 使用過(guò)的玻璃器皿的清洗用過(guò)的玻璃器皿應(yīng)盡快洗滌。先用自來(lái)水洗至無(wú)污物，再用去污粉或洗衣粉刷洗干凈，用自來(lái)水沖干凈后再用蒸儲(chǔ)水洗23次。洗凈的玻璃器皿，不應(yīng)在器壁上帶有水珠，否則表示尚未洗干凈，應(yīng)再按上述方法重新洗滌。沾染微生物的試管，經(jīng)滅菌后倒出內(nèi)容物，將器皿放在熱水中，加適量洗衣粉洗滌，用自來(lái)水沖洗干凈，干燥后備用。附著有油脂、石蠟等有機(jī)物質(zhì)的器皿，采用去污粉擦除、有機(jī)溶劑溶解或洗液浸泡等方法處理后，再按2）項(xiàng)洗滌

5、。1 冷凍管的清洗檢查冷凍管是否滲漏。用0.05%的亞甲基藍(lán)水溶液在4c浸泡3045分鐘，沖洗干凈，棄去含有藍(lán)色染料的冷凍管，其余的冷凍管備用。用蒸儲(chǔ)水將冷凍管漂洗干凈即可。1.5.0 碘液的配制稱取碘（切11g,碘化鉀（KI）22g,用少量蒸儲(chǔ)水使碘溶解，然后定容至500mL,儲(chǔ)存于棕色瓶中，配制成原碘液。吸取原碘液2.00mL,加碘化鉀20g用蒸儲(chǔ)水溶解并定容至500mL,儲(chǔ)存于棕色瓶中。1.6.0 其它高壓滅菌鍋、烘箱、恒溫培養(yǎng)箱、水分測(cè)定儀、普通冰箱、-80c冰箱、液氮罐、冷凍干燥設(shè)備、程控降溫儀、超凈工作臺(tái)或無(wú)菌室等。4保藏方法以下保藏方法除4.2不適合于分解石蠟的酵母菌菌種外，其它

6、方法均適用于所有酵母菌菌種。5.1 定期移植法參見(jiàn)附錄A。5.2 蒸儲(chǔ)水法參見(jiàn)附錄Bo5.3 液體石蠟法參見(jiàn)附錄C。5.4 80C冰箱凍結(jié)法參見(jiàn)附錄Do5.5 液氮超低溫凍結(jié)法參見(jiàn)附錄Eo5.6 真空冷凍干燥法參見(jiàn)W錄F|附錄1定期移植法1斜面的制備酵母菌保藏一般用5oB6麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基或YEPD培養(yǎng)基，其它特殊培養(yǎng)基可另行配制。1 5oB6麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基1.3 稱取一定量的大麥芽粉，加入4倍量溫度為60c的清水，在55c水浴鍋中保溫糖化46小時(shí)，并間歇性攪拌。1.3 用玻璃棒蘸一滴糖化液于白色比色盤內(nèi)與碘液反應(yīng)，碘呈色反應(yīng)為無(wú)色時(shí)糖化完畢。1.3 用紗布過(guò)濾，將濾液煮沸，再用紗布或脫脂棉

7、過(guò)濾，得到澄清的麥芽汁?；蛴谔腔褐屑尤脒m量蛋清（每500g大麥芽粉的糖化液加入一個(gè)雞蛋的蛋清），煮沸，過(guò)濾，也可得到清澈透明的麥芽汁。1.3 用波美計(jì)測(cè)量麥芽汁濃度（一般為810oB,加水稀釋成5oB6的麥芽汁，pH值自然。1.3 按1.5%2%比例加入瓊脂，煮沸使瓊脂溶解，補(bǔ)足所蒸發(fā)水分。1.3 將培養(yǎng)基趁熱分裝，每管分裝量約為試管高度的四分之一（45mL）。分裝過(guò)程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免造成污染。1.3 分裝好的試管加棉塞或橡膠塞，外面包扎一層牛皮紙并注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。1.3 121c蒸汽滅菌1520分鐘。滅菌后及時(shí)擺放斜面，斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管管長(zhǎng)的二分之一為宜。1.

8、3 將斜面放入培養(yǎng)箱中，30c培養(yǎng)13天。1.3 無(wú)菌落長(zhǎng)出后將斜面保存于4Co空白斜面應(yīng)盡快使用1 YEPD培養(yǎng)基1.4 培養(yǎng)基組成酵母提取物10g蛋白陳10g葡錮糖20g自來(lái)水1000mL瓊脂1520gPH值自然：1.2.2配制過(guò)程5 在燒杯中放入約500mL水，按A1.2.1要求稱量各種藥品，依次放入燒杯中溶解，最后補(bǔ)足1000mL。5 按A1.1中5）10）所述制備空白斜面。2接種1 打開(kāi)超凈臺(tái)或無(wú)菌間的紫外燈滅菌2030分鐘。1 關(guān)閉紫外燈，用75%酒精擦拭操作臺(tái)面進(jìn)行消毒。1 點(diǎn)燃酒精燈，用75%酒精擦手進(jìn)行消毒。1 一只手夾住原菌種平板或試管及待轉(zhuǎn)接斜面試管（斜面朝上），另一只手

9、將棉塞從試管口拔出，操作應(yīng)在火焰無(wú)菌區(qū)域進(jìn)行。1 在火焰上將接種針的金屬絲部分燒紅滅菌，然后將要伸入試管部分的針柄也反復(fù)通過(guò)火焰滅菌。1 將接種針?biāo)酵ㄟ^(guò)火焰并插入原菌試管或平皿內(nèi)，先在管壁上或未長(zhǎng)菌體的培養(yǎng)基表面冷卻，然后再用接種針輕輕沾取少量菌體，將接種針自原菌種試管或平皿內(nèi)抽出，抽出時(shí)勿碰管壁，也勿通過(guò)火焰。1 在火焰旁將沾有菌體的接種針迅速伸入待接空白斜面試管內(nèi)，自斜面底部向上劃一直線，使菌體沾附在斜面培養(yǎng)基上。劃線時(shí)盡量不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基表面。1 接完種后將接種針由試管內(nèi)抽出，同時(shí)將試管口在火焰上灼燒一下，塞上棉塞。注意不要用試管口去迎棉塞，以免試管口在移動(dòng)時(shí)造成污染。1 接種針在放回原

10、處前應(yīng)在火焰上徹底滅菌。放下接種針后，再用右手將棉塞進(jìn)一步塞牢，避免脫落。最后將已接種好的斜面試管放在試管架上。1 接種完畢后及時(shí)在試管上標(biāo)明菌株編號(hào)和日期，也可在接種之前標(biāo)明。3培養(yǎng)將接完種的斜面放入培養(yǎng)箱中，2830c條件下進(jìn)行培養(yǎng)3天。特殊菌種可在其最適條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期。4保藏培養(yǎng)好的斜面于46c保存，根據(jù)不同要求每36個(gè)月移植一次。對(duì)于某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，必須13個(gè)月移植一次。保藏濕度用相對(duì)濕度表示，通常為50%70%。微生物菌種保藏期間，要定期檢查菌種存放設(shè)施的溫度和濕度、菌株有無(wú)污染、棉塞有無(wú)霉變，如發(fā)現(xiàn)異常應(yīng)重新移植培養(yǎng)后更換。每株菌種應(yīng)保藏相繼的三

11、代培養(yǎng)物，以便對(duì)照，也可減少因意外和污染造成的損失。5菌種的移植將斜面培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到另一空白斜面上，在適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)。微生物菌種移植過(guò)程，要對(duì)菌株編號(hào)及培養(yǎng)基分別進(jìn)行核對(duì)，避免發(fā)生錯(cuò)誤。微生物菌種移植培養(yǎng)后，應(yīng)與原保藏菌株的培養(yǎng)特征和菌株登記信息對(duì)照，檢查無(wú)誤后再存放。附錄2蒸儲(chǔ)水法1蒸儲(chǔ)水試管的制備每支試管分裝5mL蒸儲(chǔ)水，加棉塞，121c蒸汽滅菌30分鐘。也可選用帶螺旋蓋的試管，滅菌時(shí)不要將蓋旋緊。2制備菌懸液參照附錄A制備斜面培養(yǎng)物。無(wú)菌條件下用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上或純化后的平板培養(yǎng)基上取一環(huán)酵母細(xì)胞移入蒸儲(chǔ)水中，將細(xì)胞打散使其均勻分散在蒸儲(chǔ)水中。用無(wú)菌的橡膠塞代替棉塞塞緊，如用帶螺旋

12、蓋的試管則將螺旋蓋旋緊。3保藏直立放置于46c條件下貯藏。一般可保藏12年。4恢復(fù)培養(yǎng)移接或再培養(yǎng)時(shí)，無(wú)菌條件下用接種環(huán)蘸取保藏菌液移接在新鮮培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)。附錄3液體石蠟保法1液體石蠟預(yù)處理選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟分裝到試管中加塞，用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進(jìn)行滅菌：121c濕熱滅菌30分鐘，置40c恒溫箱中干燥或170c烘箱中蒸發(fā)水分。160c干熱滅菌2小時(shí)。將滅菌的液體石蠟冷卻至室溫備用。2斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄Ao3灌注石蠟將無(wú)菌的液體石蠟在無(wú)菌條件下注入培養(yǎng)好的新鮮斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。為避免加石蠟油時(shí)各菌株間的交叉污染，最好每

13、株菌種用一管液體石蠟油。4保藏注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態(tài)置低溫（46C）干燥處保藏，保藏時(shí)間12年。保藏期間應(yīng)定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充無(wú)菌的液體石蠟。保藏場(chǎng)所應(yīng)保持干燥，避免棉塞生霉。5恢復(fù)培養(yǎng)在移接或再培養(yǎng)時(shí)，挑取少量菌體移接在新鮮麥芽汁瓊脂或其它適宜培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)繁殖后，再重新轉(zhuǎn)接一次。附錄4-80c冰箱凍結(jié)法1安甑管或冷凍管的準(zhǔn)備將安甑管或冷凍管按3.4步驟清洗干凈，晾干。激光打印標(biāo)簽，標(biāo)簽上標(biāo)明菌株編號(hào)和保藏日期，大小約為10N0mm,標(biāo)簽在管內(nèi)的位置應(yīng)距離管底約10mm左右，標(biāo)簽上有字的一面面向管壁。也可直接將菌株編號(hào)和保藏日期直接噴碼在安甑管或冷凍管表面，安甑管

14、表面的噴碼要經(jīng)160c固定20分鐘才能進(jìn)行滅菌。塞好棉塞或旋上蓋子，121c蒸汽滅菌1520分鐘，60c烘干備用。2保護(hù)劑的準(zhǔn)備選用分析純甘油制備保護(hù)劑。用蒸儲(chǔ)水配制10%的甘油溶液作為保護(hù)劑，每支試管分裝5mL,121c蒸汽滅菌1520分鐘。3保藏培養(yǎng)物的準(zhǔn)備斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄A,要求培養(yǎng)至靜止期或成熟期。無(wú)菌條件下將滅過(guò)菌的10%甘油5mL用無(wú)菌吸管注入到培養(yǎng)好的斜面中，用吸管刮取斜面上的菌體，注意不要將培養(yǎng)基刮破。將菌體與保護(hù)劑混勻后用吸管注入到安甑管或冷凍管內(nèi)，每支分裝約0.51mL,菌懸液中細(xì)胞濃度應(yīng)不低于106個(gè)/mL。4保藏將安甑管或冷凍管直接置-80c冰箱中保藏，可保藏2

15、5年。5恢復(fù)培養(yǎng)從冰箱中取出安甑管或冷凍管，立即置于3840c水浴中復(fù)蘇并適當(dāng)快速搖動(dòng)，直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止。安甑管復(fù)蘇所用時(shí)間為4060秒，冷凍管復(fù)蘇所用時(shí)間為60120秒。用70%酒精棉球?qū)碴倒芑蚶鋬龉懿潦酶蓛?，無(wú)菌條件下打開(kāi)，將菌懸液轉(zhuǎn)移至麥芽汁或其它適宜培養(yǎng)基上，2830C或在其適宜溫度下培養(yǎng)。附錄5液氮超低溫凍結(jié)法1安甑管或冷凍管的準(zhǔn)備將1.8mL冷凍管洗凈，晾干。激光打印標(biāo)簽，標(biāo)簽上標(biāo)明菌株編號(hào)和保藏日期，大小約為10N0mm,標(biāo)簽在管內(nèi)的位置應(yīng)距離管底約10mm左右，標(biāo)簽上有字的一面面向管壁。也可直接將菌株編號(hào)和保藏日期直接噴碼在冷凍管表面。塞好棉塞或旋上蓋子，121c蒸汽

16、滅菌1520分鐘，60c烘干備用。2保護(hù)劑的準(zhǔn)備選用分析純甘油制備保護(hù)劑。用蒸儲(chǔ)水配制10%的甘油溶液作為保護(hù)劑，每支試管分裝5mL,121c蒸汽滅菌1520分鐘。3保藏培養(yǎng)物的準(zhǔn)備斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄A,要求培養(yǎng)至靜止期或成熟期。無(wú)菌條件下將滅過(guò)菌的10%甘油5mL用無(wú)菌吸管注入到培養(yǎng)好的斜面中，用吸管刮取斜面上的菌體，注意不要將培養(yǎng)基刮破。將菌體與保護(hù)劑混勻后用吸管注入到冷凍管內(nèi)，每支分裝約1mL,菌懸液中細(xì)胞濃度應(yīng)不低于106個(gè)/mL。將冷凍管蓋子旋緊后放入凍結(jié)器內(nèi)。4預(yù)凍可采用以下兩種方式進(jìn)行預(yù)凍：將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4C,再將盛有保藏物的冷凍管放入其中，以每分鐘1C的降溫速率使溫度

17、降至-35Co將冷凍管置20C至40C冰箱中冷凍，12小時(shí)取出放入液氮罐中快速冷凍，這樣冷凍速率大約每分鐘下降11.5Co5保藏立即將預(yù)凍后的冷凍管轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲(chǔ)存器中，置于液態(tài)氮的氣相或液相保藏。一般氣相中溫度為-150C,液相中溫度為196C。用此法可保藏酵母菌58年。6恢復(fù)培養(yǎng)將冷凍管立即放置3840c水浴中復(fù)蘇并適當(dāng)快速搖動(dòng)，直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，整個(gè)復(fù)蘇過(guò)程約需50100秒。用75%酒精棉擦拭冷凍管。將冷凍管蓋子旋開(kāi)，無(wú)菌條件下將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至麥芽汁或其它適宜培養(yǎng)基上，2830c或適溫下培養(yǎng)。7注意事項(xiàng)操作時(shí)要注意安全，帶防護(hù)面罩和手套，防止凍傷。冷凍管于液相中存放時(shí)一定要擰

18、緊螺帽。運(yùn)送液氮時(shí)要用專用特制的容器，絕不可用密閉容器存放或運(yùn)輸液氮，切勿使用保溫瓶存放液氮。注意存放液氮容器的室內(nèi)通風(fēng)，防止過(guò)量氮?dú)馐谷酥舷?。防止冷凍管破裂爆炸，如液氮滲入管內(nèi)，當(dāng)從液氮容器取出時(shí)，液態(tài)氮體積膨脹約680倍，爆炸力很大，要特別小心。注意觀察液氮容器中液氮的殘存量，定期補(bǔ)充液氮。附錄6真空冷凍干燥法1安甑管的準(zhǔn)備清洗選用中性玻璃材質(zhì)的安甑管。先用2%鹽酸浸泡810小時(shí)，自來(lái)水沖洗至pH值為中性，再用蒸儲(chǔ)水洗23次,置烘箱中烘干備用。標(biāo)簽激光打印機(jī)打印標(biāo)簽，標(biāo)簽上標(biāo)明菌株編號(hào)和保藏日期，大小約為10X20mm,標(biāo)簽可插入管內(nèi)或貼于管外，也可直接噴碼在安甑管表面，位置應(yīng)距離管底約5

19、mm左右，噴碼要經(jīng)160c固定20分鐘才能進(jìn)行滅菌。滅菌塞好棉塞，將同一菌號(hào)的安甑管包在一起，121c滅菌30分鐘，備用。2保護(hù)劑的準(zhǔn)備蒸儲(chǔ)水配制12%脫脂牛奶作為保護(hù)劑，每支試管分裝25mL,加塞，再包一層牛皮紙捆好。滅菌鍋加熱至水沸騰，再將包好的試管放入滅菌鍋內(nèi)，113c蒸汽滅菌20分鐘。打開(kāi)放氣閥緩慢排出蒸汽，氣壓降到0時(shí)打開(kāi)滅菌鍋，取出滅完菌的脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻。冷卻后的脫脂牛奶試管于30c培養(yǎng)2天，經(jīng)無(wú)菌檢查合格后備用。3凍干樣品的制備斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄A,要求培養(yǎng)至成熟期或穩(wěn)定期。無(wú)菌條件下將12%的脫脂牛奶用無(wú)菌吸管注入到培養(yǎng)好的斜面中，用吸管刮取斜面上的菌體

20、，使菌體均勻地懸浮在保護(hù)劑內(nèi)，注意勿將培養(yǎng)基刮破，也不可使菌懸液產(chǎn)生較多的氣泡，菌懸液中細(xì)胞濃度應(yīng)不低于106個(gè)/mL。用長(zhǎng)的無(wú)菌毛細(xì)滴管將菌懸液分裝到無(wú)菌的安甑管內(nèi)，每支分裝0.10.2mL。操作時(shí)要把帶有菌懸液的長(zhǎng)毛細(xì)滴管直接插入安甑管的底部，勿使菌液沾在管壁上。4預(yù)凍從制備菌懸液開(kāi)始，經(jīng)分裝到進(jìn)行預(yù)凍之間的時(shí)間不宜超過(guò)1小時(shí)?？刹捎靡韵聨追N方式預(yù)凍：分裝完成后將安甑管立刻放入-35-40C冰箱預(yù)凍1小時(shí)，使菌液完全凍結(jié)?？刹捎梅侄问筋A(yù)凍，先將分裝好的安甑管置-20c凍30分鐘，再放入-80c冰箱凍30分鐘。采用離心式凍干裝置時(shí)勿需預(yù)凍。5真空干燥預(yù)凍后將安甑管放入真空箱中，開(kāi)動(dòng)真空泵進(jìn)行

21、干燥。采用無(wú)制冷設(shè)備的凍干裝置，在開(kāi)動(dòng)真空泵后應(yīng)使真空度在15分鐘內(nèi)達(dá)到66.5Pa,隨后逐漸達(dá)到26.613.3Pa,在此條件下，樣品將保持凍結(jié)狀態(tài)，其中水分則不斷升華，干燥才能順利地進(jìn)行。采用離心式凍干裝置，在安甑管放于離心架上后，先開(kāi)動(dòng)離心機(jī)，再開(kāi)動(dòng)真空泵。當(dāng)樣品基本干燥后，真空度將達(dá)到2.674Pa,此時(shí)如凍干裝置具有后干燥設(shè)備，則打開(kāi)油擴(kuò)泵，使樣品進(jìn)一步干燥12小時(shí)。使用具有溫度控制設(shè)備的凍干裝置，在凍干過(guò)程中當(dāng)真空度達(dá)到26.6Pa時(shí)，樣品中水分大量升華，這時(shí)可以開(kāi)始加溫，以便加速樣品中水分升華。終止干燥時(shí)間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：安甑管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀真空度接近空載時(shí)的最高值樣品溫度與管外溫度接近選用12支對(duì)照管，其水份與菌懸液同量，當(dāng)其水分完全蒸發(fā)時(shí)視為干燥完結(jié)選用一個(gè)安甑管，裝1%2%氯化鉆，如變深蘭