生物工程方向?qū)嶒炗H和層析純化胰蛋白酶

1、生物工程方向?qū)嶒炗H和層析純化胰蛋白酶一、引言前面我們所學(xué)的凝膠過濾法、離子交換法以及電泳等一系列分離純化生物大的，比起早期采用的鹽析法，這些方法中，或是利用生物大及等電點沉淀法等，分離效果要好得多。但是，在一定條件下不同的溶解度、電荷分布、總電荷的不同，或是依據(jù)其的大小和形狀的不同。一句話，多是利用生物間物理和化學(xué)性質(zhì)的差異來進(jìn)行分離純化的。由于這些方法的特異性比較低，加之待分離物質(zhì)之間的物化性質(zhì)差異較小，常常要綜合不同的分離方法。經(jīng)過許多步驟才能使生物達(dá)到一定的純度。這樣既費時間，又費試劑，有時最后還不能令人滿意。另外 ，有些生物大，往往在生物組織或發(fā)酵液中的含量很低，相對地說雜質(zhì)很多，特別

2、是一些具有生物活性的，往往由于分離純化的步驟很多，時間過長，造成破壞以致失活，產(chǎn)率很低。這就促使人們?nèi)で笮碌姆椒▉斫鉀Q存在的問題。親和層析法是近十多年來迅速地發(fā)展并廣泛被采用來分離純化生物大的一種十分有效的方法。它具有分離快速，純化效率高。特別是對于那些含量少，雜質(zhì)多，采用常規(guī)方法難于分離的生物活性，顯示了獨特的優(yōu)越性。有時一次被分離物質(zhì)的純度可提高幾倍，十幾倍甚至幾百倍。因此，親和層析技術(shù)已成為純化生物化生物活性物質(zhì)最重要的方法之一。二、實驗?zāi)康呐c要求，特別是純1. 理解親和層析法的基本原理，并通過實驗?zāi)艹醪秸莆辗椒ǎ?. 理解和掌握親和層析實驗操作技術(shù)；3. 學(xué)會一種測定蛋白水解酶活力及

3、比活的方法。三、基本原理一種親和吸附劑的操作簡言之，親和層析主要是根據(jù)生物與其特定的固相化的配基或配體之間具有一定的親和力而使生物法。得以分離。這是由一種典型的吸附層析發(fā)展而來的分離純化方許多生物都有一種獨特的生物學(xué)功能。即它們都具有能和某些相對應(yīng)的專一分子可逆地結(jié)合的特性（間通過某些次級鍵結(jié)合，如范德華力，疏水力，氫鍵等，在一定條件下又可解離）。如：酶和底物（包括酶的抑制劑、產(chǎn)物、輔酶及其底物的類似物）的結(jié)合。特異性的抗體一抗原（包括、細(xì)胞）、激素與其受體、載體蛋白，與其互補(bǔ) DNA、mRNA 及阻遏蛋白的結(jié)合，植物凝集素與淋巴細(xì)胞表面抗原及某些多糖的結(jié)合等。均屬于專一性而可逆的結(jié)合。這種之

4、間的結(jié)合能力叫做親和力。親和層析正是利用生物間所具有的專一親和力而設(shè)計的層析技術(shù)。所以有人稱為“生物專一吸附技術(shù)”或“功能層析技術(shù)”。在實際工作中，只要把被識別的，稱為配基（Ligand），在不損害其生物學(xué)功能的條件下共價結(jié)合到水不溶性載體或基質(zhì)上（Matrix, 如 Sepharose 4B）制成親和吸附劑，1然后裝柱。再把含有要分離純化的物質(zhì)的混合液通過這個柱子，這時絕大部分對配基沒有親和力的化合物均順利地流過層析柱而不滯留，只有與配基互補(bǔ)的化合物被吸附留在柱內(nèi)。當(dāng)所有的雜質(zhì)從柱上流走后，再改變洗脫條件，使結(jié)合在配基上的物質(zhì)解離下來。這樣，原來混合液中被分離的物質(zhì)便以高度純化的形式在洗脫液

5、中出現(xiàn)。本實驗為了純化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制劑雞卵粘蛋白作為配基制成親和吸附劑，從胰臟粗提取液中純化胰蛋白酶。雞卵粘蛋白是專一性較高的胰蛋白酶抑制劑，對牛和豬的胰蛋白酶有相當(dāng)強(qiáng)的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在 pH = 78 的緩沖溶液中卵粘蛋白與胰蛋白酶牢固地結(jié)合，而在 pH =23 時，又能被解離下來。因此，采用雞卵粘蛋白作成的親和吸附劑可以從胰臟粗提液中通過一次親和層析直接獲得活力大于 10,000 BAEE便得多。純化效率可達(dá)到 10 20四、試劑與器材/ 毫克蛋白 胰蛋白酶制品，比用經(jīng)典分離純化方法簡倍以上。主要試劑：烷 TrisCaCl2三氯乙酸HClNaOHNaClH2

6、SO4Na2CO3 氯代環(huán)氧丙KClSepharose-4B. 新鮮豬胰臟雞蛋清乙酸 二氧六環(huán)每組需配溶液：1、親和層析柱平衡液 1000ml：0.1mol/L pH = 8.0 Tris -HCl Buffer ,含 0.5mol/LKCl 、0.05mol/L CaCl2 。（配 1000ml：12.1g Tris，37.5g KCl，5.6g Cacl2 先將 tris 和 KCl 溶解后， 調(diào) pH8.0，再加入 CaCl2）2、親和柱解吸液 1000ml：0.1mol/L 甲酸0.5 mol/L KCl pH = 2.5 。（配 1000ml：37.5g KCl，4.35ml 甲酸）

7、。3、Sepharose 4B 膠液：A、0.5mol/L NaCl 300ml.B、0.2mol/L Na2CO3 緩沖液，pH = 9.5, 200ml.4、乙酸酸化水：200mL 蒸餾水，加乙酸調(diào) pH 到 4.0全班共用溶液：1、10%pH1.0 三氯乙酸 500ml. （配制三氯乙酸：稱取 50 克三氯乙酸，用 400 ml 蒸餾水溶解，再用 5mol/L NaOH 調(diào) pH = 1.0 左右，最后加蒸餾水至 500ml。）2、酶活性測定所需溶液：A、0.05 mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer 含 0.2% Cacl2 1000ml（配 1000ml：6.

8、05g Tris 水溶后，先用 4mol/L HCl 調(diào) pH 為 8.0，然后方可加 2g Cacl2 ）。B、0.001M HCl 500ml.C、BAEE 底物緩沖液 500ml：340mg BAEE溶于 500ml 0.05 mol/L pH = 8.0 Tris-HCl buffer 中，臨用前配制，冰箱內(nèi)可保存 3 天。3、調(diào)整 pH 用：A、5mol/L NaOH 200ml. B、5mol/L HCl 200ml.C、2.5mol/L H2SO4 200ml.4、Sepharose 4B 活化所需溶液：2A、2mol/L NaOH 100ml.B、56%二氧六環(huán) 200ml.主

9、要器材：恒溫水浴，溫度計，G2漏斗，抽濾瓶，布氏漏斗，離心杯（50ml），透析袋，層析柱（1×15cm），秒表，移液管，貯液瓶（1 升），電磁攪拌器，pH 計，紫外分光光度計，紗布，勻漿器，pH 試紙。五、實驗操作步驟（一）雞卵粘蛋白的分離及純化1. 雞卵粘蛋白（Ovomucoid）的一些性質(zhì):Ovomucoid 是一種糖蛋白，在中性及偏酸性溶液中對熱及高濃度脲、均有較高的耐受性。但在較酸、堿條件下，易引起變性。 Ovomucoid 帶有四種糖，此有較強(qiáng)的吸水性。在 50%或 5%三氯乙酸鹽的水溶液中，仍有較好的溶解度。所以，選擇合適的 pH，濃度和三氯乙酸鹽的濃度，可以從蛋清中除去

10、大量的非卵粘蛋白。由于Ovomucoid 所帶的糖基不泳行為呈現(xiàn)出不均一性，等電點在 3.9 4.5之間并呈現(xiàn)出四條電泳條帶，但它們在生物學(xué)功能上差異不大，在氨基酸組成上幾乎無差異，量約為 28,000。每 1 摩爾的卵粘蛋白能抑制 1 摩爾的胰蛋白酶。所以每毫克高純度的卵粘蛋白能抑制約 0.84 毫克的胰蛋白酶。Ovomucoid 在 280nm 處的百分消光系數(shù) A1%1cm 280 = 4.13. ， 即蛋白質(zhì)濃度為 1mg/ml 時,溶液的吸光度 A280 = 0.413 ，據(jù)此可以測定其溶液中蛋白質(zhì)的含量。2. Ovomucoid 的分離及粗品：1. 取 1 只雞蛋，得蛋清約 30

11、ml ，將其溫?zé)嶂?25左右，加入等體積 10 % pH = 1.0的三氯乙酸溶液，這時出現(xiàn)大量白色沉淀。2. 充分?jǐn)噭蚝螅瑴y定溶液的pH 值，用5M HCl 或5mol/L NaOH 溶液調(diào)pH = 3.5±0.2 ， 注意在調(diào) pH 值時，要嚴(yán)防局部過酸或過堿。3. 25放置 4 小時或過夜。4. 次日用 40006000 轉(zhuǎn)/分 離心 20 分鐘，收集清液，再用三層紗布過濾并檢查濾液的 pH 值是否仍為 3.5±0.2，若不是，則要調(diào)回到此范圍內(nèi)。5.將清液放冰浴冷卻至 0，緩緩加入 3 倍體積預(yù)先冷卻的，用棒攪拌均勻并用薄膜蓋好防止揮冰箱或冰浴中 3 4 小時6.

12、離心（ 3000 轉(zhuǎn)/ 分，15 20 分鐘）收集沉淀（清液留待回收）。將沉淀抽真空去凈，得到粗的卵粘蛋白。7. 將粗卵粘蛋白用 20 ml 左右蒸餾水溶解。（若溶解后的溶液渾濁，可用濾紙過濾或離心去掉不溶物）。取上清裝透析袋，并對蒸餾水透析過夜去除三氯乙酸8、將透析液精確調(diào)溶液 pH = 4.0 4.5，加入 3 倍體積預(yù)冷的沉淀，放冰箱或冰浴 3 4 小時，然后離心（3000 轉(zhuǎn)/ 分，15 20 分鐘）收集沉淀（清液回收）得雞卵3粘蛋白（二）親和吸附劑的目前有多種方法活化載體和偶聯(lián)配基化載體與偶聯(lián)配基。親和吸附劑。本實驗采用氯代環(huán)氧丙烷活1. 載體 Sepharose 4B 的活化 -

13、氯代環(huán)氧丙烷活化. 二氧六環(huán)溶劑活化1. 將合適大小圓形濾紙置于布氏漏斗中，以蒸餾水潤濕，開真空泵使之充分貼附后，取 10ml 沉淀體積的 Sepharose 4B 于漏斗中，抽濾成半干，先用約 100 ml. 0.5mol/L NaCl 溶液淋洗，再用 100150ml 蒸餾水洗滌，以除去其中的保護(hù)劑和防腐劑。抽干約得6 克半干濾餅。2. 將濾餅置于 50ml 三角瓶中，加入 6.5 ml 2mol/L NaOH，2ml 氯代環(huán)氧丙烷及 15ml 56%二氧六環(huán)，并置于 40溫和攪拌 2 小時。3、將膠轉(zhuǎn)移到布氏漏斗中抽濾洗滌，先以蒸餾水淋洗除去多余的試劑，再用約 100ml0.2mol/L

14、 Na2CO3 pH = 9.5 緩沖液洗滌，最后將膠轉(zhuǎn)入三角瓶中，接著盡快進(jìn)行偶聯(lián)實驗。2. 雞卵粘蛋白與活化的載體 Sepharose-4B 偶聯(lián)1. 將已活化好的 Sepharose-4B 轉(zhuǎn)移到三角瓶中。2. 用 10ml 0.2mol/LNa2CO3, pH = 9.5 緩沖液將上述好的卵粘蛋白溶解（或0.1mol/L NaOH 10ml 溶解），取出 0.1ml 溶液稀釋 30 倍，用紫外分光光度計測定卵粘蛋白的含量。剩余的溶液全部轉(zhuǎn)移到三角瓶中與活化好的 Sepharose 4B 偶聯(lián)。在 40恒溫?fù)u床振蕩 24 小時左右。3. 偶聯(lián)終止后，將凝膠倒入布氏漏斗中抽干并用 100m

15、l 0.5mol/L NaCl 溶液洗去未偶聯(lián)上的蛋白（收集濾液，測定濾液體積，測蛋白含量及總活力，以計算偶聯(lián)率）, 再用100ml 蒸餾水淋洗。接著用親和洗脫液（ 0.1mol/L 甲酸0.5mol/L KClpH = 2.5）50ml洗一次。最后用蒸餾水洗至中性，抽干后，將膠轉(zhuǎn)移至三角瓶中，浸泡于親和柱平衡液 0.05 mol/L CaCl2 0.1mol/L pH = 8.0 Tris -HCl 緩沖液中（浸沒即可），放冰箱待用。環(huán)氧氯丙烷活化載體與蛋白質(zhì)配基的偶聯(lián)反應(yīng)式及親和層析示意圖如下：4（三）親和層析分離純化胰蛋白酶1. 粗胰蛋白酶的取 100g 新鮮冰凍豬胰臟，剝?nèi)ブ炯敖Y(jié)締組

16、織后在勻漿中攪碎，加入約 200ml,預(yù)冷的乙酸酸化水（pH = 4.0）, 810條件下, 攪拌提取 45 小時 ，然后四層紗布擠濾收集濾液，用 2.5mol/L H2SO4 調(diào) pH = 2.5.3.0，放置 12 小時（靜置期間要檢查一下 pH 值，應(yīng)始終保持 pH = 2.53.0）,最后用濾紙過濾，收集濾液得胰蛋白酶粗提液，取 2ml 胰蛋白酶粗提液測定激活前的蛋白含量及酶活性。2. 胰蛋白酶原的激活：將濾液用 5mol/L NaOH 調(diào) pH = 8.0，加固體 CaCl2 ，使溶液中 Ca²+的終濃度達(dá)到0.1mol/L。然后加入 2 5mg 結(jié)晶胰蛋白酶進(jìn)行激活 ，于

17、室溫下，20 25左右激活 2 4 小時（或 5冰箱放置 1820 小時進(jìn)行激活）即可完成。用 2.5mol/L H2SO4 調(diào)至 pH = 2.5 3.0, 濾去 CaSO4 沉淀物，濾液放冰箱內(nèi)備用。3. 親和層析純化胰蛋白酶：（1） 裝柱：取一支層析柱，檢查是否漏液，先充滿親和柱平衡液（0.1mol/L pH = 8.0,含 0.05mol/L CaCl2 的Tris - HCl 溶液），安上裝柱漏斗。然后將親和吸附劑輕輕攪勻，緩緩加入漏斗內(nèi)，待其自然沉降均勻后，卸下漏斗，安上進(jìn)樣管并連接至恒流泵，泵入親和柱平衡液平衡，調(diào)節(jié)流速 5ml / 2min 左右,（注意柱床不可干涸），檢測流出

18、液至 A280 值小于 0.02 .（2） 上樣：將胰蛋白酶粗提液用 5mol/L NaOH 調(diào)至 pH = 8.0,（若有沉淀，過濾去除之）。取一定體積上述澄清溶液上柱吸附。上樣體積可大致計算如下：W ´ 0.84 ´1.3 ´104´1.5胰蛋白酶上樣體積（ml）=C ´ A式中： W：是卵粘蛋白偶聯(lián)的總 mg 數(shù)；50.84：是 1mg 卵粘蛋白能抑制約 0.84mg 胰蛋白酶；1.3×104 ：是純化后胰蛋白酶比活的近似值； C：是胰蛋白酶粗提液的濃度（mg/ml）； A：是胰蛋白酶粗提液的比活（BAEE/mg）； 1.5：是

19、上樣量過量 50% 。吸附畢，先用平衡液洗滌，至流出液 A280<0.02。換洗脫液洗脫。（3）洗脫及收集胰蛋白酶：用 0.1mol/L 甲酸0.5mol/L KCl pH = 2.5 洗脫液進(jìn)行洗脫。洗脫速度約 5ml / 2min.，將流出洗脫液分管搜集，每管 5mL 左右，并測定其紫外吸收.將有紫外吸收峰的洗脫液搜集合并，測定其總體積，蛋白含量、酶的比活力及總活力。洗脫至流出液 A280<0.02，層析結(jié)束，測定層析柱床體積。親和層析柱用平衡緩沖液平衡后可再次作親和層析。若柱內(nèi)加入防腐劑 0.01% 疊氮化鈉 NaN3 在冰箱中保存，至少一年內(nèi)活性不喪失。最后可用兩種方法將純

20、化的胰蛋白酶制成固體保存：（1） 將比活力最高部分用固體(NH4)2SO4 以 0.8 飽和度鹽析，放置 4 小時以上，抽濾收集硫酸銨沉淀（要抽干）。濾餅先用少量蒸餾水溶解，再加入 1/4 體積 0.8mol/L pH = 9.0 的硼酸溶液，冰箱中放置, 數(shù)日后即可獲得棒狀結(jié)晶。（注：只有胰蛋白酶的量較多時， 才能得到結(jié)晶品）。（2） 將親和層析獲得的胰蛋白酶溶液放入透析袋內(nèi)，在 4對蒸餾水透析，然后冷凍干燥成干粉。胰蛋白酶在親和柱上的分離曲線六、實驗結(jié)果處理1. 繪制親和柱層析洗脫曲線。2. 計算雞卵粘蛋白的比活力。63.4.5.計算雞白的偶聯(lián)量。繪制酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線（求初速度）。計算親

21、和層析純化胰蛋白酶的比活力及純化效率。最后將親和層析過程中的各項數(shù)據(jù)詳細(xì)列入下表中。親和層析實驗數(shù)據(jù)附錄一： 酶活力的測定1. 胰蛋白酶活力的測定：本實驗以苯甲酰 L精氨酸乙酯（英文縮寫為BAEE）為底物，用紫外吸收法進(jìn)定。方法如下：取 2 個光程為 1 厘米的帶蓋石英比色杯，先在一只杯中加入 25預(yù)熱過的 2.0ml 緩沖液（0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer,含 0.2%CaCl2）。0.2ml 0.001mol/L HCl，然后再加 0.8ml BAEE-0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer（含 0.2%CaCl2 和 1

22、mmol/L BAEE）作為空白，校正儀器的 253nm 處光吸收零點。再在另一比色杯中加入 2.0ml 緩沖液和 0.8mlBAEE 溶液，再加入 0.2ml 待測酶液，立即混勻并記時（。每半分鐘讀數(shù)一次，共讀 34分鐘。若DA253/min>0.400，則酶液應(yīng)當(dāng)稀釋或減量，為宜。DA253/min 在 0.05 0.100 左右繪制酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線，從曲線上求出反應(yīng)起始點吸光度隨時間的變化率（即初速度）DA253/min。胰蛋白酶活力的定義規(guī)定為：以 BAEE 為底物，反應(yīng)液 pH8.0，25，反應(yīng)體積3.0ml，光徑 1 厘米的條件下，測定DA253，每分鐘使DA253 增加

23、0.001，反應(yīng)液中所加入的酶量為一 BAEE所以：。7參數(shù)數(shù)據(jù)親和柱床體積（ml）洗脫的胰蛋白酶溶液體積 ( ml )洗脫的胰蛋白酶溶液吸光值 A280洗脫的胰蛋白酶溶液蛋白濃度 ( mg / ml )親和柱吸附率 ( mg / ml 凝膠)親和柱洗脫酶液活力 ( u / ml )親和柱洗脫酶液比活力 ( u / mg )上柱前樣品比活力 ( u / mg )親和柱純化效率（倍數(shù)）DA253(min)0.001 ´ 酶液加入體積´ 稀釋倍數(shù)胰蛋白酶溶液的活力（BAEE/ ml）酶液活力胰蛋白酶比活力（BAEE/ mg ）胰酶濃度(mgml)2. 卵粘蛋白抑制活性的測定的定

24、義：抑制一個胰蛋白酶活力（BAEE胰蛋白酶抑制活力）所需卵粘蛋白的量，定為抑制劑的一個活力（英文縮寫為 BAEETIu）。具體測定方法如下：首先以底物（不加酶）于 253nm 處校正儀器光吸收零點 （操作如上述）；再測定標(biāo)準(zhǔn)酶的活力（操作如上述）；測定加入抑制劑后剩余酶活力；在比色杯中加入 0.2ml 標(biāo)準(zhǔn)酶液再加入適量的抑制劑（一般不能超過標(biāo)準(zhǔn)酶含量，以 1：2 左右為宜，具體視抑制劑的純度而定），再加入 2.0ml 0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl 緩沖液，搖勻后于 25放置 2 分鐘以上，讓酶與抑制劑充分結(jié)合。最后加入 0.8ml 底物（BAEE溶液），搖勻立即記時

25、，測定 A253 的變化。計算剩余酶活力按下面方程計算出抑制劑的抑制活力和抑制比活力：。DA0DAi ´ Ni抑制劑溶液的抑制活力 Iu（BAEE 抑制/ml）0.001ViIu（ BAEET Iu / mg抑制比活力 ）加入抑制劑蛋白濃度(mgml)式中：DA0：未加抑制劑時，酶每分鐘DA253 增加值DAi.：加入抑制劑后，酶每分鐘DA253 的增加值N i：抑制劑溶液的稀釋倍數(shù)V i：測定時加入抑制劑的體積。附錄二：豬胰蛋白和卵粘蛋白濃度的計算1. 豬胰蛋白酶濃度（mg/ml）= A280 ×( 1 / 1.35 ) ×稀釋倍數(shù)2. 雞卵粘蛋白濃度（mg/m

26、l）= A280 ×( 1 / 0.413 ) ×稀釋倍數(shù)8附錄三：活性測定加樣順序參照表注：測定胰酶活性時，酶的用量約 5 10 mg 。 測雞卵粘蛋白抑制活性時，用標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶。前幾種溶液先反應(yīng) 2min 后再加 BAEE。附錄四： 實驗安排：第一天：蛋清+等體積三氯乙酸沉淀去除雜蛋白，調(diào) pH 至 3.5±0.2，放置過夜；第二天：離心，上清加三倍體積預(yù)冷透析過夜；，放 3 小時，離心，沉淀用 20ml 蒸餾水溶解后第三天：透析液調(diào) pH 到 4.0-4.5，加三倍體積預(yù)冷沉淀 3 小時，離心收集沉淀；同時處理 Sepharose 4B，活化 2 小時后，偶聯(lián)（沉淀用 10ml 0.2mol/L Na2CO3 緩沖液 pH = 9.5 溶解后，與活化了的 Sepharose 4B 偶聯(lián)，注意偶聯(lián)前留 0.1ml 雞卵粘蛋白溶液測定濃度用）。提取豬胰蛋白酶，調(diào)整 pH2.5-3.0，放置 1 小時，過濾。第四天：調(diào)整 pH8，加鈣，留 2ml 粗提液測比活用，激活 2-4 小時，中間等待時間可以配溶液，洗滌偶聯(lián)好的 Sepharose 4B，測定洗滌液及昨天留下的雞卵粘蛋白