內質網內的泛素化機制

1、內質網內的泛素化機制當蛋白質經過內質網（endoplasmic reticulum，ER）的時候，會有一套“質控”系統(tǒng)暫時將那些新合成的蛋白質“扣留”下來，幫助它們成熟。只有折疊正確的蛋白質才會被“釋放”，而那些不能成熟的蛋白質則會被繼續(xù)“關押”，但是這樣會損害內質網的功能。因此，為了維持內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，蛋白質質控系統(tǒng)會將這些“不合格產品”移交到胞質溶膠當中，在那里，被蛋白酶體降解掉。隨著在越來越多的病理過程當中發(fā)現了內質網質控系統(tǒng)功能缺陷的現象，我們也開始逐漸意識到細胞內這條作用機制的重要性。在所有人類基因組編碼的蛋白質當中，大約有20%的蛋白質被認為是分泌性蛋白質。這些分泌性蛋白質在到達它們

2、的最終的目的地之前都需要先經過內質網的處理，這些目的地廣泛分布在細胞各處，例如細胞膜上，各種胞內或胞外的腔室（Exocytotic and endocytotic compartments），以及細胞外表面等等。內質網不僅僅只是提供了一個“容器”，它同時還提供了眾多的分子伴侶，幫助蛋白質折疊、成熟。不過雖然細胞提供了這些幫助，蛋白質在合成過程當中仍然非常容易出錯。大約有1/3的新生蛋白質會在翻譯過程中或者在翻譯后數分鐘之內被降解掉。這些蛋白質是因為在轉錄過程、翻譯過程、成熟過程或折疊過程中出現了某些錯誤，或者各個亞基之間的合成不平衡，從而不能形成正確的構象而被降解的。即使是成熟的蛋白質也會因為

3、各種諸如高能輻射、化學損傷、代謝產物等等環(huán)境因素而被損傷。這些損傷蛋白會聚集在一起，也會出現功能障礙，這都會影響到內質網以及細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。因此，進化機制賦予了內質網控制蛋白質質量的功能，這套質控系統(tǒng)可以在好幾個層面對蛋白質進行監(jiān)控，維持內質網的完好性。在蛋白質剛剛合成時它們會通過一個特異性的N連接聚糖（N-linked glycan structure）結構被保護起來，可以免遭降解。隨后，那些可能發(fā)生錯誤折疊的蛋白質會被內質網中甘露糖苷酶（mannosidase）生成的一種“聚糖密碼（glycan code）”所標記（圖1）。然后，錨定在內質網膜上的泛素連接酶會破譯該“密碼”，需要被降解的

4、蛋白質被轉運出內質網，經由泛素化途徑被26S蛋白酶體降解掉，該過程也被稱為內質網相關的降解途徑（ER-associated degradation，ERAD）。發(fā)生錯誤折疊的蛋白質并不是唯一一個進入ERAD系統(tǒng)的底物，ERAD系統(tǒng)還可以調控甾醇合成途徑，它可以在甾醇過多的情況下降解掉甾醇合成途徑中的限速酶，以此來控制合成速度。圖1 蛋白質在內質網內的降解途徑。錯誤折疊的蛋白質在內質網內被降解掉需要以下幾個步驟。首先（步驟1），附著在內質網膜上的泛素連接酶與其他輔助因子一起識別出折疊錯誤的蛋白質。然后在步驟2所示的錯位階段，蛋白質經由一目前尚不清楚的通道被轉運進入胞質溶膠之中。步驟3中，在內質網

5、的胞質溶膠面，底物蛋白被E3泛素連接酶泛素化修飾。最后在步驟4中，在AAA+ ATP酶和Cdc48蛋白的作用下，底物蛋白從膜上被去除掉，進入26S蛋白酶體，被降解處理?？蒲腥藛T們最開始借助生化技術和遺傳篩選的方法發(fā)現了一批ERAD系統(tǒng)的組成單位。不過現在，由于發(fā)現了細胞對發(fā)生折疊錯誤的糖蛋白進行降解的途徑，大家的目光又都投向了ERAD系統(tǒng)的功能研究方向。在本文中我們將介紹內質網蛋白質控系統(tǒng)是如何能夠選擇、處理出錯的蛋白質，但同時又不會降解掉新生蛋白的機制。因為ERAD途徑似乎是非常保守的一條途徑，可見于從酵母細胞到哺乳動物細胞等種類眾多的真核生物細胞，因此我們選擇釀酒酵母（Saccharomy

6、ces cerevisiae）作為研究對象，來研究其中的機制，同時這也豐富了我們的知識，又進一步擴展了研究范圍（以往只對哺乳動物進行過這方面的研究）。在圖2中，我們給出了酵母細胞和哺乳動物細胞中ERAD系統(tǒng)的組成因子，以及這些因子在細胞內的分布情況。圖2 酵母細胞和哺乳動物細胞中的蛋白質降解機制。分子伴侶和糖基水解酶47（glycosylhydrolase-47）家族蛋白Mns1 and Htm1能發(fā)現折疊錯誤的蛋白質，并使其與內質網膜結合連接酶Doa10、RMA1、HRD相結合。當底物蛋白與內質網胞質溶膠面結合后就會被E3連接酶泛素化修飾。所有的泛素連接酶復合體都含有一個重要的含有指環(huán)催化結

7、構域的E3連接酶，一個E2結合酶以及其他一些輔助因子蛋白。AAA+ ATP酶Cdc48蛋白能使泛素化修飾的底物蛋白從內質網膜上脫離下來。配體蛋白（adaptor proteins）Rad23 and Dsk2能促使泛素化修飾的底物蛋白進入26S蛋白酶體被降解，同時，Png1蛋白能借助Rad23蛋白的作用使糖蛋白去糖基化。圖中酵母蛋白以紫色表示，哺乳動物蛋白以綠色表示。 1. 葡聚糖與蛋白質折疊內質網內蛋白質控系統(tǒng)最主要的作用就是將未正確折疊的蛋白質扣留在內質網中。Hsp70伴侶蛋白以及葡聚糖依賴的分子伴侶蛋白（glycan-dependent chaperone）會與非天然蛋白結合，

8、防止其轉運至高爾基體，而且還可以與氧化還原酶類（oxidoreductases）蛋白一起幫助構象不正確的蛋白重新折疊，改變其構象。傳統(tǒng)的觀點認為，蛋白運送裝置只會在蛋白質正確折疊之后才根據其氨基酸序列中的“離開信號（exit signals）”將其轉運出內質網。另一種觀點則認為，在決定是否將蛋白質轉運出內質網時存在一個比較寬泛的標準，是依據蛋白質的能量（級）狀態(tài)和細胞的折疊環(huán)境而定的（圖3和背景知識1）。圖3 內質網中的蛋白質處理途徑。蛋白質經由Sec61蛋白被轉運入內質網中之后（如圖中步驟1所示），未折疊的蛋白質在分子伴侶的作用下可以被折疊成正確的構象F，如圖中步驟2所示。外向轉運因子能選擇

9、這些折疊正確的蛋白質并將它們運送至高爾基體，如圖中步驟3和4所示。而滯留因子則會阻止未折疊的蛋白質離開內質網，如圖中步驟5所示。分子伴侶會努力幫助任何折疊發(fā)生錯誤的蛋白質恢復成未被折疊的狀態(tài)，使其能夠重新進行正確的折疊，如圖中步驟6所示。在步驟7中，滯留因子會使折疊錯誤的蛋白質停留在內質網中，最終，這些異常蛋白質以及一部分處于折疊中間狀態(tài)的蛋白質會經胞質溶膠途徑被降解，如圖中步驟8所示。KUF和KUM表示反應的平衡常數。 背景知識1：關于蛋白質外向轉運的靈活標準通常大家都會認為外向轉運機制（export machinery）只會運輸那些折疊正確、構象天然的蛋白質，而所有的異常蛋白質都

10、會被降解掉。這說明內質網（endoplasmic reticulum，ER）會使用一種固定的，統(tǒng)一的，以野生型蛋白質的構象為標準的質量控制標準。但是這種理論卻無法解釋為什么有些細胞能分泌突變型蛋白質。在內質網中究竟是一種什么標準在進行蛋白質的質量控制工作。了弄清楚由甲狀腺素轉運蛋白（transthyretin，TTR）引起的組織特異性的淀粉樣變性疾病（tissue-specific amyloid diseases）的發(fā)病機制，Sekijima等人證明了TTR突變體蛋白的分泌情況與“折疊穩(wěn)定性分值（folding stability score）”有關。這個分值集合了熱力學穩(wěn)定性情況（ther

11、modynamic stability），即伸展的多肽鏈與折疊狀態(tài)多肽鏈之間的Gibbs自由能差異（Gibbs free-energy difference）；和動力學參數，比如TTR形成四聚體的速率等等。相應的，不同組織蛋白分泌效率上的偏差也似乎是由于分子伴侶、外向轉運機制以及為細胞外向轉運機制制定各自標準的ERAD系統(tǒng)之間各自活性上的差異造成的。比如，在某種細胞中，某一特定蛋白可能會被轉運出去，但是在另一種組織細胞中卻可能會被降解，這是因為分子伴侶的低活性降低了用于判斷蛋白是否被外向轉運的“折疊穩(wěn)定性分值”的閾值。Wiseman等人在Sekijima試驗的基礎之上又開發(fā)出了一套關于蛋白質折

12、疊外向轉運的定量模型，即FoldEx模型，該模型將內質網中復雜的內環(huán)境網絡系統(tǒng)簡化成了幾條基本的代謝通路，包括易位（translocation）、不需要分子伴侶的蛋白折疊途徑和需要分子伴侶的蛋白折疊途徑、蛋白外向轉運途徑以及ERAD途徑，每一條途徑都被看做一個獨立的單元（圖3）。上述這每一條途徑的作用都與酶的作用一樣，可以通過MichaelisMenten動力學常數表示出來。Wiseman等人結合了幾種不同的方程，用數學的方法描述了蛋白質以折疊平衡常數（folding equilibrium constant）為基礎的外向轉運效率，該效率與熱力學穩(wěn)定性情況有關。這種理論研究的方法正確的解釋了我

13、們在試驗中觀察到的現象，即在一個特定的細胞特異性環(huán)境當中，蛋白質折疊分子的絕對熱力學穩(wěn)定性決定了它們的外向轉運效率。FoldEx模型同樣也解釋了為什么即使是非常穩(wěn)定的蛋白質，比如CTFR等包含多個結構域的蛋白質或者是多亞基組成的蛋白質復合體，如果折疊的過慢也會被降解掉，該模型告訴我們，蛋白質的外向轉運效率取決于ERAD途徑與外向轉運途徑之間的活性對比情況，也取決于蛋白質發(fā)生錯誤折疊的速度，這也就是說當蛋白質更容易發(fā)生錯誤折疊時，蛋白質的外向轉運效率就會降低。FoldEx模型重點強調了“可適應性標準（adaptable standard）”的概念，是可適應性標準決定了某種細胞中每一種蛋白質的外向

14、轉運效率。該標準是由蛋白質氨基酸序列復雜的相互作用以及蛋白質折疊時所處的局部微環(huán)境（比如分子伴侶及幫助蛋白質折疊的酶、代謝產物、外向轉運裝置和ERAD裝置等情況）等因素所決定的，而且該標準還可以在細胞處于應激環(huán)境時進行調整，幫助細胞適應相應的環(huán)境。各種不同的蛋白質都可以競爭這些細胞裝置，結果導致某種蛋白的外向轉運效率會取決于某一時刻表達的蛋白酶體的多少。FoldEx模型是第一個將蛋白質折疊相關以及內質網折疊活性、ERAD和外向轉運裝置相關熱力學參數和動力學參數結合起來的理論模型，該模型將會是我們未來試驗研究中的好幫手。  大部分在內質網中合成的蛋白質多肽都會被N連接低聚糖（

15、N-linked oligosaccharides）修飾。低聚糖糖基轉移酶（Oligosaccharyltransferase）能催化葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖（glucose3-mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharides）與進入內質網蛋白所含的Asn-X-Ser/Thr基序中的天冬酰胺（asparagine）之間共價連接（圖4）。這些N連接聚糖賦予了被修飾蛋白更多的親水性，同時也能起到幫助蛋白質折疊的作用。而且，這些聚糖分子結構本身的修飾信息也能為我們提供當下的蛋白質的折疊狀況信息。聚糖分子最外側的兩個葡萄糖分子會被內質網中

16、的葡萄糖苷酶（-glucosidases）水解切除掉，以表明該蛋白正處于折疊過程之中（圖4）。在這個階段，葡聚糖依賴的分子伴侶蛋白會與該蛋白相連。在哺乳動物細胞中，鈣聯接蛋白（calnexin，是內質網中的一種磷酸化的鈣結合蛋白）或鈣網織蛋白（calreticulin）會與單葡糖基化修飾的糖蛋白（monoglucosylated glycoproteins）相連接，幫助其成熟。當新生蛋白與這些伴侶蛋白分子解離之后，內質網內的葡萄糖苷酶II（-glucosidase-II trims）分子會去掉殘余的葡萄糖分子，防止新生蛋白再次與鈣聯接蛋白或鈣網織蛋白相連。這些進行了正確折疊獲得天然構象的糖蛋白

17、隨后就可以離開內質網了。但是那些需要更多幫助才能成熟的蛋白質又是如何獲得正確構象的呢？作為哺乳動物細胞內質網內最主要的折疊裝置，UDP葡萄糖（UDP-glucose）糖蛋白葡萄糖基轉移酶（glycoprotein glucosyltransferase，GT或者叫UGGT）能識別出非天然蛋白質，并使其聚糖分子A分支重新葡萄糖基化，這樣，就可以再次與鈣聯接蛋白或鈣網織蛋白相連，進行重新折疊（圖4b）。這種鈣聯接蛋白-鈣網織蛋白循環(huán)（calnexincalreticulin cycle）只是哺乳動物細胞內蛋白質質控系統(tǒng)里的第一步，但是如果新生蛋白“錯過”了這一輪成熟的機會，就只能被降解掉。圖4 在

18、酵母細胞和哺乳動物細胞內質網中對N連接聚糖分子的處理過程示意圖。a：在酵母細胞和哺乳動物細胞中，寡糖基轉移酶（oligosaccharyltransferase，OST）能將多萜醇載體上的葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（glucose3-mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide）轉移到底物蛋白Asn-X-Ser/Thr基序中的天門冬酰胺殘基上。在酵母細胞中葡萄糖苷酶1、2（glucosidases 1 and 2，Gls1、Gls2）能將葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子中最外側的兩個葡萄糖殘基去除掉，形成葡萄糖

19、1-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（glucose1-mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），如圖中步驟1所示。在Gls2蛋白的繼續(xù)作用下最終能形成甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），該分子能保護糖蛋白免遭降解，見步驟2。Mns1蛋白能去除聚糖分子B鏈，即中間鏈上最外側的甘露糖殘基，形成甘露糖8-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（mannose8-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），這說明該糖蛋白在內

20、質網中停留了很長的一段時間，見步驟3。然后，Htm1蛋白繼續(xù)處理最右手邊的C鏈糖蛋白，形成甘露糖7-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（mannose7-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），見步驟4；b：在哺乳動物細胞中，步驟1和2與酵母細胞中發(fā)生的相同，只不過在步驟2中由葡萄糖苷酶II（glucosidase-II）完成的去除A鏈中最后一個葡萄糖殘基位點的反應是可逆的。葡萄糖基轉移酶（Glucosyltransferase，GT）能促使那些未能獲得天然構象的糖蛋白再次發(fā)生葡萄糖基化，見步驟3。如果EDEM蛋白被ERManI進行過度的去甘露糖基化處理或者被內質

21、網降解，都會形成甘露糖5-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（mannose5-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），而這就是蛋白質應該被降解的信號，見步驟4。 2. 給予降解信號那些沒能獲得天然構象的蛋白質必須被細胞降解，以免進行不必要的折疊，以免內質網被這些蛋白占據?！案事短怯嫊r器（mannose timer）”模型認為，一旦蛋白質上的甘露糖殘基被去掉，那么它就無法再獲得正確的構象了。實際上，內質網中的糖基水解酶47（glycosylhydrolase-47，GH47）家族蛋白才是體內處理錯誤蛋白的第一道防線。在酵母細胞中，GH47家族里有兩名成員

22、在內質網中被發(fā)現，它們分別是1,2甘露糖苷酶（1,2-mannosidase）Mns1（該蛋白也被稱為甘露糖苷酶樣蛋白1）和甘露糖苷酶樣蛋白Htm1，該蛋白是甘露糖苷酶1（mannosidase 1）的同系物。Mns1蛋白能去除N連接聚糖B鏈上最外側的甘露糖殘基（圖4）。實際上，這種修剪作用能影響到內質網中的所有糖蛋白，但是對糖蛋白的成熟過程和酵母細胞的存活都不會造成任何影響。不過如果細胞缺失了MNS1基因，那么對錯誤蛋白的處理能力就會被削弱，這說明在Mns1蛋白催化甘露糖9-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖(mannose9-N-acetylglucosamine2 glycan)轉變?yōu)楦事短?-N

23、-乙酰葡糖胺酶2低聚糖（mannose8-N-acetylglucosamine2 glycan）之前，糖蛋白一直都被保護起來而免遭降解。因為Mns1蛋白是不考慮蛋白的折疊狀態(tài)，對所有蛋白“一視同仁”的，由此可見，僅僅只靠8甘露糖結構是不足以促使糖蛋白降解的，一定還有其他的信號機制幫助細胞區(qū)分正常的蛋白與異常的蛋白。我們最開始認為Htm1蛋白只是一種凝集素蛋白（lectin）。但現在我們認為，糖蛋白在經過Mns1蛋白處理之后，Htm1蛋白可以去除掉N連接聚糖C鏈上的1,2甘露糖帽結構（capping 1,2-mannose），不過我們目前還缺乏這方面的直接證據。因此，Mns1蛋白和Htm1蛋白

24、之間的這種序貫作用最終就形成了甘露糖7-N-乙酰葡糖胺酶2結構（mannose7-N-acetylglucosamine2），這種結構就是被ERAD所識別的信號。上述這種理論也可以解釋為什么細胞缺失了編碼1,3甘露糖轉移酶（1,3-mannosyltransferase，Alg3）的基因之后細胞就可以在不需要Htm1蛋白的情況下仍然能對糖蛋白進行降解了。我們在alg3細胞中發(fā)現，在N連接聚糖糖蛋白上有甘露糖5-N-乙酰葡糖胺酶2結構（mannose5-N-acetylglucosamine2）結構，該結構的末端仍然連接有由Htm1蛋白導致的1,6甘露糖殘基。Htm1蛋白是如何選擇底物的我們還不

25、清楚。不過Htm1蛋白可以和二硫化物異構酶（disulphide isomerase）Pdi1蛋白一起形成復合體，因此，Htm1蛋白可能只能對與氧化還原酶（oxidoreductase）有關的Pdi1蛋白的底物發(fā)揮作用。在哺乳動物細胞中，我們在內質網中發(fā)現了GH47家族蛋白中的四名成員，即內質網1,2甘露糖苷酶1（ER 1,2-mannosidase-I，ERManI）和其他三個甘露糖苷酶樣蛋白EDEM1、EDEM2、EDEM3。ERManI蛋白與它在酵母細胞中的同源蛋白一樣，也能水解1,2甘露糖苷鍵，切掉B鏈上的一個甘露糖殘基。內質網中ERManI蛋白的豐度能影響ERAD系統(tǒng)底物的穩(wěn)定性。如

26、果使用siRNA技術敲除掉ERManI蛋白，就會影響未被切割的無唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor）H2a蛋白前體的降解過程。如果過表達ERManI蛋白，則會增強去甘露糖基化作用（de-mannosylation），降解掉1抗胰蛋白酶（1-antitrypsin）的無效變異體蛋白（null Hongkong (NHK) variant）。不過在酵母細胞中，僅靠ERManI蛋白還不足以對糖蛋白進行標記，使其降解。似乎ERManI蛋白還需要與EDEM家族蛋白共同作用才能處理掉異常的糖蛋白。雖然我們過去認為EDEM蛋白只是凝集素而已，但是現在已經年有證據表明ED

27、EM家族蛋白與Htm1蛋白一樣，都是甘露糖苷酶。細胞內EDEM1和EDEM3蛋白過表達時，連接在底物蛋白，諸如NHK、BACE451、T細胞受體亞單位上的葡聚糖分子中甘露糖殘基的數量就會減少。此外，根據我們對EDEM蛋白結構模型的分析，我們發(fā)現EDEM蛋白與ERManI蛋白在結構上具有驚人的相似性，而且還發(fā)現對于ERManI蛋白催化活性比較重要的氨基酸殘基都非常保守。這說明至少EDEM1和EDEM3蛋白具有甘露糖苷酶的活性。不過我們還不清楚這些酶是如何選擇各自底物的。但是我們知道EDEM1蛋白能與鈣聯接蛋白發(fā)生相互作用，因此，它可能借此方式來與底物糖蛋白發(fā)生相互作用。 3. ERAD

28、系統(tǒng)的分類整理功能被內質網內甘露糖苷酶I蛋白和Htm1蛋白處理過的折疊錯誤的糖蛋白最終必須由泛素連接酶進行泛素化修飾。但是未經糖基化修飾的異常蛋白也會經由上述途徑進行降解，不過我們現在對起始過程還不清楚。背景知識2中對ERAD系統(tǒng)的主要底物進行了歸納總結。在蛋白的內質網腔、跨膜區(qū)域和胞質結構域里可能出現的各種蛋白質異常情況以及需要注意的出錯情況，都使得該蛋白必須與E3連接酶不同，這些連接酶能與其它輔助因子一起形成復合體，招募固定末端折疊錯誤的蛋白質。 背景知識2：ERAD底物簡介1抗胰蛋白酶（1-Antitrypsin，1-AT）  1抗胰蛋白酶是一種由肝細胞分泌的可溶性糖

29、基化絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine-protease inhibitor）。NHK變異體蛋白基因具有一提前出現的終止密碼子。雖然NHK變異體蛋白不能進行正常的折疊，但是它們也能部分的“逃脫”內質網中蛋白質質控系統(tǒng)的監(jiān)測，被細胞分泌出來。NHK-QQQ蛋白是一種未被糖基化修飾的人工NHK蛋白。在Pi Z變異體中，蛋白質第342位的谷氨酸突變成了賴氨酸，這會影響到蛋白質的折疊，并使其無法分泌。在某些情況下，Pi Z蛋白會積聚在內質網中，形成肝硬化。如果人體缺乏1抗胰蛋白酶還會導致肺氣腫（lung emphysema），這是由于在缺乏1抗胰蛋白酶時嗜中性白細胞分泌的彈性蛋白酶活性會增高，從而破壞了

30、肺泡間的結締組織（connective tissue）結構。ASGPR H2a  ASGPR H2a是唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor）的組成亞單位。唾液酸糖蛋白受體能以受體介導的胞吞作用（receptor-mediated endocytosis）清除循環(huán)中不含唾液酸的糖蛋白。BACE457  分泌酶（-secretase，BACE）在胰腺中的同工酶，它無法幫助處理淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein）。相反，BACE457自己會被降解。CD3 和TCR  屬于T細胞受體家族，能在內質網中組裝

31、。孤兒亞單位（Orphan subunits）會被降解。同樣，分泌型Ig-在缺乏輕鏈的情況下也會被降解。囊性纖維病電導調節(jié)因子（conductance regulator，CFTR）  CFTR是由上皮細胞表達的一種氯離子通道蛋白。F508突變型蛋白是最常見的導致囊性纖維病這種遺傳性常染色體隱性遺傳病的病因。F508缺失突變型蛋白只能部分影響氯離子通道的生理活性，但是該變異蛋白的成熟過程會受到很大的影響。上皮細胞由于缺乏氯離子，因此滲透壓不足，細胞內產生的粘液含水量也就相應降低。高粘度的粘液影響了患者氣道的自凈功能，導致持續(xù)性的氣道感染，最終引起肺部纖維性變，肺功能衰竭。羧肽酶Y（c

32、arboxypeptidase Y，CPY）  羧肽酶Y是釀酒酵母空泡中的一種可溶性絲氨酸蛋白酶，它攜帶有N連接聚糖。CPY*蛋白是CPY蛋白第255位的甘氨酸突變?yōu)榫彼岬耐蛔凅w蛋白。CPY*蛋白的C末端缺乏低聚糖分子，因此無法被ERAD途徑識別。-羥-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase）又名3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase)  該酶是一種膜錨定蛋白質，也是甲羥戊酸（mevalonate）代謝通路中的限速酶。它的穩(wěn)定性與細胞內甾醇的豐度高度相關。當甾醇含量足夠

33、高時，該酶會被降解。Ig LC NS  Ig LC NS是一種無法轉運的免疫球蛋白輕鏈蛋白，會被ERAD途徑降解。KAI1又名CD82  KAI1蛋白屬于四次跨膜蛋白家族（tetraspanin family）。在好幾種人類癌癥中都會發(fā)現KAI1蛋白表達量降低與腫瘤轉移能力增強有關。MHC I類分子  MHC I類分子能將細胞內的肽段呈遞給T細胞，以便機體清除表達外源性肽段的細胞。HCMV病毒借助細胞ERAD系統(tǒng)能降解MHC I類分子的重鏈蛋白，以防止細胞呈遞病毒來源的肽段。Pael受體（Pael receptor，Pael-R）  Pael受體是泛素連

34、接酶Parkin的底物蛋白。當Parkin失活時，未經折疊的Pael受體會聚集在內質網中，導致神經細胞死亡。這說明Pael受體在青少年帕金森氏病（juvenile Parkinsons disease）這種常染色體隱性遺傳疾病中扮演了重要角色。Pdr5  Pdr5蛋白是一種ATP結合盒式轉運體蛋白（ATP-binding cassette transporter），它能使釀酒酵母對多種藥物產生抗性。內質網核糖體結合糖蛋白（Ribophorin I）  內質網核糖體結合糖蛋白是寡糖基轉移酶復合體（oligosaccharyltransferase complex）中錨定在膜上

35、的亞單位。如果去掉該蛋白的C末端跨膜結構域就會形成錯誤折疊的，可溶性的變異體蛋白RI322，該變異體蛋白只攜帶有一個N連接聚糖。甲狀腺素轉運蛋白（Transthyretin，TTR）  甲狀腺素轉運蛋白是由肝細胞分泌的未被糖基化修飾的血清蛋白，它能起到轉運甲狀腺素的作用。如果該蛋白發(fā)生突變，會破壞它所構成的同源四聚體結構的穩(wěn)定性，形成淀粉樣纖維蛋白，最終導致神經細胞變性，器官功能衰竭。 3.1 針對各種不同異常情況的蛋白需要不同的途徑給予解決在酵母細胞中兩種E3連接酶，但是這兩種酶就足以處理大部分的底物蛋白。連接酶Doa10蛋白是由Mat-210蛋白降解而來，它主要負責處理

36、胞質結構域發(fā)生問題的蛋白質，而另一種連接酶，-羥-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase）的降解產物HRD蛋白則負責處理腔內結構域或跨膜結構域異常的蛋白質。為了突出這種處理方式上的差異，有人對ERAD系統(tǒng)的概念進行了擴展，提出是ERAD-C負責降解胞質結構域發(fā)生問題的蛋白質，ERAD-M負責降解跨膜結構域發(fā)生問題的蛋白質，而ERAD-L負責降解內質網腔內結構域發(fā)生問題的蛋白質。這三條處理途徑的“起點”不同，但“終點”卻都匯聚到胞質當中。兼有多種異常情況的蛋白質首先會由ERAD-C途徑處理，因為該途徑的處理速度似乎要比其他兩條途徑快。不過我們需要注意的是，我們上述的這三種

37、ERAD途徑只是針對酵母細胞中的蛋白質情況而言，不一定能推廣使用。3.2 酵母細胞中ERAD系統(tǒng)的關鍵信息HRD連接酶是錨定在內質網膜上的蛋白復合體，它至少由5個不同的亞基組成。Hrd1/Der3蛋白具有6個跨膜結構域，以及一個胞質內環(huán)-指結構域（RING-finger domain），該結構域可以使泛素連接酶的靶蛋白泛素化。Hrd1蛋白能與Usa1蛋白發(fā)生相互作用，而Usa1蛋白是Der1蛋白（在ER-1中被降解）的配體。HRD蛋白復合體的腔內結構域是由Hrd3蛋白和Yos9蛋白（酵母細胞OS-9蛋白的同系物）組成的。Yos9蛋白攜帶有甘露糖6磷酸鹽受體同源性結構域（mannose-6 ph

38、osphate receptor homology，（MRH）domain），該結構域能夠識別由Htm1蛋白催化產生的，在末端包含有1,6連接甘露糖（1,6-linked mannose）的N連接聚糖分子。如果MRH結構域發(fā)生突變，Yos9蛋白就無法與N連接聚糖結合，結果CPY*蛋白（即第255位甘氨酸突變?yōu)榫彼岬腃PY蛋白）和其他糖蛋白發(fā)生降解，這說明Yos9蛋白能夠將異常蛋白的識別過程與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)聯系起來。但是如果去掉Yos9蛋白，或者去掉CPY*蛋白上的糖基化位點，卻并不足以破壞HRD連接酶與其底物之間的相互作用。那么如果不是為了與底物進行結合，Yos9蛋白和CPY*蛋白上的聚

39、糖分子又到底起到了一種什么樣的作用呢？Yos9蛋白中的MRH結構域可能能對所有待查蛋白進行搜索、篩選，看看它們是否都攜帶有尚未與其他蛋白形成穩(wěn)定相互作用的甘露糖7-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖（mannose7-N-acetylglucosamine2 glycan）位點。而復合體中的其他組成蛋白質則可以與折疊錯誤的蛋白質形成連接。實際上，Hrd3蛋白的確能與異常蛋白相連，而且對疏水蛋白具有較高的親和力。Hsp70蛋白分子伴侶Kar2蛋白（karyogamy 2）也能與Yos9蛋白相連，這說明HRD連接酶的腔內結構域可以通過多種方式與異常蛋白發(fā)生相互作用。HRD復合體是依靠何種機制選擇出那些機體不

40、需要的異常蛋白，將其“清理”出內質網的呢？我們又提出了下列機制，在Kar2的作用下，非天然構象的蛋白質與HRD連接酶發(fā)生相互作用，最終，這些非天然構象的蛋白質可能會形成成熟的，具有正確折疊構象的蛋白質，或者仍然無法形成正確構象。然后，Hrd3蛋白可能會通過底物蛋白中的疏水結構與底物蛋白結合，同時，Yos9蛋白會對這些底物蛋白進行篩查，檢查它們是否具有末端1,6連接甘露糖（1,6-linked mannose）。只有能同時與Yos9蛋白和Hrd3蛋白發(fā)生相互作用的底物蛋白才能在攜帶有甘露糖8-9聚糖分子（mannose89 glycans，這些糖基化位點可以被切除，幫助蛋白質形成正確的折疊）的糖

41、蛋白的幫助下，經由Hrd1蛋白被泛素化途徑修飾。如果在細胞內缺乏Yos9蛋白和Hrd3蛋白的情況下過量表達Hrd1蛋白，會導致內質網內的蛋白廣泛性降解，這說明Yos9蛋白和Hrd3蛋白能起到篩選的作用，以保證只有合適的底物才能進入胞質溶膠經由泛素化途徑被降解。為了達到這個目的，Hrd1蛋白會與可溶性的E2結合酶Ubc1和Ubc7一起協同發(fā)揮作用，這些E2結合酶會通過Cue1蛋白被錨定在內質網膜上。在酵母細胞中第二個位于內質網膜上的E3連接酶是Doa10蛋白，我們是在篩選能夠降解可溶性轉錄抑制因子Mat2的蛋白因子的過程中發(fā)現Doa10蛋白的。隨后我們又發(fā)現了好幾個Doa10蛋白的膜上底物蛋白，

42、因此認為Doa10蛋白也參與了ERAD通路。Doa10蛋白在N端具有特征性的指環(huán)結構域（RING-finger domains）以及14個跨膜結構域。雖然Doa10蛋白復合體的膜結構如此復雜，但是組成Doa10蛋白復合體的亞單位還是非常簡單的，我們現在只發(fā)現E2結合酶Ubc6蛋白和Ubc7蛋白是Doa10蛋白的輔因子。Ubc7蛋白是通過Cue1蛋白被錨定在內質網膜上的。3.3 哺乳動物連接酶我們在哺乳動物細胞中發(fā)現了更多的參與ERAD系統(tǒng)的連接酶，要比酵母細胞中發(fā)現的連接酶多得多。有兩種與酵母細胞Hrd1蛋白同源的哺乳動物蛋白HRD1蛋白，又名Synoviolin蛋白；和gp78蛋白，又名AM

43、FR蛋白，即腫瘤自分泌活性因子受體蛋白（tumour autocrine motility factor receptor）。HRD1蛋白與人Hrd3同源蛋白SEL1L（Lin12樣蛋白抑制蛋白）、HERP蛋白（與酵母細胞中的Usa1蛋白類似）、Derlin 13蛋白（屬于Der1家族蛋白）和OS-9蛋白（Yos9蛋白的人類同源蛋白，可見于骨肉瘤細胞）一起，形成了與酵母HRD連接酶復合體相似的哺乳動物連接酶復合體。哺乳動物細胞表達兩種OS-9蛋白，即OS-9.1蛋白及其變異蛋白OS-9.2蛋白（該蛋白相比OS-9.1蛋白缺乏55個氨基酸殘基）。這兩種蛋白都能與SEL1L蛋白發(fā)生相互作用，也能與

44、不具有正確構象的1抗胰蛋白酶（1-antitrypsin）的變異蛋白NHK相結合。與它們的酵母同源蛋白Yos9一樣，OS-9蛋白與底物蛋白之間的結合也不需要N連接聚糖分子的參與，所以它們可以和未被糖基化修飾的NHK蛋白NHK-QQQ蛋白相結合。但是如果底物蛋白缺乏糖基化修飾，它們就無法被細胞降解。通過siRNA降低OS-9蛋白的表達水平會影響細胞內NHK蛋白的降解，增加NHK蛋白的分泌水平。而過表達OS-9蛋白則會抑制NHK蛋白的分泌，但是不會增強它們的降解水平。OS-9蛋白可能會起到兩種作用，生理濃度水平的OS-9蛋白可以與SEL1L蛋白協作，將構象不正確的異常蛋白降解；而過量的高水平的OS

45、-9蛋白卻無法與HRD連接酶發(fā)生相互作用降解異常蛋白。Yos9蛋白在哺乳動物細胞中的另一個同系物（orthologue）就是XTP3-B蛋白，即XTP3反式激活蛋白B（XTP3-transactivated protein B），也被稱為Erlectin蛋白。XTP3-B蛋白具有兩個MRH結構域，能與SEL1L蛋白發(fā)生相互作用。與OS-9蛋白一樣，XTP3-B蛋白也能與NHK蛋白及其非糖基化的變異體蛋白相結合。如果過量表達XTP3-B蛋白會影響其底物蛋白的降解過程，不過通過siRNA技術減少XTP3-B蛋白的表達量卻沒有對NHK蛋白的穩(wěn)定性造成任何影響。我們還沒有發(fā)現XTP3-B蛋白的最適底物

46、，XTP3-B蛋白也可以使未成熟的蛋白質滯留在內質網中，并防止它們聚集，這一點與OS-9蛋白過表達時的情況一樣。HRD1蛋白能避免細胞在遭受應急刺激信號時進入凋亡途徑，這說明它在內質網異常蛋白的泛素化修飾過程中起到了非常廣泛的作用。在目前為止發(fā)現的所有HRD連接酶的底物蛋白中，有一些是名為RI332的內質網核糖體結合糖蛋白（Ribophorin）的截短體蛋白和折疊錯誤蛋白，有一些是未組裝的分泌型Ig單鏈蛋白以及未糖基化的Ig輕鏈蛋白變異體蛋白。在內質網中，這種異常Ig輕鏈蛋白處于一種完全氧化的狀態(tài)，具有兩個二硫鍵（disulphide bonds），而部分還原時只具有一個二硫鍵。只有這種部分還

47、原的異常Ig輕鏈蛋白能與Derlin-1蛋白和HERP蛋白發(fā)生相互作用，這表明在完全氧化的Ig輕鏈蛋白被連接酶招募之前，已經有一個二硫鍵被還原了。人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）基因編碼產物特異性小區(qū)域蛋白11（unique short region protein 11，US11）也能與HRD連接酶復合體的組成單位SEL1L蛋白和Derlin-1蛋白相互合作，降解MHC I類分子重鏈蛋白。Gp78蛋白和人HRD1蛋白的跨膜結構域具有超過50%的序列同源性。與需要Cue1幫助才能與Ubc7發(fā)生相互作用的Hrd1蛋白不同，gp78蛋白除了環(huán)指結構域之外還具有G

48、2BR結構域，該結構域可以與UBE2G2進行結合，因此可以直接招募酵母細胞中Ubc7蛋白的同系物E2 UBE2G2蛋白，即E2結合酶E2G2。在gp78蛋白的底物蛋白中有一個底物是1抗胰蛋白酶的變異體Pi Z蛋白，還有T細胞受體orphan亞單位，比如TCR和Cd3等。而且，gp78蛋白還能泛素化修飾HMG-CoA還原酶，這說明ERAD系統(tǒng)在固醇代謝途徑中的作用非常保守。gp78蛋白還有另一個具有非常重要醫(yī)療價值的底物，即KAI1蛋白，該蛋白具有四個跨膜結構域，能夠抑制腫瘤轉移。如果通過siRNA降低gp78蛋白的表達水平，會增加細胞內KAI1蛋白的含量，降低腫瘤細胞的轉移能力。Doa10蛋白

49、在哺乳動物細胞中最有可能的同系物就是TEB4蛋白。這兩種蛋白都有相同的跨膜結構域和N末端的指環(huán)結構域。不過TEB4蛋白可以使其自身泛素化，但是我們還沒有發(fā)現它的底物蛋白。除了這些與酵母細胞連接酶相似的連接酶之外，在哺乳動物細胞中還存在一些酵母細胞中沒有的ERAD連接酶。內質網中有一種名為攜帶有膜錨定結構的指環(huán)蛋白1（RING-finger protein with membrane anchor 1，RMA1），該蛋白是一種在擬南芥（Arabidopsis）到人類中都廣泛存在、非常保守的泛素連接酶。RMA1蛋白能與UBE2J1蛋白相互作用，如果過表達RMA1蛋白會降低細胞內囊性纖維化病跨膜傳導

50、調節(jié)蛋白（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）的水平。RMA1蛋白最主要的作用是在CFTR蛋白翻譯過程中或翻譯剛剛完成之后檢測CFTR蛋白N末端結構域的折疊情況。翻譯完成之后，胞質內的E3連接酶CHIP蛋白會促使RMA1蛋白解離，繼續(xù)檢測CFTR蛋白的折疊情況。CHIP蛋白含有一在結構上與指環(huán)結構域非常類似的U盒子（U-box）結構域，它是一三角形四肽（tetratricopeptide）重復結構域，能與Hsp70蛋白和Hsp90蛋白發(fā)生相互作用。CHIP蛋白這種能與分子伴侶蛋白和泛素連接酶蛋白相結合的活性表明CHI

51、P蛋白能監(jiān)控Hsp70蛋白介導的蛋白折疊過程，并能降解那些發(fā)生了不可逆的錯誤折疊的蛋白質。另一個能與RMA1蛋白發(fā)生相互作用的蛋白是B細胞受體相關蛋白31（B-cell receptor-associated protein 31，BAP31）。BAP31蛋白是一種膜內在蛋白質（integral membrane protein），它也參與了對內質網內膜蛋白的分選工作。BAP31蛋白能與Sec61孔蛋白、E3連接酶RMA1蛋白、Derlin-1蛋白等發(fā)生相互作用。如果通過siRNA技術抑制BAP31蛋白的表達則能夠穩(wěn)定CFTR蛋白，BAP31蛋白還能起到分子伴侶的作用，幫助新合成的CFTR蛋白

52、折疊，還能幫助區(qū)分各種不能由RMA1蛋白折疊以及由Derlin-1蛋白降解的變異蛋白。泛素連接酶蛋白的變異體蛋白Parkin與青少年帕金森氏?。╦uvenile Parkinsons disease）有關。如果表達缺陷型的Parkin蛋白可以導致Pael-R蛋白在內質網中聚集，繼而導致多巴胺能神經元變性，形成帕金森氏病。在體外，Parkin蛋白可以泛素化修飾Pael-R蛋白，不過效率非常低，但是在CHIP蛋白的幫助下可以大大提高此泛素化修飾效率。胞質內的SCF復合體是由Skp1蛋白、Cul1蛋白、Roc1蛋白（又名Rbx1蛋白）以及F-Box等蛋白組成的泛素連接酶復合體。在大量的F-Box蛋白

53、中有兩個蛋白能夠決定SCF連接酶的底物特異性，這兩個蛋白是神經元特異性的蛋白Fbs1和Fbs2，它們都是能夠識別糖基側鏈的F-Box蛋白。Fbs1蛋白和Fbs2蛋白都含有糖基化位點結合結構域，能與N連接聚糖分子中最內側的糖基化位點相結合。我們目前還沒有發(fā)現SCF復合體的底物，但它們可以清除那些可能是從經典的ERAD途徑中“逃脫”的糖蛋白胞質溶膠或者是在內質網脂質雙分子膜破裂時“泄露”出來的糖蛋白。3.4 跨越內質網膜結構在折疊發(fā)生錯誤的蛋白質被泛素化修飾以及降解之前，它們必須能夠跨越內質網膜結構。這種外向轉運過程包括轉位（dislocation）和逆移位（retrotranslocation）

54、兩種過程。但是我們現在還不清楚蛋白質是如何被轉運出內質網的，可能是通過Sec61易位子（translocon）以一種類似于轉入過程（import process）的方式來完成的，也可能是通過形成脂質小體（lipid droplet）的方式來完成的。HRD連接酶將發(fā)生在內質網膜兩側的重要事件聯系了起來。這兩個重要事件分別是在內質網腔內側發(fā)生的底物蛋白募集事件和在內質網胞質側發(fā)生的底物蛋白質泛素化修飾事件。因此，底物蛋白質的外向運輸事件可能是通過連接酶中的某種“管道”完成的?？赡蹾RD復合體本身就能將異常的蛋白質“排出”到胞質當中。與HRD連接酶共同發(fā)揮作用的還有Derlin家族蛋白，這些Derl

55、in家族蛋白也是最有可能起到轉運作用的蛋白質。有3個Derlin家族蛋白與酵母Der1蛋白具有一定程度的同源性，這3個蛋白可以一起組成異源復合體，同時MHC I類重鏈分子也參與了該復合體的形成。Derlin-1蛋白能與HCMV病毒的US11蛋白發(fā)生相互作用。當我們使用抑制劑抑制蛋白酶體活性的時候，我們發(fā)現Derlin-1蛋白與去糖基化的重鏈分子結合在一起。而胞質中的N聚糖酶（N-glycanase）能去除掉MHC I類重鏈分子上的糖基化位點。因此，Derlin-1蛋白肯定是在重鏈分子被轉運至胞質中之后或者在轉運過程之中才與其結合的。我們還發(fā)現具有各種不同功能的ATP酶，比如AAA+-ATPas

56、e p97蛋白（即酵母細胞中的Cdc48蛋白）等能夠與Derlin-1蛋白和Derlin-2蛋白發(fā)生相互作用，這也都說明Derlin蛋白能夠起到轉運內質網中異常蛋白的作用。我們在下面還將討論到，Cdc48蛋白能促使ERAD系統(tǒng)底物錨定到內質網膜上。Derlin-1蛋白不參與US2蛋白介導的重鏈分子降解過程，因此它可能還會起到其他的作用，或者在內質網中還存在其他的轉運機制。3.5 底物蛋白從內質網膜結構上釋放出來并被降解破壞異常蛋白穿越內質網膜結構的過程需要有一種“力”來指引轉運的方向。而且，底物蛋白必須從膜結構中釋放出來才能進入蛋白酶體。轉運和釋放過程都需要能量，而且這兩個過程可能是偶聯在一起

57、的。還有一部分能量需要參與底物蛋白的泛素化修飾過程，該過程也是底物蛋白易位的先決條件。另一個需要能量的過程是由Cdc48蛋白（在人類細胞中是p97蛋白）介導的。Cdc48蛋白這種AAA ATP酶可以形成同源六聚體（homohexamers），在泛素蛋白融合降解蛋白1（ubiquitin fusion degradation 1，Ufd1）和核定位蛋白4（nuclear protein localization 4，Npl4）等輔助因子的共同作用下使異常蛋白從內質網膜上解離下來。不過這其中的具體分子機制我們暫時還不清楚。根據“分子鉗（molecular ratchet）”模型，ATP水解循環(huán)可以

58、導致Cdc48蛋白復合體內部構象改變，從而促使結合在p97蛋白N末端的底物蛋白從內質網膜上釋放下來。而另一種模型則認為，在Cdc48蛋白復合體富含精氨酸的環(huán)狀結構形成的富含胍基（guanidyl）的環(huán)境中會產生一個“變性圈（denaturation collar）”結構，該結構可以通過變性作用使蛋白打開折疊。Cdc48蛋白復合體需要固定在內質網膜上才能對底物蛋白施加作用。結果，Cdc48蛋白復合體以一種需要泛素化修飾底物蛋白的方式與膜錨定蛋白Ubx2的泛素蛋白調節(jié)結構域X（ubiquitin regulatory X，UBX）發(fā)生相互作用。在哺乳動物中具有與Cdc48蛋白復合體類似功能的蛋白可

59、能是UBXD2或ERASIN蛋白。當底物蛋白被泛素化修飾并從內質網膜結構上解離下來之后，它們會在輻射敏感蛋白23（radiation sensitive 23，Rad23）和Kar1蛋白抑制蛋白（ominant suppressor of Kar1，Dsk2）的作用下被轉運至蛋白酶體。這些同源性適配體蛋白的C末端都具有泛素相關基序（ubiquitin-associated motif，UBA），能與多泛素蛋白鏈相結合，同時也在N端具有一泛素樣結構域（ubiquitin-like domain，UBL），能指引適配體蛋白和底物蛋白進入蛋白酶體，蛋白酶體可以通過Rpn10和Rpn13亞單位識別多泛素化修飾的底物蛋白。此外，Dsk2蛋白和Rad23蛋白還可能保護多泛素蛋白側鏈免遭泛素蛋白水解酶的降解作用。在這條經典的途徑中，E3連接酶能多泛素化修飾底物。在酵母細胞中還有第二條途徑，底物蛋白首先在連接酶的作用下被單泛素化修飾或者被雙泛素化修飾，然后在U-Box蛋白Ufd2和Cdc48蛋白的作用下延長泛素鏈。Cdc48蛋白能限制Ufd2蛋白對泛素鏈的延長作用，因為Ufd2蛋白能添加4至6個泛素蛋白