04冷凍干燥保護(hù)劑

1、04冷凍干燥保護(hù)劑凍十保護(hù)劑一、凍十損傷機(jī)理：蛋白質(zhì)冷凍十燥全過程分為預(yù)凍、第一階段升華十燥和第二階段再十燥。預(yù)凍過程中水結(jié)冰時(shí)體積增大，致使活性物質(zhì)活性部位中一些由弱分子力鍵連接的鍵遭到破壞，從而使活性損失；另外，水結(jié)冰后引起溶質(zhì)濃度上升以及由于各種溶質(zhì)在不同溫度條件下溶解度變化不一致而引起pH值的變化，導(dǎo)致活性物質(zhì)所處的環(huán)境發(fā)生變化而造成失活或變性。二、凍十保護(hù)作用機(jī)理：第一，“水替代假說”：認(rèn)為由于蛋白質(zhì)分子中存在大量氫鍵，結(jié)合水通過氫鍵與蛋白質(zhì)分子聯(lián)結(jié)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在冷凍十燥過程中失去水分后，蛋白的主相變溫度會升高，發(fā)生變性。但某些糖類屆于親水性物質(zhì)，形成氫鍵能力較強(qiáng)，能替代蛋白表面的水的

2、羥基，與蛋白質(zhì)中的極性基團(tuán)形成氫鍵，使得蛋白的主相變溫度變化不人,低于操作溫度，從而避免了生物活性物質(zhì)由于發(fā)生相變所造成的機(jī)械損傷。能夠直接測量到凍十的蛋白質(zhì)與保護(hù)劑蔗糖問的氫鍵。第二，“玻璃態(tài)假說”：認(rèn)為在含糖溶液的十燥過程中，糖-水混合物會玻璃化，兼有固體和流體的行為，粘度極高，不容易形成結(jié)晶；且分子擴(kuò)散系數(shù)很低，因而具有粘性的保護(hù)劑包圍在蛋白質(zhì)分子的周圍，形成一種在結(jié)構(gòu)上與玻璃狀的冰相似的碳水化合物玻璃體，使大分子物質(zhì)的鏈鍛運(yùn)動受阻，阻止蛋白質(zhì)的伸展和沉淀，維持蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而起到保護(hù)作用。研究表明，單糖、雙糖、多羥基化合物以及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、酶都能顯示玻璃行為，只是玻璃化轉(zhuǎn)變

3、溫度不同而已。由于某些糖的玻璃化溫度較高，在較高的保存溫度下，仍能在蛋白質(zhì)分子附近形成玻璃態(tài)。（大于玻璃化溫度就不形成玻璃態(tài)了）一般說來，如工作溫度低于保護(hù)劑的玻璃化溫度，高于被保護(hù)的活性物質(zhì)的主相變溫度，那么該活性物質(zhì)就能有效地保持活性。但在目前，這兩種假說還不能完全解釋現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。三、凍十保護(hù)劑的選擇：凍十保護(hù)劑需要具備四個(gè)特性：玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高、吸水性差、結(jié)晶率低和不含還原基。常用的保護(hù)劑有如下幾類物質(zhì)：1. 糖類/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖等；其中，葡萄糖、乳糖具有還原性，而蔗糖、海藻糖、葡聚糖沒有還原性。2. 聚合物:HESPVRPEG葡聚糖、白蛋白等；3

4、. 無水溶劑：乙烯乙二醇、甘油、DMSODM奇;4. 表面活性劑：Tween80等；5. 氨基酸:L-絲氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等；6. 鹽和胺：磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽等；具體分類：（一）按相對分子量分1. 低分子化合物低分子化合物可提高微生物存活率，形成均一懸液，起到水分緩解作用。如：酸性物質(zhì)：谷氨酸、天冬氨酸、乳酸；中性物質(zhì):葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇D；堿性物質(zhì)：精氨酸、組氨酸。2. 高分子化合物高分子化合物對微生物有保護(hù)作用，可促進(jìn)其升華形成耐熱骨架阻斷熱傳導(dǎo)和熱輻射。如:白蛋白、明膠、蛋白膘、脫脂奶粉。明膠水解明膠可去掉雜質(zhì)蛋白、無抗原性、無過敏反應(yīng)、無熱源，

5、并且分子,12?。對微生物的保護(hù)作用高出普量小、均質(zhì)、易溶于水，可過濾除菌，共熔點(diǎn)為通明膠10,以上。脫脂奶粉可促進(jìn)升華、加熱滅菌，易取得均質(zhì)產(chǎn)品，并擴(kuò)大細(xì)胞相互問的距離。（二）按功能和性質(zhì)分1. 耐熱凍十保護(hù)劑耐熱凍十保護(hù)劑在凍結(jié)和十燥過程中，可防止活性組分變性，如海藻糖、蔗糖、聚乙烯毗咯酮（PVP）等。2. 填充劑可防止有效組分隨水蒸氣一起升華逸散，如：甘露醇、明膠等。3.抗氧化劑產(chǎn)品的自身氧化可消耗凍十樣品內(nèi)部和環(huán)境中的氧；放入電子或氫離子，可阻斷凍十樣品中氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，抑制氧化酶活性，防止樣品在冷凍十燥及儲藏過程中氧化變質(zhì)。如，硫代硫酸鈉、維生素E、維生素C等。4.酸堿調(diào)整劑在冷凍十燥

6、、儲藏過程中，將生物制品PH值調(diào)整到活性物質(zhì)最穩(wěn)定區(qū)域。常用的有：磷酸二氫鉀、磷酸氫鈉。（三）按物質(zhì)的種類分1. 糖/多元醇類單糖（葡萄糖、半乳糖）：糖與生物制品活性組分的分子形成氫鍵而代替了原有水的位置，起保護(hù)作用；低聚糖（蔗糖、海藻糖）:低聚糖能起到低溫保護(hù)功能和脫水保護(hù)作用；海藻糖則具有相對較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。海藻糖蛋白質(zhì)水微冰晶的形成，有效防止了水對玻璃化態(tài)的增塑作用。并且其內(nèi)部氫鍵較少，有利于蛋白質(zhì)分子問形成氫鍵。多元醇（甘露醇、山梨醇、丙三醇）：多元醇具有和糖一樣的作用。甘露醇無菌濾液穩(wěn)定，不易被氧化，可提供支持結(jié)構(gòu)，并且不與活性組分發(fā)生反應(yīng)；山梨醇是甘露醇的同分異構(gòu)體，但其溶液

7、度比甘露醇大，在常溫下呈粘稠的透明狀液體，有旋光性，略有甜味，具有吸濕性，高溫下不穩(wěn)定，在冷凍十燥配方中，山梨醇常用作填充劑。2. 表面活性劑類表面活性劑是降低界面的張力，親水、親油基組成的化合物。表面活性劑可分為離子型、非離子型。凡是溶于水能電離成離子的，稱為離子型表面活性劑，否則稱為非離子型表面活性劑。表面活性劑在凍結(jié)和脫水過程中既能降低冰、水界面張力所引起的凍結(jié)和脫水變形，乂能在復(fù)水過程中對活性組分起到潤濕劑和重皺褶劑的作用。但在凍十生物制品測定和長期儲藏中，表面活性劑并沒有保護(hù)作用。3. 氨基酸類氨基酸是蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成單位，其中最主要的是a-氨基酸。常用的氨基酸類保護(hù)劑有甘氨酸、谷氨

8、酸、精氨酸和組氨酸，試驗(yàn)表明氨基酸是最好的填充劑。低濃度甘氨酸可通過抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結(jié)晶，所致PH值的改變而阻止蛋白質(zhì)藥物變性，并且能升高成品的塌陷溫度，阻止因塌陷而引起的蛋白質(zhì)藥物的破壞。4.其它添加劑類其它添加劑類保護(hù)劑包括抗氧化劑、緩沖劑和凍十加速劑?？寡趸瘎阂环N是抗氧化劑的自身氧化，消耗凍十樣品內(nèi)部和環(huán)境中的氧，使凍十樣品物料不被氧化；另一種是抗氧化劑給出電子或氫離子，阻斷凍十樣品中的氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；還有一種方式是抗氧化劑通過抑制氧化鎂的活性而防止凍十樣品的氧化變質(zhì)，如維生素E、維生素G硫代硫酸鈉、硫脈。緩沖劑：蛋白質(zhì)具有兩性電解質(zhì)，既能和酸作用乂能和堿作用。在中性環(huán)境中，大多數(shù)蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的，由于蛋白質(zhì)溶液在凍結(jié)過程中溶液的濃度是逐漸升高的，所以在高濃度時(shí)可改變?nèi)芤旱腜H值，PHffi變化4個(gè)單位導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使生物制品失活。因此在凍十保護(hù)劑配方中，需添加適量緩沖劑。如，磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉。凍十加速劑：冷凍十燥過程耗時(shí)長、耗能多，迫切需要對凍十循環(huán)進(jìn)行優(yōu)化，降低生產(chǎn)成本。