激發(fā)光譜與熒光光譜

1、熒熒 光光 光光 度度 計(jì)計(jì)環(huán)境科學(xué)與工程研究中心環(huán)境科學(xué)與工程研究中心n掌握分子熒光產(chǎn)生的過程及其影響因素掌握分子熒光產(chǎn)生的過程及其影響因素n熟悉熒光光度計(jì)的基本構(gòu)件及操作程序熟悉熒光光度計(jì)的基本構(gòu)件及操作程序n了解熒光分析法的特點(diǎn)與應(yīng)用了解熒光分析法的特點(diǎn)與應(yīng)用【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹俊緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹俊緦?shí)驗(yàn)原理】【實(shí)驗(yàn)原理】一、分子熒光產(chǎn)生過程一、分子熒光產(chǎn)生過程二、激發(fā)光譜與熒光光譜二、激發(fā)光譜與熒光光譜三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系四、影響熒光強(qiáng)度的因素四、影響熒光強(qiáng)度的因素1. 1. 分子能級(jí)與躍遷分子能級(jí)與躍遷 分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜； 在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)

2、能級(jí)； 基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定 頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位； 激發(fā)態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式(見能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)； 第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài) S1 、S2 ； 第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2 ；一、分子熒光的產(chǎn)生過程一、分子熒光的產(chǎn)生過程2.2.電子激發(fā)態(tài)的多重度電子激發(fā)態(tài)的多重度 電子激發(fā)態(tài)的多重度：電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1 S S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0(0或或1)1)； 平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定( (洪特規(guī)則洪特規(guī)則) )，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)，三重態(tài)能級(jí)

3、比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；單重態(tài)能級(jí)低； 大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)； S0T1 禁阻躍遷；禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入通過其他途徑進(jìn)入(見能級(jí)圖見能級(jí)圖)；進(jìn)入的幾；進(jìn)入的幾率??；率??； VRASnICVRFPTmISC1ICV RV RS0S1T1（S S0 0：?jiǎn)尉€基態(tài)；：?jiǎn)尉€基態(tài)；S S1 1：最低激發(fā)單線態(tài)；：最低激發(fā)單線態(tài)；T T1 1：最低激發(fā)三線態(tài)；：最低激發(fā)三線態(tài)；A A： 吸收；吸收；F F： 熒光；熒光；P P：磷光；：磷光；v v：振動(dòng)馳豫；：振動(dòng)馳豫；ISCISC：系間竄躍）：系間竄躍） 熒光、磷光光物理過程示意圖熒光、磷光光物理過程示意圖

4、3.3.激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑基態(tài)的能量傳遞途徑 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光發(fā)光)和和無輻射躍遷等方式失去能量無輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷輻射躍遷熒光熒光延遲熒光延遲熒光磷光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越系間跨越振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫無輻射躍遷無輻射躍遷 激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大。對(duì)大。熒光：熒光：1010-7-710 10 -9-9 s, s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)第一激發(fā)單

5、重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)；基態(tài)；磷光：磷光：1010-4-410s10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)；基態(tài)；二、激發(fā)光譜與熒光光譜二、激發(fā)光譜與熒光光譜 熒光：熒光：光致發(fā)光光致發(fā)光，照射光波長(zhǎng)如何選擇？，照射光波長(zhǎng)如何選擇？1.1.熒光熒光( (磷光磷光) )的激發(fā)光譜曲線的激發(fā)光譜曲線 固定測(cè)量波長(zhǎng)固定測(cè)量波長(zhǎng)( (選最大發(fā)射波長(zhǎng)選最大發(fā)射波長(zhǎng)),),化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線 （圖中曲線（圖中曲線I I ） 。 激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子

6、最多，熒光強(qiáng)度最大；強(qiáng)度最大；2.2.熒光光譜熒光光譜( (或磷光光譜或磷光光譜) ) 固定激發(fā)光波長(zhǎng)固定激發(fā)光波長(zhǎng)( (選選最大激發(fā)波長(zhǎng)最大激發(fā)波長(zhǎng)),), 化合物化合物發(fā)射的熒光發(fā)射的熒光( (或磷光強(qiáng)度或磷光強(qiáng)度) )與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線( (圖中曲線圖中曲線II或或III) )。3.3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。振動(dòng)弛豫消耗了能量。 b b. .發(fā)射光譜的

7、形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn)生產(chǎn)生不同吸收帶，不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)但均回到第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光。遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光。 c c. . 鏡像規(guī)則鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。 鏡像規(guī)則的解釋 基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分

8、布類似；分布類似； 基態(tài)上的基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率間的躍遷幾率最大，相反躍最大，相反躍遷也然。遷也然。 200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 1.1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)。）具有合適的結(jié)構(gòu)。（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。 熒光量子產(chǎn)率（熒光量子產(chǎn)率（ ）：）：吸收的光量子數(shù)發(fā)射的光量子數(shù)

9、熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。，如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。2.2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類型：）躍遷類型： * 的熒光效率高，系間跨越過程的速的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒

10、光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增上有供電基，使熒光增強(qiáng)。強(qiáng)。四、影響熒光強(qiáng)度的因素四、影響熒光強(qiáng)度的因素 影響熒光強(qiáng)度的影響熒光強(qiáng)度的外部因素外部因素1.1.溶劑的影響溶劑的影響 除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；都將使化合物的熒光發(fā)生變化；2.2.溫度的影響溫度的影響 熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度

11、增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。率增加。3. 3. 溶液溶液pHpH 對(duì)酸堿化合物，溶液對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；的影響較大，需要嚴(yán)格控制；4.4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象內(nèi)濾光作用：內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射熒溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀。光，如色胺酸中的重鉻酸鉀。自吸現(xiàn)象：自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。5.5.溶液熒光的猝滅溶液熒光的猝滅 碰撞猝滅；碰撞猝滅；

12、 氧的熄滅作用等。氧的熄滅作用等。二、儀器結(jié)構(gòu)流程二、儀器結(jié)構(gòu)流程 熒光儀主要由熒光儀主要由四個(gè)部分四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。 特殊點(diǎn)：特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。 基本流程如圖：基本流程如圖：?jiǎn)紊鳎簡(jiǎn)紊鳎哼x擇激發(fā)光波長(zhǎng)的選擇激發(fā)光波長(zhǎng)的第一單色器和選擇發(fā)射光波第一單色器和選擇發(fā)射光波長(zhǎng)的第二單色器；長(zhǎng)的第二單色器；光源：光源：氙燈和高壓汞燈，染氙燈和高壓汞燈，染料激光器料激光器( (可見與紫外區(qū)可見與紫外區(qū)) )檢測(cè)器：檢測(cè)器：光電倍增管光電倍增管。儀器光路圖同步掃描技術(shù)同步掃描技術(shù) 根據(jù)激發(fā)和發(fā)

13、射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關(guān)系，同步根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關(guān)系，同步掃描可分為固定波長(zhǎng)差掃描可分為固定波長(zhǎng)差( () )和固定能量差及可變波長(zhǎng)三種。和固定能量差及可變波長(zhǎng)三種。 同步掃描技術(shù)可簡(jiǎn)化光譜：同步掃描技術(shù)可簡(jiǎn)化光譜：譜帶譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率；變窄，減少光譜重疊，提高分辨率； 如圖如圖。 合適的合適的可可減少光譜重疊：減少光譜重疊： 酪氨酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴(yán)重重疊，但光譜嚴(yán)重重疊，但15nm60nm60nm時(shí)，時(shí)，只顯示只顯示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測(cè)色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定

14、。定?？色@得三維光譜圖的儀器可獲得三維光譜圖的儀器 可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時(shí)變化時(shí)的熒(磷)光光譜圖日立日立F-4500F-4500熒光儀熒光儀熒熒光光儀儀主主機(jī)機(jī)電電源源開開關(guān)關(guān)光源開關(guān)光源開關(guān)主機(jī)開關(guān)主機(jī)開關(guān)n開機(jī)順序：開機(jī)順序：q開機(jī)前首先確認(rèn)主機(jī)兩個(gè)開關(guān)：開機(jī)前首先確認(rèn)主機(jī)兩個(gè)開關(guān)：POWER/MAIN均處于關(guān)閉狀態(tài)均處于關(guān)閉狀態(tài)（搬向（搬向O處）。處）。q先接通電源開關(guān)（先接通電源開關(guān)（POWER），）， 5秒鐘后再按下氙燈點(diǎn)燈按鈕，當(dāng)秒鐘后再按下氙燈點(diǎn)燈按鈕，當(dāng)氙燈點(diǎn)燃后，再接通主開關(guān)（氙燈點(diǎn)燃后，再接通主開關(guān)（MAIN）。此時(shí)主開關(guān)上方綠色指示）。此時(shí)主開關(guān)上方綠色指示燈連續(xù)

15、閃動(dòng)三下。燈連續(xù)閃動(dòng)三下。q接通電腦及打印機(jī)電源，接通電腦及打印機(jī)電源，Win98開始建立，隨后開始建立，隨后F-4500操作界面自操作界面自動(dòng)進(jìn)入。動(dòng)進(jìn)入。q按界面提示選擇操作方式。按界面提示選擇操作方式。n關(guān)機(jī)順序：關(guān)機(jī)順序：q逆開機(jī)順序?qū)嵤┎僮鳌Ｄ骈_機(jī)順序?qū)嵤┎僮?。q當(dāng)電源開關(guān)關(guān)閉后當(dāng)電源開關(guān)關(guān)閉后5秒鐘，再次接通秒鐘，再次接通10分鐘。（目的是僅讓風(fēng)扇工分鐘。（目的是僅讓風(fēng)扇工作，使燈室散熱）最后關(guān)閉電源開關(guān)。作，使燈室散熱）最后關(guān)閉電源開關(guān)。日立日立F-4500F-4500熒光分光光度計(jì)簡(jiǎn)易操作方法熒光分光光度計(jì)簡(jiǎn)易操作方法三、熒光分析方法與應(yīng)用三、熒光分析方法與應(yīng)用1. 1. 特點(diǎn)

16、特點(diǎn)（1 1）靈敏度高）靈敏度高 比紫外比紫外- -可見分光光度法高可見分光光度法高2 24 4個(gè)數(shù)量級(jí)；為什么？個(gè)數(shù)量級(jí)；為什么？ 檢測(cè)下限：檢測(cè)下限：0.10.10.10.1 g/cmg/cm-3-3 相對(duì)靈敏度：相對(duì)靈敏度：0.05mol/L 0.05mol/L 奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。（2 2）選擇性強(qiáng)）選擇性強(qiáng) 既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3 3）試樣量少）試樣量少 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小應(yīng)用范圍小。2.2.定量依據(jù)與方法定量依據(jù)與方法(1)定量依據(jù)定量依據(jù) 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度 If正比于吸收的光量正比

17、于吸收的光量Ia和熒光量子效率和熒光量子效率 ： If = Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后： If = 2.3 I0 l c = Kc（2 2）定量方法）定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法： 配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；比較法：比較法： 在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較；3.3.熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法的應(yīng)用(1)(1)無機(jī)化合物的分析無機(jī)化合物的分析 與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法； 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳