腫瘤動物模型和抗腫瘤藥物的研究方法

1、1第四章第四章腫瘤動物模型和抗腫瘤腫瘤動物模型和抗腫瘤藥物的研究方法藥物的研究方法2惡性腫瘤惡性腫瘤常見病、多發(fā)病常見病、多發(fā)病全世界每年全世界每年700700萬死亡；占歐美死亡第二位萬死亡；占歐美死亡第二位我國城市居民第一位，農(nóng)村第三位我國城市居民第一位，農(nóng)村第三位惡性腫瘤惡性腫瘤人類健康重要人類健康重要殺手殺手345第一節(jié)第一節(jié) 自發(fā)性腫瘤動物模型自發(fā)性腫瘤動物模型6 一、自發(fā)性乳腺癌模型一、自發(fā)性乳腺癌模型 生長在體表生長在體表, ,易早期發(fā)現(xiàn)易早期發(fā)現(xiàn), ,罕有自發(fā)消退罕有自發(fā)消退, ,因而因而能準確觀察其大小與生長速度能準確觀察其大小與生長速度, ,便于進行實驗。便于進行實驗。7 現(xiàn)

2、介紹三種自發(fā)性乳腺癌小鼠模型現(xiàn)介紹三種自發(fā)性乳腺癌小鼠模型C3H小鼠：小鼠：繁殖用雌鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率為繁殖用雌鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率為 85%85%100%100%。 A系小鼠：系小鼠： 經(jīng)產(chǎn)雌鼠乳腺腫瘤發(fā)生率為經(jīng)產(chǎn)雌鼠乳腺腫瘤發(fā)生率為30%30%80%80%。 CBA小鼠小鼠：雌鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率為雌鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率為60%60%65%65%。 8 在乳腺左右兩側及乳頭部均可發(fā)生腫瘤。每在乳腺左右兩側及乳頭部均可發(fā)生腫瘤。每只小鼠常見只小鼠常見1 1個以上腫瘤。選擇腫瘤數(shù)目和大小個以上腫瘤。選擇腫瘤數(shù)目和大小相近的動物相近的動物, , 配對分組配對分組, ,給予受試藥給予受試藥, ,

3、觀察受試觀察受試藥對腫瘤發(fā)展的影響。藥對腫瘤發(fā)展的影響。 給藥方案和給藥途徑可根據(jù)受試藥物的特給藥方案和給藥途徑可根據(jù)受試藥物的特點確定。因自發(fā)性乳腺癌發(fā)展較緩慢，故采用點確定。因自發(fā)性乳腺癌發(fā)展較緩慢，故采用間歇給藥或小劑量連續(xù)給藥較為合適。間歇給藥或小劑量連續(xù)給藥較為合適。 9 結果判定結果判定 給藥后每天觀察腫瘤生長情況，記錄發(fā)生時給藥后每天觀察腫瘤生長情況，記錄發(fā)生時間和位置。間和位置。腫瘤結節(jié)長到一定程度腫瘤結節(jié)長到一定程度, ,每周用每周用腳規(guī)腳規(guī)測量皮下測量皮下腫瘤腫瘤2 2次。測定腫塊的最大徑次。測定腫塊的最大徑(a)(a)和最小徑和最小徑( (b)b)。10 將將腫瘤體積腫瘤

4、體積變化對變化對時間時間作出生長曲線作出生長曲線, ,可由曲可由曲線的斜率變化判斷藥物抑制腫瘤生長的作用線的斜率變化判斷藥物抑制腫瘤生長的作用, ,尤尤其應觀察腫瘤能否完全消退。其應觀察腫瘤能否完全消退。111 1. .在同一品系內(nèi)在同一品系內(nèi), ,發(fā)病率比較穩(wěn)定發(fā)病率比較穩(wěn)定, ,而不同品而不同品系間差別甚大。系間差別甚大。 2 2. .動物乳腺癌發(fā)生與遺傳基因、乳癌因子動物乳腺癌發(fā)生與遺傳基因、乳癌因子( (即致乳癌病毒即致乳癌病毒) )及激素有關。及激素有關。3 3. .飼料的變更有明顯影響飼料的變更有明顯影響, ,要用固定全價營養(yǎng)要用固定全價營養(yǎng)飼料。飼料。 4 4. .配對分組。配對

5、分組。12 二、二、AKR白血病模型白血病模型 13 14 自發(fā)性腫瘤的總體評價自發(fā)性腫瘤的總體評價 15第二節(jié)第二節(jié) 誘發(fā)性腫瘤動物模型誘發(fā)性腫瘤動物模型16 基本原理基本原理 17 一、誘發(fā)性腫瘤動物模型的基本方法一、誘發(fā)性腫瘤動物模型的基本方法18常用的致癌物給予方法和途徑常用的致癌物給予方法和途徑 1 1. .涂抹法涂抹法: : 涂抹在背部及耳部皮膚涂抹在背部及耳部皮膚, ,主要用主要用于誘發(fā)皮膚腫瘤。于誘發(fā)皮膚腫瘤。 2 2. .經(jīng)口給藥法：經(jīng)口給藥法：通過飲水、飼料或灌喂動通過飲水、飼料或灌喂動物。常用于食道癌、胃癌及大腸癌等。物。常用于食道癌、胃癌及大腸癌等。 3 3. .注射法

6、：注射法：致癌物制成溶液致癌物制成溶液, ,經(jīng)皮下、肌內(nèi)、經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈或體腔等途徑注入體內(nèi)靜脈或體腔等途徑注入體內(nèi), ,本法較常用。本法較常用。19常用的致癌物給予方法和途徑常用的致癌物給予方法和途徑 4 4. .氣管注入法：氣管注入法：常用于誘發(fā)肺癌。常用于誘發(fā)肺癌。 5 5. .穿線法：穿線法：將致癌物置于無菌試管內(nèi)將致癌物置于無菌試管內(nèi), ,加加熱使之液化熱使之液化, ,吸附于預制的線結上吸附于預制的線結上, ,再將此線再將此線結穿入靶組織而誘發(fā)腫瘤。結穿入靶組織而誘發(fā)腫瘤。 6 6. .埋藏法：埋藏法：包埋于皮下或其他組織內(nèi)。包埋于皮下或其他組織內(nèi)。20二、誘發(fā)性腫瘤模型的動物和

7、致癌物二、誘發(fā)性腫瘤模型的動物和致癌物動物：動物：大鼠，小鼠，犬等大鼠，小鼠，犬等致癌物：致癌物：多環(huán)碳氫類多環(huán)碳氫類亞硝胺類亞硝胺類偶氮類偶氮類黃曲霉毒素黃曲霉毒素 （飼料中含（飼料中含0 0.001.0010.015ppm0.015ppm黃曲霉毒素黃曲霉毒素B1, B1, 喂喂養(yǎng)養(yǎng)6 6個月個月, ,誘發(fā)大鼠肝癌）。誘發(fā)大鼠肝癌）。 ppm = parts per million2122 誘發(fā)性腫瘤模型的總體評價誘發(fā)性腫瘤模型的總體評價 232425262728 移植性腫瘤常用的動物為小鼠、大鼠和地鼠。移植性腫瘤常用的動物為小鼠、大鼠和地鼠。研究藥物的抗腫瘤作用可選擇三種或三種以上小研究藥

8、物的抗腫瘤作用可選擇三種或三種以上小鼠、大鼠的移植性腫瘤進行實驗治療；抗腫瘤藥鼠、大鼠的移植性腫瘤進行實驗治療；抗腫瘤藥物篩選時，每批動物的來源應一致；物篩選時，每批動物的來源應一致；一、動物的選擇一、動物的選擇29 根據(jù)瘤株的特點選用近交系、遠交系或根據(jù)瘤株的特點選用近交系、遠交系或F1F1動動物；雌雄性動物均可應用物；雌雄性動物均可應用( (乳腺癌等必須用雌性乳腺癌等必須用雌性動物動物) )。 每批實驗只用同一性別動物。每批實驗只用同一性別動物。 小鼠體重小鼠體重181822g22g，大鼠體重，大鼠體重505070g70g 每組至少每組至少1010只動物，裸鼠可用只動物，裸鼠可用5 510

9、10只。只。30二、腫瘤細胞的選擇二、腫瘤細胞的選擇 復制移植性腫瘤模型需要使用腫瘤細胞株復制移植性腫瘤模型需要使用腫瘤細胞株( (瘤株，瘤株，tumor strain)tumor strain)或細胞系或細胞系(cell line)(cell line)。 細胞株細胞株(cell strain)(cell strain)是指通過選擇法或克是指通過選擇法或克隆法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊隆法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化性質(zhì)或特異標記的細胞群。遺傳、生化性質(zhì)或特異標記的細胞群。31 瘤株瘤株的組織學類型和生長特征趨于穩(wěn)定，并的組織學類型和生長特征趨于穩(wěn)定，并能在同系、

10、同種或異種動物體內(nèi)移植并連續(xù)傳代。能在同系、同種或異種動物體內(nèi)移植并連續(xù)傳代。 生長特征，包括接種成活率、生長速度、自生長特征，包括接種成活率、生長速度、自動消退率、宿主壽命與宿主反應等。動消退率、宿主壽命與宿主反應等。 細胞系：細胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世細胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世系所組成。系所組成。 32 目前，動物移植性實驗腫瘤（包括實體瘤、目前，動物移植性實驗腫瘤（包括實體瘤、腹水瘤和白血病）約腹水瘤和白血?。┘s500500種，還有大量人的瘤種，還有大量人的瘤株或細胞系。常用的動物移植性腫瘤瘤

11、株或細株或細胞系。常用的動物移植性腫瘤瘤株或細胞系有：胞系有： 33肉瘤肉瘤S180S180腹水型或?qū)嶓w型腹水型或?qū)嶓w型艾氏腹水癌或?qū)嶓w型艾氏腹水癌或?qū)嶓w型肝癌腹水型（肝癌腹水型（HepAHepA）或?qū)嶓w型（）或?qū)嶓w型（H22H22） 小鼠白血病小鼠白血病L1210L1210、P388P388及及L615L615小鼠黑色素瘤（小鼠黑色素瘤（B16B16） 小鼠小鼠LewisLewis肺癌肺癌 肉瘤肉瘤S37S37結腸癌結腸癌C38C38、結腸癌、結腸癌C26C26 子宮頸癌（子宮頸癌（U14U14）大鼠大鼠WalkerWalker癌肉瘤癌肉瘤256256（W256W256）34 篩選抗癌藥物時

12、，最好選用篩選抗癌藥物時，最好選用3 3類瘤株，即肉瘤、類瘤株，即肉瘤、腹水型腫瘤和白血病株。在眾多移植性腫瘤中，腹水型腫瘤和白血病株。在眾多移植性腫瘤中，目前最受重視和應用最廣的是：目前最受重視和應用最廣的是： 小鼠小鼠LewisLewis肺癌肺癌 小鼠黑色素瘤小鼠黑色素瘤B16B16 小鼠白血病小鼠白血病P388P388 瘤株或細胞系的選擇應盡量考慮與臨床擬研瘤株或細胞系的選擇應盡量考慮與臨床擬研究腫瘤的性質(zhì)、部位等相近，如擬研究肝癌的究腫瘤的性質(zhì)、部位等相近，如擬研究肝癌的治療，可首選肝癌瘤株。治療，可首選肝癌瘤株。 35 一種藥物不一定對各種類型移植性腫瘤都有效，一種藥物不一定對各種類

13、型移植性腫瘤都有效，如果僅選一種瘤株進行藥物篩選就可能出現(xiàn)漏篩。如果僅選一種瘤株進行藥物篩選就可能出現(xiàn)漏篩。 還必須指出，動物腫瘤的生物學特點與人類腫瘤還必須指出，動物腫瘤的生物學特點與人類腫瘤有較大差別，對動物腫瘤生長有抑制作用的藥物對有較大差別，對動物腫瘤生長有抑制作用的藥物對人類腫瘤未必有效。人類腫瘤未必有效。36 ( (一一) )一般要求一般要求 整個操作應在整個操作應在無菌條件下無菌條件下進行，可在無菌室進行，可在無菌室和超凈工作臺內(nèi)操作。動物處死后消毒皮膚，對和超凈工作臺內(nèi)操作。動物處死后消毒皮膚，對每個實體瘤應每個實體瘤應分別分別使用滅菌的外科器械切取，對使用滅菌的外科器械切取，

14、對腹水瘤則應腹水瘤則應分別分別用滅菌的注射器抽吸。用滅菌的注射器抽吸。 37 瘤塊污染瘤塊污染常是接種失敗的主要原因，應特常是接種失敗的主要原因，應特別注意別注意!在高溫季節(jié)操作時，可在盛有瘤源的在高溫季節(jié)操作時，可在盛有瘤源的器皿周圍放置冰塊直接降溫。器皿周圍放置冰塊直接降溫。 常用接種部位：常用接種部位： 實體瘤實體瘤_腋窩皮下腋窩皮下 肌肉接種肌肉接種_大腿肌肉大腿肌肉 腹水型腫瘤腹水型腫瘤_腹腔腹腔 38 （以以實體瘤實體瘤為例為例）-39 選取接種后選取接種后7 710d10d生長狀態(tài)良好生長狀態(tài)良好的瘤源動物，頸椎脫臼處死，消毒操作部位皮膚。的瘤源動物，頸椎脫臼處死，消毒操作部位皮

15、膚。切開皮膚，剝離出瘤塊，置于平皿上切開皮膚，剝離出瘤塊，置于平皿上, ,平皿應放置在平皿應放置在冰塊上冰塊上, ,內(nèi)置少許滅菌的內(nèi)置少許滅菌的PBSPBS或其他營養(yǎng)液或其他營養(yǎng)液, ,剔除非剔除非腫瘤組織和壞死組織，選取生長良好而無變性壞死、腫瘤組織和壞死組織，選取生長良好而無變性壞死、淡紅色、魚肉狀的瘤組織，在無菌平皿內(nèi)剪成淡紅色、魚肉狀的瘤組織，在無菌平皿內(nèi)剪成2 2mm3 3的小塊。的小塊。 黑色素瘤則呈黑色或黑紫色黑色素瘤則呈黑色或黑紫色 注意不用瘤中央的壞死部分注意不用瘤中央的壞死部分40-3- 縮短接種操作時間縮短接種操作時間, ,從瘤塊取材到接種完畢一般從瘤塊取材到接種完畢一般

16、應在應在3030minmin內(nèi)；平皿內(nèi)放置少許滅菌內(nèi)；平皿內(nèi)放置少許滅菌PBSPBS或其他營養(yǎng)或其他營養(yǎng)液；接種部位皮膚應先消毒。液；接種部位皮膚應先消毒。41(3)(3) 如每次需要接種的動物數(shù)量較多時，可用瘤細胞如每次需要接種的動物數(shù)量較多時，可用瘤細胞懸液接種懸液接種: :- 每只動物接種每只動物接種0.2ml；整個操作應在；整個操作應在30min內(nèi)完成；每內(nèi)完成；每次抽吸前應將細胞混勻。次抽吸前應將細胞混勻。42 (4)(4) 對數(shù)生長細胞對數(shù)生長細胞胰酶消化胰酶消化PBSPBS洗滌洗滌2 2次次計計數(shù)活細胞數(shù)數(shù)活細胞數(shù)用生理鹽水稀釋成細胞懸液用生理鹽水稀釋成細胞懸液細細胞懸液置于冰上

17、胞懸液置于冰上注射到接種部位注射到接種部位(0.2ml,(0.2ml,含含1 110106 61 110107 7個細胞個細胞) )。 43 頸椎脫臼處死頸椎脫臼處死-若用幾只動物作為瘤源動物時若用幾只動物作為瘤源動物時, ,應將腹水混合應將腹水混合. .4445 另取小量腹水另取小量腹水, ,置于加有肝素的干試管內(nèi)置于加有肝素的干試管內(nèi), ,作為作為觀察細胞形態(tài)及細胞計數(shù)用。觀察細胞形態(tài)及細胞計數(shù)用。 將空針中剩余的腹水制備推片將空針中剩余的腹水制備推片, ,瑞氏染色瑞氏染色, ,鏡下鏡下進行細胞分類計數(shù)進行細胞分類計數(shù), ,其中瘤細胞數(shù)應其中瘤細胞數(shù)應95%95%。 抽出的腹水應為抽出的腹

18、水應為乳白色乳白色濃稠液體濃稠液體, ,若為黃色或若為黃色或含有大量紅細胞時應棄去。含有大量紅細胞時應棄去。46 (2)細胞計數(shù)：細胞計數(shù)： 取肝素管內(nèi)的瘤細胞取肝素管內(nèi)的瘤細胞, ,用生理鹽水稀釋用生理鹽水稀釋1010倍倍; ;取稀釋取稀釋液液0 0.9ml,.9ml,加加0 0.2%.2%臺盼藍生理鹽水溶液臺盼藍生理鹽水溶液0 0.1ml.1ml混勻?；靹?。用血細胞計數(shù)法計數(shù)瘤細胞總數(shù)和死細胞數(shù)。用血細胞計數(shù)法計數(shù)瘤細胞總數(shù)和死細胞數(shù)。 瘤細胞死亡后，細胞膜通透性發(fā)生改變，細胞可瘤細胞死亡后，細胞膜通透性發(fā)生改變，細胞可被臺盼藍染成藍色被臺盼藍染成藍色, , 而活細胞不著色。而活細胞不著色

19、。4748 計數(shù)計數(shù)板四角大方格內(nèi)的細胞數(shù)計數(shù)計數(shù)板四角大方格內(nèi)的細胞數(shù), , 計數(shù)時對計數(shù)時對壓邊線的細胞壓邊線的細胞, ,計計左不計右左不計右, ,計計上不計下上不計下。計數(shù)四。計數(shù)四個大方格內(nèi)的細胞總數(shù)個大方格內(nèi)的細胞總數(shù), ,然后按下列公式計算總然后按下列公式計算總細胞數(shù)和活細胞總數(shù)。細胞數(shù)和活細胞總數(shù)。 四大方格細胞總數(shù)死細胞數(shù)四大方格細胞總數(shù)死細胞數(shù)活細胞數(shù)活細胞數(shù)/ml/ml懸液懸液 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)1000010000 4 4 49 (3) 接種：接種： 腹水用含葡萄糖的無菌腹水用含葡萄糖的無菌HanksHanks液稀釋至適當?shù)囊合♂屩吝m當?shù)臐舛葷舛? , 每只鼠腹腔注入每只鼠

20、腹腔注入0 0.1.10.2ml0.2ml。整個操作應。整個操作應在在6060minmin內(nèi)完成。內(nèi)完成。50 腹水型白血病如腹水型白血病如L1210L1210及及P388P388的接種方法同腹的接種方法同腹水型腫瘤接種法。水型腫瘤接種法。51 四、腫瘤細胞的凍存與復蘇四、腫瘤細胞的凍存與復蘇 為了使腫瘤細胞能得以長期使用，防止退化為了使腫瘤細胞能得以長期使用，防止退化或變異，保存不同代細胞的特征，對腫瘤細胞或或變異，保存不同代細胞的特征，對腫瘤細胞或瘤株進行冷凍保存是很必要的。一般在液氮中凍瘤株進行冷凍保存是很必要的。一般在液氮中凍存存1 12 2年，細胞存活率可達年，細胞存活率可達80%8

21、0%90%90%。 52 1.1.凍存方法凍存方法 取對數(shù)生長期增殖細胞，在凍存前一天最好取對數(shù)生長期增殖細胞，在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。經(jīng)胰蛋白酶消化、離心、洗滌，換一次培養(yǎng)液。經(jīng)胰蛋白酶消化、離心、洗滌，用含用含7 7份份培養(yǎng)液、培養(yǎng)液、2 2份份小牛血清、小牛血清、1 1份份DMSODMSO配成配成(1(15)5)10106 6個個/ml/ml的細胞懸液，轉入細胞凍存管，的細胞懸液，轉入細胞凍存管，貼上標簽，注明細胞來源、名稱及凍存日期。貼上標簽，注明細胞來源、名稱及凍存日期。 53 一般將凍存管一般將凍存管: : 4-30min4-30min；20-4h20-4h；70-70-過夜

22、過夜-然然后入液氮。后入液氮。 可將凍存管懸掛液氮罐口處過夜，之后浸入液可將凍存管懸掛液氮罐口處過夜，之后浸入液氮中。氮中。 可用可用2cm2cm厚脫脂棉將凍存管嚴密包裹厚脫脂棉將凍存管嚴密包裹, ,20203030過夜，然后除去脫脂棉直接放入液氮中。過夜，然后除去脫脂棉直接放入液氮中。 54 2.2.凍存細胞的復蘇方法凍存細胞的復蘇方法 從液氮罐中取出凍存管，迅速放入從液氮罐中取出凍存管，迅速放入38 38 4040水浴中，并不停搖動使其在水浴中，并不停搖動使其在1min1min內(nèi)全部融內(nèi)全部融化，化，500500800r/min800r/min離心離心5min5min，棄上清，加入培，棄上

23、清，加入培養(yǎng)液，轉入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，養(yǎng)液，轉入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，以后按常規(guī)培養(yǎng)。以后按常規(guī)培養(yǎng)。 55 細胞凍存及復蘇的原則是細胞凍存及復蘇的原則是“慢凍快融慢凍快融”，標標準的冷凍速度是每分鐘準的冷凍速度是每分鐘1122，到，到7070以下時可迅速放入液氮中。以下時可迅速放入液氮中。 所凍存的細胞必須是所凍存的細胞必須是對數(shù)生長期對數(shù)生長期的細胞，細的細胞，細胞密度應在胞密度應在10106 6個個/ml/ml以上。以上。56第四節(jié)第四節(jié)人體腫瘤異種移植性腫瘤模型人體腫瘤異種移植性腫瘤模型 57 異種移植性腫瘤是移植性腫瘤的一種，近年很異種移植性腫瘤是移植性腫瘤的一種

24、，近年很重視人體腫瘤的動物體內(nèi)移植模型。因為這種模重視人體腫瘤的動物體內(nèi)移植模型。因為這種模型使用人的腫瘤細胞，在組織形態(tài)和遺傳特征等型使用人的腫瘤細胞，在組織形態(tài)和遺傳特征等方面，均與人類腫瘤相同，故用這種模型可以比方面，均與人類腫瘤相同，故用這種模型可以比較直接研究人類腫瘤的生物學特性及抗腫瘤藥物。較直接研究人類腫瘤的生物學特性及抗腫瘤藥物。58 由于異種移植的移植排斥反應?？蓪е乱浦彩в捎诋惙N移植的移植排斥反應常可導致移植失敗，故選擇適合的受體動物是移植成功的關鍵。敗，故選擇適合的受體動物是移植成功的關鍵。常用的宿主動物主要有常用的宿主動物主要有裸小鼠裸小鼠和和C57BL/6C57BL/

25、6小鼠小鼠，也，也可用免疫抑制劑或放射線等降低動物的免疫功能可用免疫抑制劑或放射線等降低動物的免疫功能后，再進行移植。后，再進行移植。59 一、裸小鼠作為移植宿主一、裸小鼠作為移植宿主 裸小鼠裸小鼠是在是在SPFSPF屏障系統(tǒng)內(nèi)繁殖生長的屏障系統(tǒng)內(nèi)繁殖生長的BALB/cBALB/c裸小鼠，裸小鼠，6 68 8周齡，體重周齡，體重212122g22g。 瘤源瘤源 人體腫瘤細胞的來源大致可分為兩類，人體腫瘤細胞的來源大致可分為兩類，一類一類是是人的腫瘤細胞株人的腫瘤細胞株( (系系) )；另一類另一類是源于人體腫瘤組是源于人體腫瘤組織塊的癌細胞?？棄K的癌細胞。 常用人癌裸鼠移植的細胞株常用人癌裸鼠

26、移植的細胞株(系系)、接種方式和、接種方式和最佳生長期見教材。最佳生長期見教材。 60 二、免疫功能抑制的大鼠作為移植宿主二、免疫功能抑制的大鼠作為移植宿主 由于裸鼠嬌弱，飼養(yǎng)條件要求高，費用昂貴，由于裸鼠嬌弱，飼養(yǎng)條件要求高，費用昂貴，故用裸鼠復制人體腫瘤異種移植腫瘤模型較難普故用裸鼠復制人體腫瘤異種移植腫瘤模型較難普遍應用。遍應用。 使用免疫功能受抑制的大鼠接種人癌細胞，可使用免疫功能受抑制的大鼠接種人癌細胞，可獲得人癌動物模型。獲得人癌動物模型。 先皮下注射阿糖胞苷，先皮下注射阿糖胞苷，2d2d后用后用10Gy 10Gy 6060CoCo全身全身照射。照射。 61第五節(jié)第五節(jié)抗腫瘤藥物體

27、內(nèi)研究方法抗腫瘤藥物體內(nèi)研究方法62 基本步驟是基本步驟是: : 低溫保存瘤細胞低溫保存瘤細胞速融速融加冷加冷培養(yǎng)液洗除凍存液培養(yǎng)液洗除凍存液用培養(yǎng)液將腫瘤細胞調(diào)至一用培養(yǎng)液將腫瘤細胞調(diào)至一定濃度定濃度給特定動物給特定動物 ( (宿主宿主) )注射注射 ( (ipip或或scsc) )。 腫瘤細胞在宿主動物體內(nèi)增殖后腫瘤細胞在宿主動物體內(nèi)增殖后取出取出給給實驗動物實驗動物( (受體動物受體動物) )進行接種進行接種( (荷瘤動物荷瘤動物) )。不同腫瘤的宿主動物、取用腫瘤的時間及接種方法見不同腫瘤的宿主動物、取用腫瘤的時間及接種方法見表表4-14-1。63 一、實體瘤一、實體瘤() 分組給藥分

28、組給藥 接種次日將動物隨機分組：接種次日將動物隨機分組：實驗對照組實驗對照組(C)(C)：接種腫瘤細胞不給受試藥，：接種腫瘤細胞不給受試藥，只給受試藥相應的溶劑只給受試藥相應的溶劑受試藥組受試藥組(T)(T)：設高、中、低：設高、中、低3 3個劑量個劑量（給藥（給藥1 1次次或或數(shù)次數(shù)次，給藥途徑應與推薦臨床用藥給藥途徑應與推薦臨床用藥的途徑相同，靜脈給藥者可用腹腔注射代替）。的途徑相同，靜脈給藥者可用腹腔注射代替）。 陽性對照藥：對瘤株活性高的已知抗腫瘤藥陽性對照藥：對瘤株活性高的已知抗腫瘤藥 64 對對S180 , 艾氏腹水癌實體型艾氏腹水癌實體型 可用環(huán)磷?？捎铆h(huán)磷酰胺胺20 30 mg

29、 /(kg .d) 對對L615 可用可用5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶25mg /(kg.d) 對其他腹水型腫瘤一般用絲裂霉素對其他腹水型腫瘤一般用絲裂霉素 2mg / (kg.d) 對對W256 可用絲裂霉素可用絲裂霉素4mg/ (kg.d)+環(huán)磷酰環(huán)磷酰胺胺20 30mg/(kg.d )65 療效評價療效評價 停藥停藥2424h h后處死動物后處死動物, ,稱體重稱體重, ,剝離瘤塊剝離瘤塊, , 稱瘤稱瘤重。受試藥物對實體瘤的療效以重。受試藥物對實體瘤的療效以瘤重抑制率瘤重抑制率表示：表示： CT 瘤重抑制率瘤重抑制率 (%)= 100% C 式中式中T:T:受試藥物組平均瘤重受試藥物組平均瘤重

30、; ; C:C:實驗對照組實驗對照組 ( (模型組模型組, ,荷瘤未用藥動物荷瘤未用藥動物) ) 平均瘤重。平均瘤重。 ( (瘤重抑制率瘤重抑制率%=%=(1 1T/C)T/C)100%100%計算）計算）66 觀察瘤重抑制率時，要求實驗對照組小鼠觀察瘤重抑制率時，要求實驗對照組小鼠瘤重均值瘤重均值不得低于不得低于1g1g（大鼠瘤重均值不得低于（大鼠瘤重均值不得低于2g2g），否則表示腫瘤生長不良，實驗作廢。），否則表示腫瘤生長不良，實驗作廢。 給藥組動物平均體重下降（給藥前后自身比給藥組動物平均體重下降（給藥前后自身比較）不得超過較）不得超過15%15%，動物死亡數(shù)不得超過，動物死亡數(shù)不得超

31、過20%20%，否，否則表示受試藥有毒性反應，應減少劑量重新實驗。則表示受試藥有毒性反應，應減少劑量重新實驗。67 若若中草藥中草藥瘤重抑制率大于瘤重抑制率大于30%30%，合成藥合成藥大于大于40%40%，且與實驗對照組比較具有統(tǒng)計學意義，重，且與實驗對照組比較具有統(tǒng)計學意義，重復復3 3次，療效均穩(wěn)定，則評定該受試藥具有一定次，療效均穩(wěn)定，則評定該受試藥具有一定抗腫瘤作用?？鼓[瘤作用。68 注意事項注意事項 實驗中如果幾個藥給藥組共用一個實驗對照實驗中如果幾個藥給藥組共用一個實驗對照組時，后者的動物數(shù)應適當增加組時，后者的動物數(shù)應適當增加, ,公式為公式為: : C CG GM M。 式中

32、式中C=C=實驗對照組動物數(shù)；實驗對照組動物數(shù)；G=G=同時試驗的化同時試驗的化合物數(shù)或同時試驗的藥物數(shù)；合物數(shù)或同時試驗的藥物數(shù)；M=M=給藥組的動物數(shù)。給藥組的動物數(shù)。 如試驗的藥物數(shù)如試驗的藥物數(shù)G G為為2 2，各給藥組，各給藥組M M均為均為1010，故，故C C2 21010，實驗對照組的動物數(shù)為，實驗對照組的動物數(shù)為2020。69 二、腹水型腫瘤二、腹水型腫瘤() 分組給藥分組給藥 于接種后次日將動物隨機分組并開始給藥，于接種后次日將動物隨機分組并開始給藥，受試藥設高、中、低受試藥設高、中、低3 3個劑量組，口服或腹腔注個劑量組，口服或腹腔注射給藥，連續(xù)給藥射給藥，連續(xù)給藥5 5

33、1010次。次。70 療效評價療效評價 接種后觀察和記錄動物接種后觀察和記錄動物死亡時間死亡時間和和生存天數(shù)生存天數(shù)。實驗對照組動物通常在實驗對照組動物通常在2 23 3周內(nèi)全部死亡。如實周內(nèi)全部死亡。如實驗對照組中驗對照組中20%20%動物存活超過動物存活超過4 4周，表明腫瘤生周，表明腫瘤生長不良，實驗作廢。長不良，實驗作廢。 如給藥治療期間實驗對照組動物于如給藥治療期間實驗對照組動物于7d7d內(nèi)死亡內(nèi)死亡率率20%20%，表示腫瘤生長過快，實驗失敗。，表示腫瘤生長過快，實驗失敗。 71 腹水瘤以荷瘤動物的腹水瘤以荷瘤動物的生命延長時間生命延長時間作為療作為療效指標，計算每組動物的平均存活

34、時間，給藥效指標，計算每組動物的平均存活時間，給藥組與實驗對照組的平均生存天數(shù)之比組與實驗對照組的平均生存天數(shù)之比(T/C)%(T/C)%大于大于125%125%為有效。為有效。 在接種后在接種后60d60d分別記錄給藥組和實驗對照組動分別記錄給藥組和實驗對照組動物的平均生存時間物的平均生存時間( (如果生存超過如果生存超過60d60d，按，按60d60d計計算算) )，按下列公式計算生命延長率：，按下列公式計算生命延長率： 72 式中式中: :T T為受試藥物組平均生存天數(shù)；為受試藥物組平均生存天數(shù)； C C為實驗對照組平均生存天數(shù)。為實驗對照組平均生存天數(shù)。 T C 生命延長率生命延長率(

35、 %) 100% C73 若若腹腔注射給藥時腹腔注射給藥時生命延長率生命延長率75%75%，非腹腔非腹腔注射給藥注射給藥生命延長率生命延長率50%50%，且與實驗對照組比，且與實驗對照組比較具有統(tǒng)計學意義，重復較具有統(tǒng)計學意義，重復3 3次，療效穩(wěn)定，則評次，療效穩(wěn)定，則評定該受試藥具有一定抗腫瘤作用。定該受試藥具有一定抗腫瘤作用。74 注意事項注意事項 1. 1.關于幾個給藥組共用一個實驗對照組時關于幾個給藥組共用一個實驗對照組時, ,實驗實驗對照組的動物數(shù)，同實體瘤。對照組的動物數(shù)，同實體瘤。 2. 2.實驗開始及結束時應分別稱動物體重，若給實驗開始及結束時應分別稱動物體重，若給藥組動物體

36、重明顯低于實驗對照組時藥組動物體重明顯低于實驗對照組時( (如超過如超過15%)15%)，判定療效時應注意體重降低對腫瘤生長的影響，排判定療效時應注意體重降低對腫瘤生長的影響，排除非特異的毒性作用。除非特異的毒性作用。 3. 3.腹水型腫瘤的研究方法腹水型腫瘤的研究方法, ,也適用于腹水型白血也適用于腹水型白血病，如病，如L1210L1210及及P388P388。 75 三、移植性腫瘤研究方法的應用三、移植性腫瘤研究方法的應用 ( (一一) )肉瘤肉瘤S180S180模型（實體瘤）模型（實體瘤）( () ) 小鼠肉瘤小鼠肉瘤S180(sarcoma180)S180(sarcoma180)是經(jīng)典

37、的動物腫是經(jīng)典的動物腫瘤模型之一，在抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選中被廣泛應瘤模型之一，在抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選中被廣泛應用。用。S180S180有實體型和腹水型兩種生長形式，可以有實體型和腹水型兩種生長形式，可以以一種形式傳代，實體型與腹水型可互轉。以一種形式傳代，實體型與腹水型可互轉。 76 操作步驟操作步驟 1.1. 取接種在昆明小鼠約取接種在昆明小鼠約7 71010d d的的S180S180腫瘤腫瘤剔除腫瘤包膜和壞死部分剔除腫瘤包膜和壞死部分置于玻璃勻漿器內(nèi)置于玻璃勻漿器內(nèi)加入生理鹽水配制成含瘤細胞為加入生理鹽水配制成含瘤細胞為(1(12)2)10107 7/ml/ml單細胞懸液單細胞懸液 接種于同種

38、異體接種于同種異體小鼠腋窩皮下小鼠腋窩皮下, , 每只小鼠注射每只小鼠注射0.20.2ml(ml(含瘤細胞含瘤細胞2 210106 6 4 410106 6個個) )。77 2.2.接種后第接種后第1 1d d 稱體重、隨機分組并開始給藥稱體重、隨機分組并開始給藥, , 包括包括: : 實驗對照組實驗對照組 陽性對照藥組陽性對照藥組 （環(huán)磷酰胺（環(huán)磷酰胺, ,接種次日接種次日1 1次性次性ip,100mg/kgip,100mg/kg） 受試藥高劑量組受試藥高劑量組 受試藥中劑量組受試藥中劑量組 受試藥低劑量組受試藥低劑量組78 腹腔注射或灌胃給藥腹腔注射或灌胃給藥. . 給藥方案有多種。給藥方

39、案有多種。 至接種后第至接種后第11111414d, d, 稱量動物體重稱量動物體重, , 解剖腫瘤解剖腫瘤并稱重。并稱重。79 結果計算結果計算 S180 S180實體瘤生長速度與接種量成正比，一般實體瘤生長速度與接種量成正比，一般重重2.5g2.5g的腫瘤需生長的腫瘤需生長8 811d11d。根據(jù)各組動物瘤重。根據(jù)各組動物瘤重按前述公式計算按前述公式計算瘤重抑制率瘤重抑制率，并進行藥物療效評，并進行藥物療效評定。定。80 注意事項注意事項 1. 1. 本方法也適用于本方法也適用于B16B16、HepHep、W256W256和和C26C26等等實體型移植性腫瘤模型。實體型移植性腫瘤模型。 2

40、. 2. 實驗結束時實驗結束時, , 陽性對照組腫瘤基本不長陽性對照組腫瘤基本不長或長得很小或長得很小, , 即陽性對照組的抑瘤率應大于即陽性對照組的抑瘤率應大于80%80%以上以上, , 而實驗對照組動物在此期間瘤重應在而實驗對照組動物在此期間瘤重應在2 2g g左右。左右。 81 3.3.受試藥組動物體重不低于原始體重的受試藥組動物體重不低于原始體重的20%,20%,否則表示受試藥劑量過高否則表示受試藥劑量過高, , 需降低劑量重試。需降低劑量重試。 4. 4.腋窩部皮膚松弛，皮下接種后能允許腫瘤腋窩部皮膚松弛，皮下接種后能允許腫瘤生長得較大，也可接種于腹股溝部皮下。生長得較大，也可接種于

41、腹股溝部皮下。82黑色素瘤8384模型組模型組陽性藥組陽性藥組給藥組給藥組85( (二二) )大鼠大鼠W256W256癌肉瘤模型癌肉瘤模型( () )瓦克癌肉瘤瓦克癌肉瘤256256（Walker256Walker256，簡稱，簡稱W256W256）的生）的生長有實體型和腹水型兩種形式，并可互轉。接種長有實體型和腹水型兩種形式，并可互轉。接種在皮下或肌肉內(nèi)成為實體瘤在皮下或肌肉內(nèi)成為實體瘤, , 接種在腹腔則成為接種在腹腔則成為腹水瘤。在接種后開始給藥治療腹水瘤。在接種后開始給藥治療, , 實驗結束后比實驗結束后比較對照組與試驗組的瘤重或大鼠平均存活時間較對照組與試驗組的瘤重或大鼠平均存活時間

42、, , 可判斷受試藥物的療效?？膳袛嗍茉囁幬锏寞熜А?6 操作步驟操作步驟 1.1.取接種于大鼠大腿肌肉或腹腔第取接種于大鼠大腿肌肉或腹腔第7d7d、接種于、接種于皮下皮下111113d13d的的W256W256瘤瘤, , 配制成瘤細胞懸液配制成瘤細胞懸液 ( (約約2 210106 6 4 410106 6個瘤細胞個瘤細胞) )。取體重。取體重555565g Wistar65g Wistar大鼠大鼠, , 雌雄不限雌雄不限, , 每次實驗均用同一性別。每鼠每次實驗均用同一性別。每鼠大腿肌內(nèi)接種瘤細胞懸液大腿肌內(nèi)接種瘤細胞懸液0.2ml, 0.2ml, 每組用每組用6 61010只動只動物。物

43、。87 2.2.接種后第接種后第1d1d稱動物體重稱動物體重, , 隨機分組并開始隨機分組并開始給藥給藥, ,均用腹腔注射均用腹腔注射, ,每天每天1 1次次, , 連續(xù)連續(xù)7 710d,10d,至第至第8 811d11d處死動物處死動物, , 將雙側后肢從髖關節(jié)外剪下將雙側后肢從髖關節(jié)外剪下, ,分別稱重分別稱重, ,荷瘤肢體重減去對側正常肢體重即為荷瘤肢體重減去對側正常肢體重即為瘤重。瘤重。88 結果計算結果計算 按前述公式計算瘤重抑制率。按前述公式計算瘤重抑制率。 注意事項注意事項 1.1.本方法也適用于本方法也適用于S180S180及艾氏腹水瘤等腫瘤。及艾氏腹水瘤等腫瘤。 2.2.接種

44、的瘤源有兩種接種的瘤源有兩種；用腹水型瘤源用腹水型瘤源, , 傳代傳代6 68d 8d 的瘤源的瘤源( (抽出的腹水為血性抽出的腹水為血性););用皮下接種的瘤用皮下接種的瘤, , 用勻漿法制成瘤細胞懸液。用勻漿法制成瘤細胞懸液。 89 3.3.對照組肌肉型平均瘤重在對照組肌肉型平均瘤重在3 35g; 5g; 皮下腫瘤皮下腫瘤平均瘤重為平均瘤重為3 312g; 12g; 腹水型動物平均生存腹水型動物平均生存101014d14d。 4. 4.第第7d 7d 給藥組動物存活率應大于給藥組動物存活率應大于65%, 65%, 否則否則表明所試藥物劑量過大。表明所試藥物劑量過大。90 ( (三三)Lew

45、is)Lewis肺癌模型肺癌模型( () ) 19511951年年LewisLewis在未經(jīng)過處理的在未經(jīng)過處理的C57BLC57BL小鼠肺發(fā)小鼠肺發(fā)現(xiàn)了未分化上皮樣腫瘤，此后建立了實體型移現(xiàn)了未分化上皮樣腫瘤，此后建立了實體型移植性腫瘤模型。植性腫瘤模型。 91 操作步驟操作步驟 1.1.取取C57BL/6C57BL/6小鼠皮下接種小鼠皮下接種8 812d12d的的LewisLewis肺肺癌作為瘤源，無菌條件下剝離瘤組織，用剪刀癌作為瘤源，無菌條件下剝離瘤組織，用剪刀剪成小塊，用套管針移植或用玻璃勻漿器加無剪成小塊，用套管針移植或用玻璃勻漿器加無菌生理鹽水菌生理鹽水(1:3)(1:3)研磨成

46、勻漿，過研磨成勻漿，過400400目絲網(wǎng)，目絲網(wǎng)，成單細胞懸液，計數(shù)每毫升勻漿液中的瘤細胞成單細胞懸液，計數(shù)每毫升勻漿液中的瘤細胞數(shù)。數(shù)。 2.2.給每只成年給每只成年C57BL/6C57BL/6小鼠腋窩皮下接種小鼠腋窩皮下接種2 210106 6個細胞（個細胞（0.2ml/0.2ml/只）。只）。 92 3.3.接種后第接種后第1 1天進行動物分組并給藥，陽性天進行動物分組并給藥，陽性對照藥用環(huán)磷酰胺對照藥用環(huán)磷酰胺50mg/kg50mg/kg體重體重(0.2ml/10g(0.2ml/10g體體重重),),隔日灌胃給藥，共給隔日灌胃給藥，共給3 3次。給藥組每天灌次。給藥組每天灌胃給予受試藥

47、胃給予受試藥1 1次，實驗對照組給予等體積生次，實驗對照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)理鹽水，連續(xù)10d10d。 4.4.末次給藥后末次給藥后24h24h處死動物，稱體重，剝離處死動物，稱體重，剝離腋窩下腫瘤并稱重，計算瘤重生長抑制率。腋窩下腫瘤并稱重，計算瘤重生長抑制率。 93皮下移植皮下移植Lewis肺癌的肺癌的C57BL/6小鼠小鼠94Lewis肺癌移植瘤肺癌移植瘤95 模型評價模型評價 Lewis Lewis肺癌惡性程度較高，受體鼠為肺癌惡性程度較高，受體鼠為C57BL/6C57BL/6小鼠，是目前國際應用較普遍的移植腫瘤模型小鼠，是目前國際應用較普遍的移植腫瘤模型之一，由于其接種部位的不

48、同，用途比較廣泛。之一，由于其接種部位的不同，用途比較廣泛。本方法是評價藥物體內(nèi)抗腫瘤作用最常用的方本方法是評價藥物體內(nèi)抗腫瘤作用最常用的方法，對藥物作用的預測性很好。法，對藥物作用的預測性很好。 96 注意事項注意事項 1. 1.實驗開始和實驗結束時應分別稱量動物實驗開始和實驗結束時應分別稱量動物體重，如果給藥組動物體重明顯低于實驗對照體重，如果給藥組動物體重明顯低于實驗對照組（超過組（超過15%15%），判定藥物療效時應注意體重），判定藥物療效時應注意體重降低對腫瘤生長的影響，排除非特異的毒性作降低對腫瘤生長的影響，排除非特異的毒性作用。用。 2.2.腫瘤接種后腫瘤接種后2 2周，單個鼠瘤

49、重應在周，單個鼠瘤重應在500 mg500 mg以上，否則說明腫瘤生長不良，腫瘤接種失敗。以上，否則說明腫瘤生長不良，腫瘤接種失敗。 97 3.3.對某些效價較低的藥物，如未純化中草藥對某些效價較低的藥物，如未純化中草藥有效成分或多糖類的篩選，可將瘤細胞接種于后有效成分或多糖類的篩選，可將瘤細胞接種于后肢肢爪墊爪墊皮下，接種細胞數(shù)為皮下，接種細胞數(shù)為(2(24)4)10105 5/0.02ml/0.02ml（細胞數(shù)僅為常規(guī)皮下接種量的（細胞數(shù)僅為常規(guī)皮下接種量的1/31/3），接種后），接種后給藥治療，給藥治療，10d10d后從踝關節(jié)處切除帶瘤的足稱重，后從踝關節(jié)處切除帶瘤的足稱重，計算瘤重抑

50、制率。若切除帶瘤的足后繼續(xù)給藥，計算瘤重抑制率。若切除帶瘤的足后繼續(xù)給藥，還可觀察受試藥對肺轉移的療效。還可觀察受試藥對肺轉移的療效。98 ( (四四)L1210)L1210白血病小鼠模型白血病小鼠模型( () ) L1210 L1210白血病最早是用甲基膽蒽在白血病最早是用甲基膽蒽在DBA/2DBA/2小鼠小鼠誘發(fā)的，能在誘發(fā)的，能在DBA/2DBA/2小鼠及其雜交一代小鼠及其雜交一代BDF1BDF1和和CDF1CDF1小鼠體內(nèi)生長。小鼠白血病小鼠體內(nèi)生長。小鼠白血病L1210L1210為腹水型為腹水型腫瘤，是最常用的移植性腫瘤模型。腫瘤，是最常用的移植性腫瘤模型。 將將1 110105 5

51、個腹水瘤細胞接種在個腹水瘤細胞接種在DBA/2DBA/2、BDF1BDF1或或CDF1CDF1小鼠腹腔內(nèi)，接種后小鼠腹腔內(nèi)，接種后24 h24 h開始給藥治療，實開始給藥治療，實驗結束后比較給藥組與實驗對照組小鼠的平均存驗結束后比較給藥組與實驗對照組小鼠的平均存活時間，可判斷藥物的療效?；顣r間，可判斷藥物的療效。 99 操作方法操作方法 1. 1.取接種于取接種于DBA/2DBA/2小鼠約小鼠約7d7d的的L1210L1210腹水，用腹水，用生理鹽水配成瘤細胞數(shù)為生理鹽水配成瘤細胞數(shù)為10106 6個個/ml/ml的細胞懸液，的細胞懸液，接種于接種于BDF1BDF1或或CDF1CDF1小鼠腹腔

52、內(nèi)，每只小鼠接種小鼠腹腔內(nèi)，每只小鼠接種0.1ml0.1ml（含瘤細胞（含瘤細胞1 110105 5個）。個）。100 2.2.實驗當天接種動物，將瘤株進行細菌培養(yǎng)。實驗當天接種動物，將瘤株進行細菌培養(yǎng)。接種后第接種后第1 1天檢查培養(yǎng)情況，如無污染，將稱量動天檢查培養(yǎng)情況，如無污染，將稱量動物體重并隨機分組后開始給藥。接種后第物體重并隨機分組后開始給藥。接種后第2 2天再檢天再檢查培養(yǎng)情況，如有污染，則實驗報廢。查培養(yǎng)情況，如有污染，則實驗報廢。 動物分組包括實驗對照組、受試藥組及陽性對動物分組包括實驗對照組、受試藥組及陽性對照藥，均腹腔注射給藥。給藥方案有多種。第照藥，均腹腔注射給藥。給藥

53、方案有多種。第2020天如果除陽性對照藥組及受試藥組外再無其他動天如果除陽性對照藥組及受試藥組外再無其他動物存活，則終止實驗，評價結果。第物存活，則終止實驗，評價結果。第3030天處死全天處死全部動物，并評價受試藥的療效。部動物，并評價受試藥的療效。 101 結果結果 小鼠接種小鼠接種L1210L1210后平均存活后平均存活8 811d11d。一般觀察。一般觀察30d30d，根據(jù)各組動物的平均存活天數(shù)，按公式計，根據(jù)各組動物的平均存活天數(shù)，按公式計算受試藥對算受試藥對L1210L1210白血病小鼠的生命延長率（未白血病小鼠的生命延長率（未死亡動物按死亡動物按30d30d計）。計）。 102 注

54、意事項注意事項 1. 1.本方法也適用于本方法也適用于P388P388、EACEAC、HepHep、W256W256和和S180S180等腹水型移植性腫瘤模型。等腹水型移植性腫瘤模型。 2. 2.如瘤株培養(yǎng)證明被污染，需重新接種動物。如瘤株培養(yǎng)證明被污染，需重新接種動物。 3.3.接種后第接種后第5 5天給藥組動物存活率應大于天給藥組動物存活率應大于65%65%，否則說明藥物劑量過大或藥物有毒性。否則說明藥物劑量過大或藥物有毒性。 4. 4.如實驗對照組動物在如實驗對照組動物在18d18d內(nèi)仍未死亡，則認內(nèi)仍未死亡，則認為腫瘤生長不良，接種失敗，應分析原因重新實為腫瘤生長不良，接種失敗，應分析

55、原因重新實驗。驗。 103 ( (五五) )小鼠腎包膜下腫瘤移植模型小鼠腎包膜下腫瘤移植模型( () ) 在裸鼠、在裸鼠、BDF1BDF1或或CDF1CDF1小鼠的腎包膜（腎纖維小鼠的腎包膜（腎纖維膜）下移植人的瘤細胞，由于移植的瘤塊僅膜）下移植人的瘤細胞，由于移植的瘤塊僅1mm1mm3 3，可由腎包膜下豐富的血管供給營養(yǎng)和氧，瘤塊能可由腎包膜下豐富的血管供給營養(yǎng)和氧，瘤塊能迅速增長，短期內(nèi)迅速增長，短期內(nèi)(6(611d)11d)腫瘤生長較規(guī)則，接腫瘤生長較規(guī)則，接種成活率接近種成活率接近100%100%。104 操作方法操作方法 小鼠腎包膜下異種移植的腫瘤多選用人癌，小鼠腎包膜下異種移植的腫

56、瘤多選用人癌，其來源于裸鼠皮下接種傳代其來源于裸鼠皮下接種傳代161622d22d的人癌瘤株、的人癌瘤株、人癌培養(yǎng)細胞株或手術切除的新鮮癌組織。人癌培養(yǎng)細胞株或手術切除的新鮮癌組織。105 1.1.在無菌操作下取小鼠或人體瘤組織，剪去包在無菌操作下取小鼠或人體瘤組織，剪去包膜及出血壞死部分，切成約膜及出血壞死部分，切成約1mm1mm3 3小塊。選用體重小塊。選用體重181822g22g裸鼠、裸鼠、BDF1BDF1或或CDF1CDF1小鼠，麻醉后手術區(qū)消小鼠，麻醉后手術區(qū)消毒，打開腹腔暴露左腎，將毒，打開腹腔暴露左腎，將1 1小塊瘤組織裝入套管小塊瘤組織裝入套管針內(nèi)，移植于腎外側中線處的包膜下。

57、針內(nèi)，移植于腎外側中線處的包膜下。 106 2.2.在裝有顯微尺的體視顯微鏡下，測量起始移植在裝有顯微尺的體視顯微鏡下，測量起始移植塊的長徑塊的長徑(a)(a)和短徑和短徑(b)(b)，測量后關閉腹部切口。，測量后關閉腹部切口。如在腎包膜下注射培養(yǎng)的瘤細胞株，則注射含如在腎包膜下注射培養(yǎng)的瘤細胞株，則注射含1 110107 7個細胞的懸液個細胞的懸液0.02 ml0.02 ml，不必測量移植瘤塊，不必測量移植瘤塊的長短徑。的長短徑。 107 3.3.接種次日分組、給藥，每天給藥接種次日分組、給藥，每天給藥1 1次，共次，共5 510d10d。停藥次日，即。停藥次日，即BDF1BDF1小鼠接種后

58、小鼠接種后6d6d或裸鼠或裸鼠接種后接種后11d11d，稱量體重，解剖帶瘤腎臟，在體視，稱量體重，解剖帶瘤腎臟，在體視顯微鏡下測量瘤塊的長徑顯微鏡下測量瘤塊的長徑(a)(a)和短徑和短徑(b)(b)，按，按abab2 2/2/2公式計算瘤體積公式計算瘤體積(V)(V)。 4.4.腫瘤體積腫瘤體積(V)(V)也可以用下式計算：也可以用下式計算：V V(4/3)abc(4/3)abc(1/6)ABC(1/6)ABC，其中，其中為圓周率，為圓周率，ABCABC為腫瘤相互垂直的為腫瘤相互垂直的3 3個直徑，個直徑，abcabc為腫瘤相為腫瘤相互垂直的互垂直的3 3個半徑。個半徑。108109 結果計算

59、結果計算 根據(jù)每只鼠的瘤體積計算給藥組瘤體積的相當根據(jù)每只鼠的瘤體積計算給藥組瘤體積的相當率，表示受試藥對腫瘤生長的抑制作用。如給藥率，表示受試藥對腫瘤生長的抑制作用。如給藥治療后瘤體積較原接種瘤體積減小，表示腫瘤消治療后瘤體積較原接種瘤體積減小，表示腫瘤消退，受試藥治療有效，以消退率表示：退，受試藥治療有效，以消退率表示： 110 給藥組平均瘤體積給藥組平均瘤體積相當率（相當率（% %）= = 100%100% 實驗對照組平均瘤體積實驗對照組平均瘤體積 給藥后平均瘤體積給藥后平均瘤體積消退率（消退率（% %） 100%100% 原接種平均瘤體積原接種平均瘤體積111 注意事項注意事項 1.

60、1.手術切除的人體腫瘤需冰凍運送，從取出腫手術切除的人體腫瘤需冰凍運送，從取出腫瘤到接種應在瘤到接種應在4 h4 h內(nèi)完成。內(nèi)完成。 2. 2.注意無菌操作，瘤源如有污染，應終止實驗。注意無菌操作，瘤源如有污染，應終止實驗。 3. 3.瘤塊接種時應嚴格使每只鼠瘤塊的長、短徑瘤塊接種時應嚴格使每只鼠瘤塊的長、短徑控制在控制在0.90.91.2mm1.2mm。112 4.4.應嚴格控制飼養(yǎng)條件和環(huán)境，以免影響動應嚴格控制飼養(yǎng)條件和環(huán)境，以免影響動物體重增長而產(chǎn)生非特異性抑瘤作用。物體重增長而產(chǎn)生非特異性抑瘤作用。 5. 5.若給藥組動物體重下降至原體重的若給藥組動物體重下降至原體重的70%70%、