葉綠素含量的測定

1、基礎(chǔ)生物學實驗基礎(chǔ)生物學實驗精品課程精品課程葉綠素含量的測定葉綠素含量的測定基礎(chǔ)生物學實驗（三）基礎(chǔ)生物學實驗（三）基礎(chǔ)生物學實驗基礎(chǔ)生物學實驗精品課程精品課程一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?熟悉在未經(jīng)分離的葉綠體色素溶液中測定葉熟悉在未經(jīng)分離的葉綠體色素溶液中測定葉綠素綠素a和和b的方法及其計算。的方法及其計算。 基礎(chǔ)生物學實驗基礎(chǔ)生物學實驗精品課程精品課程二、實驗原理及要求二、實驗原理及要求 1 1、 根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度，即可用公式計算出提光度計在某一特定波長測定其吸光度，即可用公式計算出提

2、取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯比爾定律，某有色溶液的比爾定律，某有色溶液的吸光度吸光度A A與其中溶質(zhì)濃度與其中溶質(zhì)濃度C C和液層厚度和液層厚度L L成正比，即成正比，即A ACLCL式式中：中：比例常數(shù)。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度比例常數(shù)。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為為1cm1cm時，時，為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合下的吸光度而求得。如

3、果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。的總和。這就是吸光度的加和性。 基礎(chǔ)生物學實驗基礎(chǔ)生物學實驗精品課程精品課程 今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a a、b b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度特定波長下的吸光度A A，并根據(jù)葉綠素，并根據(jù)葉綠素a a、b b及類及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定

4、葉綠素在測定葉綠素a a、b b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。收峰。2 2、了解葉綠素、了解葉綠素a a和和b b及總量的最大吸收峰，學會分及總量的最大吸收峰，學會分光光度計的使用方法及其原理。光光度計的使用方法及其原理。 基礎(chǔ)生物學實驗基礎(chǔ)生物學實驗精品課程精品課程三、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備三、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備 （一）材料：（一）材料： 新鮮的綠色植物葉片。新鮮的綠色植物葉片。 （二）儀器設(shè)備：（二）儀器設(shè)備： 1. 1. 分光光度計；分光光度計；2. 2. 電子天平

5、（感量電子天平（感量0.01g0.01g）；）；3. 3. 研缽；研缽；4. 4. 棕色容量瓶；棕色容量瓶；5. 5. 小漏斗；小漏斗；6. 6. 定量濾紙；定量濾紙；7. 7. 吸水紙；吸水紙；8. 8. 擦擦境紙；境紙；9. 9. 滴管。滴管。 （三）試劑：（三）試劑： 8080丙酮；石英砂丙酮；石英砂. .基礎(chǔ)生物學實驗基礎(chǔ)生物學實驗精品課程精品課程四、操作步驟四、操作步驟 1 1、取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組、取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎織表面污物，剪碎( (去掉中脈去掉中脈) )，混勻。，混勻。 2 2、稱取剪碎的新鮮樣品、稱取

6、剪碎的新鮮樣品0.2g0.2g，放入研缽中，加少量石英砂，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及和碳酸鈣粉及5ml5ml80%80%丙酮，研成均漿，再加丙酮，研成均漿，再加80%80%丙酮丙酮10ml10ml，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3 35min5min。 基礎(chǔ)生物學實驗基礎(chǔ)生物學實驗精品課程精品課程3 3、取濾紙、取濾紙1 1張，置漏斗中，用張，置漏斗中，用80%80%丙酮濕潤，沿玻棒把提取丙酮濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到液倒入漏斗中，過濾到25ml25ml棕色容量瓶中，用少量棕色容量瓶中，用少量80%80%丙酮沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次，最后連同殘渣一起倒

7、入丙酮沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。漏斗中。4 4、用滴管吸取、用滴管吸取80%80%丙酮，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入丙酮，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用80%80%丙丙酮定容至酮定容至25ml25ml，搖勻。，搖勻。5 5、把葉綠體色素提取液倒入光徑、把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm1cm的比色杯內(nèi)。以的比色杯內(nèi)。以80%80%丙酮為空白，在波長丙酮為空白，在波長663nm663nm、645nm645nm下測定吸光度。下測定吸光度?；A(chǔ)生物學實驗基礎(chǔ)生物學實驗精品課程精品課程 6

8、6、結(jié)果計算：將測定得到的吸光值代入下面的式子：、結(jié)果計算：將測定得到的吸光值代入下面的式子： Ca=12.7A663Ca=12.7A6632.69A6452.69A645； Cb=22.9A645Cb=22.9A6454.69A6634.69A663； 據(jù)此即可得到葉綠素據(jù)此即可得到葉綠素a a和葉綠素和葉綠素b b的濃度（的濃度（CaCa、CbCb：mg/Lmg/L），二者之和為總?cè)~綠素的濃度。最后根據(jù)下式可進），二者之和為總?cè)~綠素的濃度。最后根據(jù)下式可進一步求出植物組織中葉綠素的含量：一步求出植物組織中葉綠素的含量： 葉綠素的含量（葉綠素的含量（mg/gmg/g）= = 葉綠素的濃度葉綠

9、素的濃度提取液體提取液體積積稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)/ /樣品鮮重（或干重）。樣品鮮重（或干重）。基礎(chǔ)生物學實驗基礎(chǔ)生物學實驗精品課程精品課程五、注意事項五、注意事項 1 1、為了避免葉綠素的光分解，操作應(yīng)在弱光下進行；研、為了避免葉綠素的光分解，操作應(yīng)在弱光下進行；研磨時間盡可能短些，以不超過兩分鐘為宜。磨時間盡可能短些，以不超過兩分鐘為宜。 2 2、過濾時必須將濾紙及葉片殘渣洗至無綠色為止。比色、過濾時必須將濾紙及葉片殘渣洗至無綠色為止。比色時提取液不能混濁。時提取液不能混濁。 基礎(chǔ)生物學實驗基礎(chǔ)生物學實驗精品課程精品課程六、作業(yè)六、作業(yè) 1、試比較陰生植物和陽生植物的葉綠素、試比較陰生植物和陽生植物的葉綠素a與葉綠素與葉綠素b的比的比值有無不同。值有無不同。 2、分光光度法和比色法有何異同？、分光光度法和比色法有何