高效液相色譜法教學(xué)【全】

1、高效液相色譜法高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography （HPLC） 前言前言: HPLC是是70年代以后發(fā)展最年代以后發(fā)展最快的一個(gè)分析化學(xué)分支，現(xiàn)快的一個(gè)分析化學(xué)分支，現(xiàn)已成為已成為生化、醫(yī)學(xué)、藥物、生化、醫(yī)學(xué)、藥物、化學(xué)化工、食品衛(wèi)生、環(huán)?；瘜W(xué)化工、食品衛(wèi)生、環(huán)保檢測檢測等領(lǐng)域最常用的分離分等領(lǐng)域最常用的分離分析手段。析手段。整理ppt我國：我國： 開始僅為少數(shù)研究實(shí)驗(yàn)室擁有，開始僅為少數(shù)研究實(shí)驗(yàn)室擁有， 現(xiàn)很多的生產(chǎn)、研究、質(zhì)檢部門都擁有?，F(xiàn)很多的生產(chǎn)、研究、質(zhì)檢部門都擁有。 廣泛應(yīng)用于：廣泛應(yīng)用于： 質(zhì)量控制質(zhì)量控制、分析化驗(yàn)分析化驗(yàn)

2、、制備分離。制備分離。 講課目的：講課目的：入門入門 教材：實(shí)用色譜法教材：實(shí)用色譜法（詹益興（詹益興 編著）編著） 學(xué)習(xí)要求：學(xué)習(xí)要求：記好筆記，記好筆記， 以課堂教學(xué)內(nèi)容為主。以課堂教學(xué)內(nèi)容為主。課時(shí)安排：課時(shí)安排：第一章：高效液相色譜的基本原理第一章：高效液相色譜的基本原理 4學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)第二章：高效液相色譜的儀器裝置第二章：高效液相色譜的儀器裝置 2學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)第三章：液固、鍵合相色譜第三章：液固、鍵合相色譜 3學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)第四章：離子交換色譜和離子對色譜第四章：離子交換色譜和離子對色譜 3學(xué)時(shí)學(xué)時(shí) 第五章：凝膠滲透色譜第五章：凝膠滲透色譜 1學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)第六章：實(shí)驗(yàn)技術(shù)和輔助實(shí)驗(yàn)技術(shù)第六章：實(shí)驗(yàn)技術(shù)

3、和輔助實(shí)驗(yàn)技術(shù) 1學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)復(fù)習(xí)復(fù)習(xí) 1學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)參考書籍：參考書籍：1.色譜理論基礎(chǔ)（盧佩章、戴朝政編）色譜理論基礎(chǔ)（盧佩章、戴朝政編）2.高效液相色譜法高效液相色譜法（鄒漢法、張玉奎、（鄒漢法、張玉奎、 盧佩章編著）盧佩章編著）3.高效液相色譜方法及應(yīng)用高效液相色譜方法及應(yīng)用 （色譜技術(shù)叢書、化學(xué)工業(yè)出版社、（色譜技術(shù)叢書、化學(xué)工業(yè)出版社、 于世林編著于世林編著)11 概述概述一、色譜法一、色譜法 混合物最有效的分離、分析方法。 是一種分離技術(shù)。 混合物分離過程：試樣中各組分在 固液兩相間不斷進(jìn)行著的分配。 一相固定不動，稱為固定相。 另一相是攜帶試樣混合物流過固定 相的液體，稱為流動相。第一

4、章第一章 高效液相色譜法基本原理高效液相色譜法基本原理液相色譜儀液相色譜儀二、色譜法原理二、色譜法原理混合物中各組份在不互溶的兩相中混合物中各組份在不互溶的兩相中溶解、溶解、吸附吸附等化學(xué)性能存在差異；等化學(xué)性能存在差異；當(dāng)兩相相對運(yùn)動時(shí)當(dāng)兩相相對運(yùn)動時(shí), ,各組分在各組分在兩相中兩相中 反復(fù)多次進(jìn)行平衡分配而達(dá)到相互反復(fù)多次進(jìn)行平衡分配而達(dá)到相互 分離。分離。分離原理分離原理: :分離是一個(gè)分離是一個(gè)物理物理過程。過程。固定相固定相(Stationary Phase)流動相流動相(Mobile Phase)進(jìn)樣進(jìn)樣 (Injection)洗脫洗脫 (Elution)相互作用相互作用(Inte

5、raction)三、高效液相色譜法的特點(diǎn)三、高效液相色譜法的特點(diǎn)高壓高壓: : 以液體作為流動相，液體流經(jīng)色譜柱時(shí)，以液體作為流動相，液體流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到阻力較大受到阻力較大 必須對流動相施加高壓。必須對流動相施加高壓。 一般可達(dá)到一般可達(dá)到150300kgcm2， 甚至可達(dá)甚至可達(dá)700kgcm2以上。以上。高速高速: : 分析時(shí)間較經(jīng)典液相色譜少得多（交分析時(shí)間較經(jīng)典液相色譜少得多（交換速度快），一個(gè)復(fù)雜樣品的分析僅需幾換速度快），一個(gè)復(fù)雜樣品的分析僅需幾分鐘到幾十分鐘。分鐘到幾十分鐘。 高效高效: : 氣相色譜的分離效能很高，高效液相氣相色譜的分離效能很高，高效液相色譜的柱效則更高（化

6、學(xué)鍵合相），一般色譜的柱效則更高（化學(xué)鍵合相），一般約可達(dá)約可達(dá) 6000理論塔板米理論塔板米高靈敏度高靈敏度 紫外檢測器的最小檢測量可達(dá)紫外檢測器的最小檢測量可達(dá)(10-9 g)； 熒光檢測器的靈敏度可達(dá)熒光檢測器的靈敏度可達(dá)（10-11g）。所需試樣很少；微升數(shù)量級所需試樣很少；微升數(shù)量級高選擇性高選擇性 可分離不同類型化合物和異構(gòu)體，也可分析在可分離不同類型化合物和異構(gòu)體，也可分析在性質(zhì)上極為相似的化合物性質(zhì)上極為相似的化合物(同位素、同分異構(gòu)體、空間異構(gòu)體、手性化合物）同位素、同分異構(gòu)體、空間異構(gòu)體、手性化合物） 高效液相色譜法的高效液相色譜法的特性特性:高壓、高效、高速、高靈敏。高壓

7、、高效、高速、高靈敏。適用：適用：高沸點(diǎn)高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定熱不穩(wěn)定樣品樣品 四、四、HPLCHPLC與與GCGC區(qū)別區(qū)別 1分析對象的區(qū)別分析對象的區(qū)別 GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、沸點(diǎn)低的樣適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、沸點(diǎn)低的樣 品，品， 占有機(jī)物的占有機(jī)物的20%HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品適于溶解后能制成溶液的樣品. 對分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差對分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差 樣品均可檢測樣品均可檢測 。 占有機(jī)物的占有機(jī)物的80%2 2流動相的區(qū)別流動相的區(qū)別GCGC：流動相為惰性，組分與流動相無相互作用流動相為惰性，組分與流動相無相互作用 力，只與固定相有相互作用。力，只與固定

8、相有相互作用。 HPLCHPLC：流動相為液體，流動相與組分間有相互作用流動相為液體，流動相與組分間有相互作用 力，參與和影響色譜分離力，參與和影響色譜分離. . 對分離起主要作用。對分離起主要作用。3 3操作條件差別操作條件差別 GCGC：加溫操作加溫操作 HPLCHPLC：室溫；高壓室溫；高壓 說明：說明：氣相、液相地位同樣重要?dú)庀唷⒁合嗟匚煌瑯又匾?兩種互補(bǔ)不足的色譜方法兩種互補(bǔ)不足的色譜方法 靈敏度：靈敏度：氣相氣相液相液相 應(yīng)用范圍：應(yīng)用范圍：液相氣相液相氣相五、色譜法的分類五、色譜法的分類吸附色譜吸附色譜(Absorption Chromatography)(Absorption

9、Chromatography) 組分對組分對固定相表面吸附力固定相表面吸附力的不同而分離的不同而分離分配色譜分配色譜(Partition Chromatography)(Partition Chromatography) 組分在固定相和流動相中的組分在固定相和流動相中的溶解度溶解度不同而分離不同而分離離子交換色譜離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography)(Ion Exchange Chromatography) 組份離子交換組份離子交換親和力親和力的差異而分離的差異而分離體積排除色譜體積排除色譜(Size Exclusion Chromatography)(Size

10、 Exclusion Chromatography) 組分分子量大小不同組分分子量大小不同, ,對固定相的對固定相的滲透力滲透力不同而不同而分離分離基本概念基本概念 一、色譜圖一、色譜圖 記錄儀所記錄記錄儀所記錄的濃度對分離時(shí)的濃度對分離時(shí)間的函數(shù)，稱為間的函數(shù)，稱為色譜圖。色譜圖。色譜過程特點(diǎn)：色譜過程特點(diǎn)：濃度對分離時(shí)間呈濃度對分離時(shí)間呈高斯曲線高斯曲線型型色譜條件一定時(shí)，各組分都色譜條件一定時(shí)，各組分都有一有一特定特定時(shí)間在圖譜中出現(xiàn)，時(shí)間在圖譜中出現(xiàn)，稱為組分的保留時(shí)間。稱為組分的保留時(shí)間。柱效一定時(shí)，組分保留值柱效一定時(shí)，組分保留值越越小小，峰越，峰越窄；窄；保留值保留值越大越大，峰

11、，峰越越寬寬。相鄰峰的保留時(shí)間相鄰峰的保留時(shí)間相差越大相差越大，越易越易分離分離。二、色譜參數(shù)二、色譜參數(shù) 1. 保留時(shí)間保留時(shí)間-tR 從進(jìn)樣開始到從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)樣品柱后出現(xiàn)樣品的濃度極大值的濃度極大值所需的時(shí)間，所需的時(shí)間，用用tR表示。表示。2.2.分配系數(shù)分配系數(shù)K K在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度比濃度比（單位：（單位：g/mLg/mL），稱為），稱為分配系數(shù)分配系數(shù)KMS ccK組分在流動相中的濃度組分在固定相中的濃度分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。K值小，值小，先流出柱子；先流出柱子；K值大，值大

12、，保留作用強(qiáng)，后保留作用強(qiáng)，后 流出柱子。流出柱子。分配系數(shù)分配系數(shù)K K 的討論的討論 一定溫度下，組分分配系數(shù)一定溫度下，組分分配系數(shù)K K越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；每個(gè)組份在各種每個(gè)組份在各種固定相固定相上的分配系數(shù)上的分配系數(shù)K K 不同；不同；選擇適宜的選擇適宜的固定相固定相可改善分離效果；可改善分離效果；各組分有不同各組分有不同K K 值是分離的基礎(chǔ)（差移速度）值是分離的基礎(chǔ)（差移速度）某組分的某組分的K K = 0 = 0時(shí)，即不被固定相保留，最先流時(shí)，即不被固定相保留，最先流 出。出。 組分在流動相中的濃度組分在固定相中的濃度K3.3.容量因子容量因子k k (capac

13、ity factor)(capacity factor) 一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比。質(zhì)量比。MMS Smmmmk k 組組分分在在流流動動相相中中的的質(zhì)質(zhì)量量組組分分在在固固定定相相中中的的質(zhì)質(zhì)量量 1.1.與與k k都是與都是與組分組分及及固定相固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有的熱力學(xué)性質(zhì)有 關(guān)的常數(shù)關(guān)的常數(shù), , 隨隨分離柱溫度、柱壓分離柱溫度、柱壓的改變而變化的改變而變化2. 2. 容量因子可以由實(shí)驗(yàn)測得。容量因子可以由實(shí)驗(yàn)測得。3.3.色譜的保留作用：色譜的保留作用：組分理化性質(zhì)不同組分理化性質(zhì)不同兩相間兩相間 分配量不同分配量不同柱內(nèi)

14、保留時(shí)間不同柱內(nèi)保留時(shí)間不同4. 容量因子與保留時(shí)間的關(guān)系容量因子與保留時(shí)間的關(guān)系0oRtttkk太小太小-沒有充分利用填料的分離能力沒有充分利用填料的分離能力k太大太大-分析時(shí)間太長分析時(shí)間太長 k范圍：范圍：k 1/0（0溶劑強(qiáng)度溶劑強(qiáng)度使組分遷移快慢使組分遷移快慢 的能力）的能力） P310 表表3-10tR = to(1+k)5. 選擇性系數(shù)選擇性系數(shù) 可用來衡量兩物質(zhì)的分離程度， 用表示。 1R2R1212ttkkKK色譜理論需要解決的問題？色譜理論需要解決的問題？ 色譜分離過程的熱力學(xué)和動力學(xué)問題。色譜分離過程的熱力學(xué)和動力學(xué)問題。組分保留時(shí)間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時(shí)間

15、為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時(shí)間：組分保留時(shí)間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；色譜過程的熱力學(xué)因素控制； （組分和固定相的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）（組分和固定相的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜峰變寬：色譜過程的動力學(xué)因素控制；色譜過程的動力學(xué)因素控制； （兩相中的運(yùn)動阻力，擴(kuò)散）（兩相中的運(yùn)動阻力，擴(kuò)散）兩種色譜理論：兩種色譜理論：塔板理論和速率理論。塔板理論和速率理論。1-3 色譜柱的分離效率色譜柱的分離效率一、塔板理論一、塔板理論 塔板理論認(rèn)為塔板理論認(rèn)為: 一根柱子可以分為一根柱子可以分為n段，段，每段內(nèi)組分在兩相間迅速達(dá)到平衡，每段內(nèi)組分在兩相間迅速達(dá)到平衡，把每一段稱為一塊理論塔板。把每一段稱為

16、一塊理論塔板。設(shè)柱長為設(shè)柱長為L，理論塔板高度為，理論塔板高度為H，則，則 H=L/為理論塔板數(shù)。為理論塔板數(shù)。 理論塔板數(shù)一理論塔板數(shù)一N N色譜峰對稱色譜峰對稱 ： 說明：說明：a.a. 在給定的操作條件下，在給定的操作條件下，N N幾乎相同幾乎相同b. Nb. N為常量時(shí)，為常量時(shí)，t tw w 隨隨 t tR R 成正比例變化成正比例變化c. c. 與柱長有關(guān)與柱長有關(guān): : 比較不同長度色譜柱的柱效比較不同長度色譜柱的柱效 時(shí)，應(yīng)當(dāng)比較它們在相同柱長下的時(shí)，應(yīng)當(dāng)比較它們在相同柱長下的N N值。值。例例d. d. 是一種理想狀態(tài)是一種理想狀態(tài)2WR)tt16(N 有拖尾峰時(shí)有拖尾峰時(shí):

17、 可用半峰寬來表示可用半峰寬來表示N： N554 ( tR / W1/2 ) 2 W1/2 -半峰寬半峰寬例：例：測得測得tR=105mm、 W1/2 =4mm，求得，求得N=3789，若此柱長為，若此柱長為250mm,折成每米的理折成每米的理論塔板數(shù)約為論塔板數(shù)約為15200. 理論塔板高度理論塔板高度HNLH2Rw)tt(16LH2WR)tt16(N物理意義：物理意義：組分在兩相間達(dá)到一次平衡對應(yīng)組分在兩相間達(dá)到一次平衡對應(yīng) 的柱長的柱長H H愈小愈小組分在兩相間平衡分配次數(shù)越多組分在兩相間平衡分配次數(shù)越多柱效柱效（不能說明分離一定實(shí)現(xiàn)）（不能說明分離一定實(shí)現(xiàn)）說明：說明：大，固定相分離潛

18、能大。大，固定相分離潛能大。 （分離與否，還取決于其他色譜條件）（分離與否，還取決于其他色譜條件）一定色譜條件下，對一定色譜條件下，對k有差異的組有差異的組 分，則柱效愈高，分離效果愈好。分，則柱效愈高，分離效果愈好。塔板理論的特點(diǎn)和不足：塔板理論的特點(diǎn)和不足：(1)(1)當(dāng)當(dāng)L L一定時(shí)，一定時(shí)，N N 越大越大( (H H 越小越小) )，被測組，被測組 分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效越分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效越 高，所得色譜峰越窄。高，所得色譜峰越窄。(2)(2)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離 效果：效果：如兩組分的分配系數(shù)如兩組分的分配系數(shù)K K

19、 相同，相同， 無論該色譜柱的柱效多大，都無法無論該色譜柱的柱效多大，都無法 分離。分離。(3)(3)塔板理論塔板理論無法解釋無法解釋同一色譜柱在同一色譜柱在 不同的流動相流速下柱效不同的不同的流動相流速下柱效不同的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也無法指出無法指出影響柱效影響柱效 的因素及提高柱效的途徑。的因素及提高柱效的途徑。二二. .峰擴(kuò)展和速率方程式峰擴(kuò)展和速率方程式1.1.峰擴(kuò)展峰擴(kuò)展-由于柱內(nèi)柱外各種因素引起由于柱內(nèi)柱外各種因素引起的色譜峰變寬或變形，從而造成色譜柱的色譜峰變寬或變形，從而造成色譜柱效的降低效的降低峰擴(kuò)展程度：取決于組分在柱內(nèi)的峰擴(kuò)展程度：取決于組分在柱內(nèi)的 平衡分配次數(shù)平

20、衡分配次數(shù) 例：例：引起峰擴(kuò)展因素：引起峰擴(kuò)展因素：柱內(nèi)柱內(nèi)、柱外、柱外2. 速率方程式速率方程式（范（范弟姆特方程式）弟姆特方程式） H H = = A A + + B B/ /u u + + C u H H：理論塔板高度，理論塔板高度， u u：流動相流速流動相流速(cm/s)(cm/s)。 減小減小A A、B B、C C 三項(xiàng)可提高柱效。三項(xiàng)可提高柱效。 A A，B B，C C 三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？A A 渦流擴(kuò)散項(xiàng)渦流擴(kuò)散項(xiàng) A A = 2 = 2ddp p d dp p：固定相的平均顆粒直：固定相的平均顆粒直徑徑 ：固定相的填充不均勻因子：固定相的填充不均勻因

21、子 固定相顆粒越小固定相顆粒越小d dpp，填充得越均勻，填充得越均勻，A A，H H，柱效柱效。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。減輕，色譜峰較窄。B B/ /u u 分子擴(kuò)散項(xiàng)分子擴(kuò)散項(xiàng) B B = 2 = 2 DD D D：試樣組分分子的擴(kuò)散系數(shù)（：試樣組分分子的擴(kuò)散系數(shù)（cmcm2 2ss-1-1）(1) (1) 存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散; ;(2) (2) 擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H H()，分離變差，分離變差; ;(3) (3) B B/ /u u與流速有關(guān)：流速與流速有關(guān)：流速

22、滯留時(shí)間滯留時(shí)間 擴(kuò)散擴(kuò)散 ( (0.5ml/min)0.5ml/min)(4) (4) 擴(kuò)散系數(shù)擴(kuò)散系數(shù)D D，B B 值值。 液相中，分子擴(kuò)散可忽略液相中，分子擴(kuò)散可忽略C C u u 傳質(zhì)項(xiàng)傳質(zhì)項(xiàng) 傳質(zhì)傳質(zhì)溶質(zhì)分子在兩相間濃度不同，由濃度溶質(zhì)分子在兩相間濃度不同，由濃度 高的相不斷遷移至濃度低的相，直到高的相不斷遷移至濃度低的相，直到 濃度達(dá)到平衡。濃度達(dá)到平衡。 根據(jù)傳質(zhì)形式分：根據(jù)傳質(zhì)形式分： 固定相傳質(zhì)固定相傳質(zhì) 移動相傳質(zhì)移動相傳質(zhì) C =（Cs + Cm）n固定相傳質(zhì)原因：固定相傳質(zhì)原因： 進(jìn)出固定相進(jìn)出固定相速度速度不同（固相，液相）不同（固相，液相） 減小措施：減小措施：使

23、用薄的固定相層使用薄的固定相層 小顆粒填料小顆粒填料n移動相傳質(zhì)原因：遷移移動相傳質(zhì)原因：遷移 滯留滯留 減小措施減小措施 填裝均勻緊密填裝均勻緊密 使用小顆粒填料和表面使用小顆粒填料和表面 多孔性填料多孔性填料3. 3. 速率理論的要點(diǎn)速率理論的要點(diǎn): :(1)(1)柱內(nèi)的峰擴(kuò)展與渦流擴(kuò)散、分子擴(kuò)散、柱內(nèi)的峰擴(kuò)展與渦流擴(kuò)散、分子擴(kuò)散、傳質(zhì)阻力有關(guān)。傳質(zhì)阻力有關(guān)。(2)(2) 通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、液膜厚通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６取⒁耗ず穸燃傲鲃酉嗔魉倏商岣咧?。度及流動相流速可提高柱效?3)(3) 為色譜分離和操作條件選擇提供了為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和填料對柱

24、效及理論指導(dǎo)。闡明了流速和填料對柱效及分離的影響。分離的影響。 選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。4.4.獲得高柱效的幾種方法：獲得高柱效的幾種方法：選用細(xì)的顆粒填料選用細(xì)的顆粒填料流動相流速低流動相流速低流動相粘度小流動相粘度小升高溫度升高溫度溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)與其結(jié)構(gòu)有關(guān)溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)與其結(jié)構(gòu)有關(guān) 大分子，擴(kuò)散系數(shù)小大分子，擴(kuò)散系數(shù)小 小分子，擴(kuò)散系數(shù)大小分子，擴(kuò)散系數(shù)大5. 5. 影響分離的因素與提高柱效的途徑影響分離的因素與提高柱效的途徑 液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，在高效液相液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，在高效液相色譜中色譜中, ,速率方程中的分子

25、擴(kuò)散項(xiàng)速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/uB/u較小，可忽略不較小，可忽略不計(jì)，即計(jì)，即 H = A + C uH = A + C u 降低傳質(zhì)阻力是提高降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。柱效主要途徑。氣相和液相區(qū)別氣相和液相區(qū)別分離度分離度 (Rs) 色譜分離目的：色譜分離目的： -合理的時(shí)間內(nèi)將樣品中組分成功分離合理的時(shí)間內(nèi)將樣品中組分成功分離分離度：表示分離狀況的一種度量分離度：表示分離狀況的一種度量分離度影響因素：分離度影響因素：保留值之差保留值之差色譜過程的熱力學(xué)因素；色譜過程的熱力學(xué)因素；峰的寬度峰的寬度色譜過程的動力學(xué)因素。色譜過程的動力學(xué)因素。討論：討論： 色譜分離中的四種色譜分離中的四

26、種情況：情況： 柱效較高，柱效較高，K K( (分配系數(shù)分配系數(shù)) )較大，完全分離。較大，完全分離。 K K 不是很大，柱效較高，峰較窄，基本分離。不是很大，柱效較高，峰較窄，基本分離。 柱效較低，柱效較低，K K 較大，但分離的不好。較大，但分離的不好。 K K 小，柱效低，分離效果更差。小，柱效低，分離效果更差。一分離度的數(shù)學(xué)表達(dá)式：一分離度的數(shù)學(xué)表達(dá)式：R=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)：兩峰的分離程度可達(dá)89%；R=1：分離程度：分離程度98%(達(dá)到定性定量分析的最低要求達(dá)到定性定量分析的最低要求)R=1.5：達(dá)：達(dá)99.7%（相鄰兩峰（相鄰兩峰達(dá)到基線分離達(dá)到基線分離）。）。699.1

27、)(2)(2)1(2/1)2(2/11R2R121R2RYYttWWttRs對濃度不同組分而言：對濃度不同組分而言：兩個(gè)組分的分離度會隨濃度比的增大而兩個(gè)組分的分離度會隨濃度比的增大而 減小減小 例：例：對多組分而言：對多組分而言：整個(gè)色譜分離的分離度取決于整個(gè)色譜分離的分離度取決于Rs最小值最小值的兩個(gè)峰。的兩個(gè)峰。二分離度影響因素二分離度影響因素峰的寬度峰的寬度（峰寬越小，（峰寬越小， Rs越大）越大） 峰的寬窄主要反映了色譜分離的峰的寬窄主要反映了色譜分離的動力學(xué)動力學(xué)特性特性兩峰的保留時(shí)間之差兩峰的保留時(shí)間之差（tR越大，越大， Rs越大）越大） 反映了色譜分離的反映了色譜分離的熱力學(xué)

28、熱力學(xué)特性特性分離度基本分離度基本關(guān)系式關(guān)系式： 1 1k k k k 1 1N N4 41 1R Rs s121R2R)(2WWttRs四控制分離度方法四控制分離度方法改變改變k調(diào)節(jié)溶劑強(qiáng)度可以改變調(diào)節(jié)溶劑強(qiáng)度可以改變k增大增大-使用較弱溶劑使用較弱溶劑降低降低-使用較強(qiáng)溶劑使用較強(qiáng)溶劑正相色譜正相色譜-固定相極性大于移動相固定相極性大于移動相 （溶劑極性大（溶劑極性大溶劑強(qiáng)度大溶劑強(qiáng)度大洗脫能力強(qiáng)洗脫能力強(qiáng)?。┬。┓聪嗌V反相色譜-固定相極性小于移動相固定相極性小于移動相（溶劑極性大（溶劑極性大溶劑強(qiáng)度小溶劑強(qiáng)度小洗脫能力弱洗脫能力弱大）大） P307311例例: 流動相極性變化對組分流動

29、相極性變化對組分k的影響的影響更換色譜柱（改變更換色譜柱（改變N） 措施：措施：a.選擇長柱子選擇長柱子(N=L/H)b.填料顆粒盡量小填料顆粒盡量小c.低流速低流速(溶質(zhì)傳質(zhì)阻力小，峰擴(kuò)展小溶質(zhì)傳質(zhì)阻力小，峰擴(kuò)展小)d.低的溶劑粘度低的溶劑粘度(提高柱效提高柱效)e.提高柱溫提高柱溫改變選擇性系數(shù)改變選擇性系數(shù)1R2R1212ttkkKK（ =1=1， 不能實(shí)現(xiàn)分離不能實(shí)現(xiàn)分離) )下列途徑改善：下列途徑改善：a.流動相流動相梯度洗脫梯度洗脫洗脫過程中，流動相組成隨洗脫過程中，流動相組成隨 時(shí)間的變化而變化時(shí)間的變化而變化 P279（適用于極性范圍寬的樣品）（適用于極性范圍寬的樣品）b.固定

30、相固定相(換柱，改變填料）換柱，改變填料）c.溫度溫度（改變熱力學(xué)參數(shù)）（改變熱力學(xué)參數(shù)）五五. 分離度控制的一般原則分離度控制的一般原則:開始開始k值很小，若要增大值很小，若要增大Rs，則首先應(yīng)將，則首先應(yīng)將k調(diào)整至調(diào)整至1 k 10范圍，這樣，不用范圍，這樣，不用改變其他條件，就可使改變其他條件，就可使Rs增大。增大。開始開始k已在已在1 k 10范圍，但范圍，但Rs不大，不大，則必須增大則必須增大N來改善來改善Rs。 k，N的改變都不能增大的改變都不能增大Rs時(shí)，再設(shè)法改時(shí)，再設(shè)法改變變第二章第二章 儀器裝置儀器裝置 四大部件：四大部件：高壓輸液泵高壓輸液泵進(jìn)樣器進(jìn)樣器高效分離柱高效分離

31、柱檢測器檢測器 21 高壓輸液泵高壓輸液泵作用：作用：向色譜柱輸送一個(gè)向色譜柱輸送一個(gè)連續(xù)、恒定連續(xù)、恒定的移動相。的移動相。一、對泵系統(tǒng)的要求一、對泵系統(tǒng)的要求1.使用方便（易調(diào)節(jié)流量、過壓保護(hù)等）使用方便（易調(diào)節(jié)流量、過壓保護(hù)等）2.更換洗脫液容易、死體積小更換洗脫液容易、死體積小3.有最大工作壓力有最大工作壓力(20MPa，130MPa)4.一定流量范圍（一定流量范圍（直徑小，流量?。凰俣瓤?，流直徑小，流量?。凰俣瓤?，流 量大。量大。）（）（0.110ml/min)5.流量穩(wěn)定性好流量穩(wěn)定性好(流量噪聲、流量波動、流量漂流量噪聲、流量波動、流量漂 移移）6.流量精度高流量精度高機(jī)械往復(fù)式

32、柱塞泵的機(jī)械往復(fù)式柱塞泵的工作原理：工作原理：特點(diǎn)：特點(diǎn)：能連續(xù)供給恒定體積的移動相，不受整個(gè)色能連續(xù)供給恒定體積的移動相，不受整個(gè)色譜系統(tǒng)中其余部分稍有變化的影響。譜系統(tǒng)中其余部分稍有變化的影響。死體積較小，約死體積較小，約0.1ml，更換溶劑方便，適，更換溶劑方便，適用于用于梯度洗脫。梯度洗脫。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：輸出有輸出有脈沖波動脈沖波動二個(gè)因素：脫氣不完全二個(gè)因素：脫氣不完全 泵的周期性吸液泵的周期性吸液影響檢測靈敏度。（對紫外檢測器影響不大）影響檢測靈敏度。（對紫外檢測器影響不大）梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置外梯度外梯度: 利用兩臺高壓輸液利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的泵，將兩種不同極性

33、的溶劑按一定的比例送入溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。入色譜柱。內(nèi)梯度內(nèi)梯度: 一臺高壓泵一臺高壓泵, 通過通過比例調(diào)節(jié)閥比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或?qū)煞N或多種不同極性的溶劑多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高按一定的比例抽入高壓泵中混合。壓泵中混合。泵系統(tǒng)發(fā)展趨勢泵系統(tǒng)發(fā)展趨勢高效：填料顆粒高效：填料顆粒分離效率分離效率柱壓降柱壓降 泵的工作壓力泵的工作壓力分析時(shí)間短：更快流速分析時(shí)間短：更快流速柱壓降柱壓降 (超快速分析）超快速分析）減少洗脫液用量減少洗脫液用量 (4.6mm1mm，流量減少，流量減少20倍倍)液相色譜的多元洗脫系統(tǒng)液相色譜的多元洗脫系統(tǒng) P

34、27728022 色譜色譜柱柱組成：組成：精密管徑的不銹鋼管、填料、柱接頭精密管徑的不銹鋼管、填料、柱接頭要求：要求：柱管內(nèi)壁非常光滑柱管內(nèi)壁非常光滑 柱接頭設(shè)計(jì)要保證系統(tǒng)中引入最小柱接頭設(shè)計(jì)要保證系統(tǒng)中引入最小 死體積（柱前、柱后）死體積（柱前、柱后） 能密封高壓液體能密封高壓液體 兩端加過濾片兩端加過濾片 柱體為直形不銹鋼管，內(nèi)徑柱體為直形不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長，柱長540 cm。減小填料粒度和柱徑以提高柱效。減小填料粒度和柱徑以提高柱效。柱效的影響因素柱效的影響因素填料的顆粒度及其均勻性填料的顆粒度及其均勻性柱長、填裝的方法與技巧柱長、填裝的方法與技巧 常用：常用：內(nèi)徑內(nèi)徑25m

35、m（4.6mm) 柱效一定時(shí)，柱長與顆粒度成正比柱效一定時(shí)，柱長與顆粒度成正比例如：顆粒度例如：顆粒度510um、柱長、柱長1530cm 顆粒度顆粒度35um、 柱長柱長7.515cmP28228323 進(jìn)樣裝置進(jìn)樣裝置 六通進(jìn)樣閥六通進(jìn)樣閥 P280281 結(jié)構(gòu)如圖：結(jié)構(gòu)如圖：2-4 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)功能：功能：連續(xù)地將色譜柱中流出的組分隨時(shí)間連續(xù)地將色譜柱中流出的組分隨時(shí)間 變化的情況，轉(zhuǎn)變成大小不同的電信變化的情況，轉(zhuǎn)變成大小不同的電信 號輸入到記錄儀中，得到色譜圖。號輸入到記錄儀中，得到色譜圖。按檢測方式不同，分為：按檢測方式不同，分為：總體性質(zhì)檢測器（通用型）總體性質(zhì)檢測器（通用型）

36、 示差折射檢測器示差折射檢測器溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（選擇型）溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（選擇型） 紫外檢測器、熒光檢測器、電導(dǎo)檢測器紫外檢測器、熒光檢測器、電導(dǎo)檢測器檢測器的性能指標(biāo)檢測器的性能指標(biāo)一個(gè)理想檢測器，必須具備下列條件：一個(gè)理想檢測器，必須具備下列條件：靈敏度高靈敏度高不受溫度及流動相流速變化的影響不受溫度及流動相流速變化的影響響應(yīng)隨組分量的變化而線性地變化響應(yīng)隨組分量的變化而線性地變化穩(wěn)定性好，操作方便穩(wěn)定性好，操作方便衡量指標(biāo)：衡量指標(biāo)：靈敏度靈敏度 S=R/Q噪音在沒有樣品情況下，檢測器輸出的最大噪音在沒有樣品情況下，檢測器輸出的最大 振幅振幅（溫度、流量、泵）（溫度、流量、泵）漂移檢測器在一

37、段時(shí)間內(nèi)，基線隨時(shí)間的增漂移檢測器在一段時(shí)間內(nèi)，基線隨時(shí)間的增 加而產(chǎn)生的偏離加而產(chǎn)生的偏離（電壓、流動相）（電壓、流動相）最小檢測限樣品產(chǎn)生兩倍于噪音信號時(shí)的最小檢測限樣品產(chǎn)生兩倍于噪音信號時(shí)的（檢測下限）（檢測下限） 濃度濃度線性范圍檢測信號呈線性變化時(shí)，最大和最線性范圍檢測信號呈線性變化時(shí)，最大和最 小進(jìn)樣量之比小進(jìn)樣量之比檢測器檢測器 紫外檢測器紫外檢測器（光電二極管陣列檢測器）光電二極管陣列檢測器） 示差折光檢測器示差折光檢測器 熒光檢測器熒光檢測器 電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器 a.a.紫外檢測器紫外檢測器 應(yīng)用最廣，對大部分應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)有機(jī)化合物化合物有響應(yīng)。有響應(yīng)。特點(diǎn)：特點(diǎn)

38、：靈敏度高；靈敏度高；線性范圍寬；線性范圍寬；流通池可做得很小流通池可做得很小(1mm (1mm 10mm 10mm ，容積，容積 8L) 8L)；對流動相的流速和溫度變化不敏感；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作波長可選，易于操作 ( (波長范圍，常用波長）波長范圍，常用波長） 200200400nm400nm 254nm254nm、280nm280nm可用于梯度洗脫?？捎糜谔荻认疵摗?b. b. 光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器 紫外檢測器的重要進(jìn)展；紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：光電二極管陣列檢測器：10241024個(gè)二極管陣列，各檢測特定個(gè)二極管陣

39、列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器三維：光譜三維：光譜-色譜圖色譜圖檢測原理檢測原理比爾定律：比爾定律： A=c L紫外檢測器優(yōu)點(diǎn)：紫外檢測器優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高（靈敏度高（1010g/ml)對梯度洗脫是一種理想檢測器對梯度洗脫是一種理想檢測器局限性：局限性：不能檢測對紫外光沒有吸收的樣品不能檢測對紫外光沒有吸收的樣品不能使用對紫外光有吸收的溶劑不能使用對紫外光有吸收的溶劑 P289293第三章第三章 液固色譜和鍵合相色譜液固色譜和鍵合相色譜 31 液固吸附色譜液固吸附色譜一、原理一、原理: 固定相是極性吸附

40、劑，固定相是極性吸附劑，不同組份官能團(tuán)具有不不同組份官能團(tuán)具有不同極性，因而對固定相同極性，因而對固定相的吸附能力不同。的吸附能力不同。 極性越大，吸附能力極性越大，吸附能力越強(qiáng)；極性越低，吸附越強(qiáng)；極性越低，吸附能力越弱而導(dǎo)致分離。能力越弱而導(dǎo)致分離。Flow流動相流動相活性吸附點(diǎn)活性吸附點(diǎn)固定相固定相整理ppt存在競爭吸附：存在競爭吸附：吸附解吸平衡吸附解吸平衡 溶質(zhì)、流動相分子之間溶質(zhì)、流動相分子之間 溶質(zhì)中不同官能團(tuán)之間溶質(zhì)中不同官能團(tuán)之間 競爭的結(jié)果，導(dǎo)致了分離。競爭的結(jié)果，導(dǎo)致了分離。溶質(zhì)在柱內(nèi)受到兩種力作用：溶質(zhì)在柱內(nèi)受到兩種力作用：固定相的吸附力固定相的吸附力 流動相的溶解力流

41、動相的溶解力 當(dāng)吸附力溶解力當(dāng)吸附力溶解力 k大大 吸附力溶解力吸附力溶解力 k小小二分離對象：二分離對象：官能團(tuán)有差別的不同類型化合物官能團(tuán)有差別的不同類型化合物 （烷基類吸附弱，不能分離）（烷基類吸附弱，不能分離）幾何異構(gòu)體幾何異構(gòu)體 (固定相表面是剛性結(jié)構(gòu)固定相表面是剛性結(jié)構(gòu) 溶質(zhì)分子官能團(tuán)與吸附中心的相互作溶質(zhì)分子官能團(tuán)與吸附中心的相互作用隨分子的幾何形狀而改變）用隨分子的幾何形狀而改變）三填料的類型及其選擇三填料的類型及其選擇按形狀分：按形狀分： a. 球形球形 b. 無定形無定形按多孔程度分：按多孔程度分： a. 多孔型多孔型 b. 薄殼型薄殼型按極性分：按極性分： a. 極性（硅

42、膠、極性（硅膠、Al2O3 、MgO、分子篩）、分子篩） b.非極性（活性碳）非極性（活性碳） 整理ppt四、硅膠的活性控制及標(biāo)準(zhǔn)化四、硅膠的活性控制及標(biāo)準(zhǔn)化硅膠的特點(diǎn)：硅膠的特點(diǎn)：活性控制意義：活性控制意義：標(biāo)準(zhǔn)化方法：標(biāo)準(zhǔn)化方法： 市售未處理硅膠市售未處理硅膠加熱加熱46小時(shí)，活小時(shí)，活化去水，再加進(jìn)定量水分，使吸附劑含化去水，再加進(jìn)定量水分，使吸附劑含水量保持恒定。水量保持恒定。（100m2表面積含水表面積含水0.020.03g為佳）為佳）整理ppt吸附強(qiáng)度分類吸附強(qiáng)度分類根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)類型，可將它們根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)類型，可將它們在硅膠上在硅膠上 的吸附強(qiáng)度排序：的吸附強(qiáng)度排序：P315歸

43、納：歸納：官能團(tuán)不同官能團(tuán)不同極性不同極性不同吸附強(qiáng)度不同吸附強(qiáng)度不同幾何異構(gòu)體幾何異構(gòu)體空間位置不同空間位置不同吸附強(qiáng)度吸附強(qiáng)度不同不同P314-316 P331-333P314-316 P331-333整理ppt分子空間效應(yīng)。分子空間效應(yīng)。n 與官能團(tuán)相鄰的大烷基可能降低保留與官能團(tuán)相鄰的大烷基可能降低保留能力；（位阻效應(yīng)）能力；（位阻效應(yīng)）n 順式化合物的保留能力可能比反式化順式化合物的保留能力可能比反式化合物強(qiáng)；合物強(qiáng)；n 對位化合物的保留能力可能比鄰位化對位化合物的保留能力可能比鄰位化合物強(qiáng)。合物強(qiáng)。 整理ppt五樣品分子結(jié)構(gòu)對保留的影響五樣品分子結(jié)構(gòu)對保留的影響 對吸附色譜來說對吸

44、附色譜來說, , 主要取決于主要取決于樣品分子所含的樣品分子所含的官能團(tuán)的類型及其數(shù)目官能團(tuán)的類型及其數(shù)目。 常見官能團(tuán)的吸附強(qiáng)度：常見官能團(tuán)的吸附強(qiáng)度： 不吸附：不吸附：烷烴烷烴 弱吸附：弱吸附：烯烴、硫醇、硫醚、單環(huán)或雙環(huán)芳烯烴、硫醇、硫醚、單環(huán)或雙環(huán)芳 烴、鹵代芳烴烴、鹵代芳烴中等吸附：中等吸附：多環(huán)芳烴、醚、腈、硝基物、大多多環(huán)芳烴、醚、腈、硝基物、大多 數(shù)羰基化合物數(shù)羰基化合物 強(qiáng)吸附：強(qiáng)吸附：醇、酚、胺、酰胺、亞楓、酸和多醇、酚、胺、酰胺、亞楓、酸和多 官能團(tuán)化合物官能團(tuán)化合物 六、六、 液相色譜的流動相液相色譜的流動相1. 1. 流動相實(shí)用要求流動相實(shí)用要求（1 1）溶劑的純度和

45、化學(xué)特性必須滿足）溶劑的純度和化學(xué)特性必須滿足 色譜過程的穩(wěn)定性和重復(fù)性要求。色譜過程的穩(wěn)定性和重復(fù)性要求。（2 2）避免使用與固定相發(fā)生不可逆反應(yīng)溶劑。）避免使用與固定相發(fā)生不可逆反應(yīng)溶劑。（使用（使用AIAI2 2O O3 3- -避免酸、使用硅膠避免堿）避免酸、使用硅膠避免堿）（3 3）溶劑應(yīng)不干擾使用檢測器的正常工作，與檢測器相匹）溶劑應(yīng)不干擾使用檢測器的正常工作，與檢測器相匹 配。配。 使用的溶劑應(yīng)當(dāng)易于除去，不干擾對分離組分的回收。使用的溶劑應(yīng)當(dāng)易于除去，不干擾對分離組分的回收。2. 2. 流動相分流動相分類類 按流動相組成分按流動相組成分：單組分和多組分；單組分和多組分； 按極性

46、分：按極性分：極性、弱極性、非極性；極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：按使用方式分：一般淋洗和梯度淋洗。一般淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑：常用溶劑： 正相正相: :己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、 正戊烷正戊烷 正庚烷正庚烷 反相反相: : 甲醇甲醇、乙腈、水溶液。乙腈、水溶液。 LSC LSC 流動相的選擇流動相的選擇 在吸附色譜中在吸附色譜中, , 對溶質(zhì)保留值和分離選擇性起對溶質(zhì)保留值和分離選擇性起主導(dǎo)作用的是溶質(zhì)與固定相的作用主導(dǎo)作用的是溶質(zhì)與固定相的作用, , 流動相主要流動相主要是調(diào)節(jié)溶質(zhì)的保留值在適當(dāng)范圍內(nèi)。是調(diào)節(jié)溶質(zhì)的保留值在適當(dāng)范圍內(nèi)。 溶劑

47、強(qiáng)度溶劑強(qiáng)度洗脫能力洗脫能力 k k 液固吸附色譜的流動相液固吸附色譜的流動相值要適當(dāng)，值要適當(dāng)，常用正己烷、正庚烷常用正己烷、正庚烷, , 添加少量添加少量CHCH2 2ClCl2 2、CHClCHCl3 3、CHCH3 3CNCN和和CHCH3 3OHOH。 ( (混合后的溶劑強(qiáng)度在兩種純?nèi)軇┲g）混合后的溶劑強(qiáng)度在兩種純?nèi)軇┲g） o o 液固色譜的應(yīng)用特點(diǎn)：液固色譜的應(yīng)用特點(diǎn)：對具有不同極性取代基的化合物表現(xiàn)出較高的選對具有不同極性取代基的化合物表現(xiàn)出較高的選 擇性，但對同系物的分離能力較差擇性，但對同系物的分離能力較差對強(qiáng)極性或離子型樣品，因有時(shí)會發(fā)生不可逆對強(qiáng)極性或離子型樣品，因有

48、時(shí)會發(fā)生不可逆 吸附，液固色譜常不能獲得滿意的分離結(jié)果。吸附，液固色譜常不能獲得滿意的分離結(jié)果。吸附劑的含水量對吸附劑活性、樣品容量和保吸附劑的含水量對吸附劑活性、樣品容量和保 留值有較大影響留值有較大影響 液固吸附色譜主要應(yīng)用于液固吸附色譜主要應(yīng)用于: : 結(jié)構(gòu)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體的分離。結(jié)構(gòu)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體的分離。 NH2NH2NH2NH2NH2NH2OHOHH2NNH2思考：思考：在液固色譜中，以硅膠為固定相，對以下四在液固色譜中，以硅膠為固定相，對以下四 組分進(jìn)行分離，流出色譜柱的順序可能是：組分進(jìn)行分離，流出色譜柱的順序可能是：a.a.鄰苯二胺鄰苯二胺 b b對苯二胺對苯二胺 c c

49、間苯二胺間苯二胺 a. a. 苯酚苯酚 b. b. 對羥基苯胺對羥基苯胺 c. c. 苯胺苯胺 d. d. 苯苯123-2 反相鍵合相色譜RR=H, CH3, (CH2)nCH3 n=1, 2, 3. 鍵合相色譜是目前鍵合相色譜是目前HPLCHPLC中最常見的分離模式中最常見的分離模式, , 約約80%80%的的HPLCHPLC是采用反相鍵合相色譜。是采用反相鍵合相色譜。 烷基苯同系物分離分析烷基苯同系物分離分析 多環(huán)芳烴分離分析多環(huán)芳烴分離分析反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜定義定義固定相通過某種化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分固定相通過某種化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分 子以共價(jià)鍵結(jié)合在子以共價(jià)鍵結(jié)合在色譜擔(dān)體色譜擔(dān)體的表

50、面，的表面， 這種色譜類型稱之。這種色譜類型稱之。制備制備硅膠基質(zhì)硅膠基質(zhì)化學(xué)鍵合固定相注意點(diǎn)：化學(xué)鍵合固定相注意點(diǎn)：鍵合反應(yīng)前，將硅膠表面硅氧烷全部水鍵合反應(yīng)前，將硅膠表面硅氧烷全部水 解為硅烷醇。解為硅烷醇。除去硅膠表面吸附水，使表面完全呈自除去硅膠表面吸附水，使表面完全呈自 由硅醇基。由硅醇基。 形成化學(xué)鍵合固定相形成化學(xué)鍵合固定相 具備條件：具備條件：所用基質(zhì)材料所用基質(zhì)材料 應(yīng)有某種化學(xué)應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性反應(yīng)活性有能與基質(zhì)表面發(fā)生有能與基質(zhì)表面發(fā)生 化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)官能團(tuán)化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相 (P303) a. 硅氧碳鍵型：硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵

51、型：硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水，耐光，耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣穩(wěn)定，耐水，耐光，耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣 c. 硅碳鍵型：硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型：硅氮鍵型： SiN化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)：化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)：（1 1）傳質(zhì)快傳質(zhì)快: : 表面無深凹陷。表面無深凹陷。（2 2）壽命長壽命長: : 化學(xué)鍵合，耐流動相沖擊；化學(xué)鍵合，耐流動相沖擊； 穩(wěn)定。穩(wěn)定。 （3 3）選擇性好選擇性好: : 可鍵合不同官能團(tuán)，提高選可鍵合不同官能團(tuán)，提高選 擇性擇性（4 4）有利于梯度洗脫。有利于梯度洗脫。 由于產(chǎn)生弱極性固定相，因而擴(kuò)展了反相色由于產(chǎn)生弱極性固定相，因而擴(kuò)展了反相色譜分離技術(shù)

52、的應(yīng)用。譜分離技術(shù)的應(yīng)用。反相色譜反相色譜正相色譜正相色譜整理ppt存在著存在著雙重分離機(jī)制雙重分離機(jī)制：由鍵合基團(tuán)的由鍵合基團(tuán)的覆蓋率覆蓋率決定決定n高覆蓋率：分配為主；高覆蓋率：分配為主；n低覆蓋率：吸附為主。低覆蓋率：吸附為主。 常用反相鍵合固定相：常用反相鍵合固定相： C18、C8 P300P302整理ppt反相色譜保留機(jī)理反相色譜保留機(jī)理兩種觀點(diǎn)兩種觀點(diǎn):疏溶劑理論疏溶劑理論 （溶質(zhì)與極性溶劑疏遠(yuǎn)）（溶質(zhì)與極性溶劑疏遠(yuǎn)）雙保留機(jī)理雙保留機(jī)理 （殘留羥基）（殘留羥基）影響溶質(zhì)保留的因素影響溶質(zhì)保留的因素 流動相流動相 組分的保留隨流動相極性的減少而減少組分的保留隨流動相極性的減少而減少

53、, , ln kln k H H2 2O % , O % , 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑% % 增大增大, , 極性下降極性下降, k, k值隨值隨之下降。之下降。思考：思考：在在ODSODS柱上，用柱上，用70%70%甲醇甲醇/ /水或水或60%60%甲醇甲醇/ /水洗脫苯系物，哪一種流動相使苯系物的保水洗脫苯系物，哪一種流動相使苯系物的保留值大，為什么？留值大，為什么？ 鍵合固定相：鍵合固定相：a.a.烷基覆蓋量增加，烷基覆蓋量增加，k k值隨之增大。值隨之增大。 b. b.烷基鏈長增加烷基鏈長增加, k, k值隨之增大。值隨之增大。思考：思考： 同樣是同樣是70%70%甲醇流動相，苯在甲醇流動相，

54、苯在C C1818比比C C8 8柱柱上的保留值大，為什么？上的保留值大，為什么？ 溶質(zhì)溶質(zhì) 非離子化合物非離子化合物：極性大：極性大, k, k值小值小 非極性化合物：非極性化合物：分子表面積大分子表面積大, k, k值大值大 同系物：鏈長增大同系物：鏈長增大, k, k值增大值增大 苯系物：苯系物：環(huán)數(shù)增大環(huán)數(shù)增大, k, k值增大值增大; ; 若化合物的非極性部分相同若化合物的非極性部分相同, , 極性官能團(tuán)增極性官能團(tuán)增 加加, , 則則k k值下降值下降 幾何異構(gòu)體幾何異構(gòu)體：能形成內(nèi)氫鍵的異構(gòu)體的化合：能形成內(nèi)氫鍵的異構(gòu)體的化合 物物 k k值大。值大。碳鏈增大碳鏈增大 疏水性疏水

55、性增大增大 保留越大保留越大流動相極性增大，流動相極性增大，保留增大保留增大反相色譜中流動相選擇反相色譜中流動相選擇水有機(jī)改善劑水有機(jī)改善劑常用：常用：甲醇、乙腈、甲醇、乙腈、四氫呋喃、二氧六環(huán)四氫呋喃、二氧六環(huán)極性：有機(jī)改善劑水極性：有機(jī)改善劑水洗脫能力：有機(jī)改善劑水洗脫能力：有機(jī)改善劑水極性順序：極性順序：甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫呋喃甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫呋喃洗脫能力：洗脫能力：水甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫水甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫 呋喃呋喃反相鍵合相色譜的優(yōu)點(diǎn)：反相鍵合相色譜的優(yōu)點(diǎn)：流動相可選用水溶性流動相可選用水溶性 樣品的溶解度范圍提高樣品的溶解度范圍提高 流動相可變性大流動相可變性大 柱重現(xiàn)性好柱

56、重現(xiàn)性好固定相表面化學(xué)能低固定相表面化學(xué)能低 平衡容易平衡容易 梯度洗脫梯度洗脫固定相選擇多固定相選擇多固定相耐溶劑沖洗固定相耐溶劑沖洗 熱穩(wěn)定性好熱穩(wěn)定性好缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：流動相流動相PH范圍要控制范圍要控制（PH28） pH太低：太低：Si-C鍵易斷裂鍵易斷裂 pH太高：硅膠基質(zhì)易溶解太高：硅膠基質(zhì)易溶解游離的硅羥殘基影響分離游離的硅羥殘基影響分離（封尾）（封尾） P328-331 RR=H, CH3, (CH2)nCH3 n=1, 2, 3.思考思考 烷基苯同系物分離分析烷基苯同系物分離分析 多環(huán)芳烴分離分析多環(huán)芳烴分離分析出峰順序？出峰順序？如何選擇色譜條件？如何選擇色譜條件？如何優(yōu)化分離

57、？如何優(yōu)化分離？第四章、離子交換色譜，離子對色譜第四章、離子交換色譜，離子對色譜離子交換色譜：離子交換色譜：適用于離子型物質(zhì)的適用于離子型物質(zhì)的分離和分析分離和分析4-1 4-1 離子交換色譜離子交換色譜一一. .原理：原理：用離子交換劑用離子交換劑作固定相，以具有一定作固定相，以具有一定pHpH值的緩沖溶液作流動值的緩沖溶液作流動相，樣品中各離子依據(jù)相，樣品中各離子依據(jù)它們與離子交換劑的交它們與離子交換劑的交換能力大小來進(jìn)行分離換能力大小來進(jìn)行分離的色譜方法。的色譜方法。原理：原理：流動相流動相(溶質(zhì)離子溶質(zhì)離子)+離子交換劑離子交換劑(反離子反離子) 平衡時(shí)，平衡常數(shù)為平衡時(shí)，平衡常數(shù)為A

58、BRBARB/AK離子交換部分取代控制控制k可以改變流動相的離子強(qiáng)度可以改變流動相的離子強(qiáng)度注：注：只有當(dāng)溶質(zhì)呈離子狀態(tài)時(shí)，才能在離子只有當(dāng)溶質(zhì)呈離子狀態(tài)時(shí)，才能在離子 交換柱上有保留交換柱上有保留(流動相流動相p和溶質(zhì)都是很重要的參數(shù)和溶質(zhì)都是很重要的參數(shù))ABRBARB/AK/,AARKBBRkAB二、離子交換劑二、離子交換劑 陽離子交換劑陽離子交換劑帶負(fù)電荷官能團(tuán)帶負(fù)電荷官能團(tuán) -SO3-(磺酸型）、磺酸型）、 -COO-(羧酸型）羧酸型） 陰離子交換劑陰離子交換劑帶正電荷官能團(tuán)帶正電荷官能團(tuán) NH3（氨基型）、（氨基型）、NR3（季胺型）（季胺型）常見：常見：硅膠為基體的鍵合相離子交換

59、劑硅膠為基體的鍵合相離子交換劑 例例整理pptpH對交換容量的影響：對交換容量的影響：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性離子交換劑，交換性能不強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性離子交換劑，交換性能不受受pH影響，交換容量恒定。影響，交換容量恒定。弱酸性陽離子交換劑，在弱酸性陽離子交換劑，在較高較高pH條件下條件下 弱堿性陰離子交換劑，在弱堿性陰離子交換劑，在較低較低pH條件下條件下 發(fā)生離子交換發(fā)生離子交換pH與交換容量關(guān)系圖與交換容量關(guān)系圖三、離子交換色譜的影響因素三、離子交換色譜的影響因素流動相流動相PHPH的影響的影響例：例：弱酸弱酸 ：HAHHAH+ +A+A- - PHA PHA- - 交換能力交換能力ttR R PHA PH

60、A- - 交換能力交換能力ttR R 弱堿弱堿：-NH-NH2 2+H+H+ +-NH-NH3 3+ + PHNH PHNH3 3+ + 交換能力交換能力ttR R PHNH PHNH3 3+ + 交換能力交換能力ttR R 對分離不同對分離不同PKaPKa的酸堿是個(gè)有利因素的酸堿是個(gè)有利因素例例流動相中反離子的流動相中反離子的 形式和濃度形式和濃度 交換平衡常數(shù)交換平衡常數(shù)K KB/AB/A： 反映了溶質(zhì)和交換劑的親和力大小反映了溶質(zhì)和交換劑的親和力大小 親合力影響因素：親合力影響因素：a.a.電荷數(shù)電荷數(shù)親合力親合力b.b.離子的水合體積離子的水合體積親合力親合力c. c. 離子極化率離子