基因工程5-3 基因的分離、重組及重組體向受體細(xì)胞的導(dǎo)入

1、5.2 目的基因片段與載體目的基因片段與載體DNA的連接的連接5.2.1 粘性末端粘性末端DNA片段的連接片段的連接 大多數(shù)的限制性核酸內(nèi)切酶都能夠切割DNA分子，形成具有14個核苷酸的粘性末端。當(dāng)載體和外源給體DNA用同樣的限制酶，或是用能夠產(chǎn)生相同的粘性末端的限制酶切割時，所形成的DNA末端就能夠彼此退火，并被T4連接酶共價地連接起來，形成重組體分子。當(dāng)然，所選用的核酸酶對克隆載體DNA分子最好只具有一個識別位點，而且還是位于非必要的區(qū)段內(nèi)。 5.2.1.1 插入式插入式 （單酶切）（單酶切） 這種方法引導(dǎo)的外源DNA片段的插入，可以有兩種彼此相反的取向，這對于基因克隆是很不方便的。 5.

2、2.1.2 取代式（雙酶切）取代式（雙酶切） 根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶作用的性質(zhì)，用兩種不同的限制酶同時消化一種特定的DNA分子，將會產(chǎn)生出具有兩種不同粘性末端的DNA片段。如果載體分子和待克隆的DNA分子，都是用同一對限制酶切割，然后混合起來，那么載體分子和外源DNA片段將按一種取向退火形成重組DNA分子。這就是所謂的定向克隆(directional cloning)技術(shù)，可以使外源DNA片段按一定的方向插入到載體分子上。 5.2.2 非互補粘性末端非互補粘性末端DNA片段的連接片段的連接 載體分子和給體DNA片段經(jīng)不同的限制酶切割后，并不一定總能產(chǎn)生出互補的粘性末端，多為非互補的粘性末端或平末

3、端。對于平末端的DNA片段，可以用T4 DNA連接酶在一定的反應(yīng)條件下進(jìn)行連接；而具有非互補粘性末端的DNA片段，經(jīng)單鏈特異性的S1核酸酶處理變成平末端之后，也可以使用T4 DNA連接酶進(jìn)行有效連接。 但是，平末端DNA片段之間的連接作用，在效率上明顯地低于粘性末端之間的連接作用，而且重組之后便不能在原位刪除下來?，F(xiàn)在基因克隆實驗中，常用的平末端DNA片段連接法，主要有同聚物加尾法、銜接物連接法及接頭連接法。 5.2.2.1 同聚物加尾法同聚物加尾法 這種方法的核心是利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的特殊功能，此酶能夠?qū)魏塑账峒拥紻NA分子單鏈延伸末端的3OH上，該過程不需要模板。當(dāng)反應(yīng)物中只存在一

4、種脫氧核苷酸時，便能夠構(gòu)成由同一種類型的核苷酸組成的尾巴，其長度可達(dá)100個核苷酸。 為了在平末端的DNA分子上產(chǎn)生出帶3OH的單鏈延伸末端，需要先用5特異的核酸外切酶，或者Pst I一類的內(nèi)切酶處理DNA分子，以便移去少數(shù)幾個末端核苷酸。這樣在加有dATP和末端酶的反應(yīng)混合物中，DNA分子的3末端將會出現(xiàn)單純由腺嘌呤核苷酸組成的DNA單鏈延伸，這樣的延伸片段，稱之為poly(dA)尾巴。如果在反應(yīng)混合物中加入的是dTTP而不是dATP，則形成poly(dT)尾巴。這兩種尾巴是互補的，同樣poly(dG)尾巴和poly(dC)尾巴也是互補的，可以使兩個不同的DNA分子彼此連接起來。 同聚物尾巴

5、的長度沒有嚴(yán)格限制，一般只要1040個殘基就夠了。但由于poly(dA)和poly(dT)，poly(dG)和poly(dC)通常是不會嚴(yán)格等長的，這樣形成的重組體DNA分子上便會留有缺口或裂口，因此需要用大腸桿菌DNA聚合酶I或Klenow大片段去填補，然后再用DNA連接酶封閉缺口。 這種修復(fù)反應(yīng)不一定要在體外試管中進(jìn)行，如果互補的一對同聚物尾巴長度超過20個核苷酸，它們結(jié)合形成的堿基對結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，這樣的重組體分子可以直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中，由細(xì)胞內(nèi)部的DNA聚合酶和DNA連接酶對其進(jìn)行修復(fù)。 5.2.2.2 用銜接物連接平末端用銜接物連接平末端DNA片段片段 所謂銜接物(linker)，是指

6、用化學(xué)方法合成的一段由1012個核苷酸組成的具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。 銜接物的5末端和待克隆的DNA片段的5末端，用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后再通過T4 DNA連接酶的作用使兩者連接起來；接著用適當(dāng)?shù)南拗泼赶咩暯游锏腄NA分子和克隆載體分子，使二者都產(chǎn)生出了彼此互補的粘性末端，這樣就可以按照常規(guī)的粘性末端連接法，將待克隆的DNA片段同載體分子連接起來。 銜接物連接法兼具有同聚物加尾法和粘性末端法各自的優(yōu)點，而且它可以根據(jù)實驗的要求，設(shè)計具有不同限制酶識別位點的銜接物，并大量制備，以增加其在體外連接反應(yīng)混合物中的相應(yīng)濃度，從而極大地提高了平末端DNA片

7、段之間的連接效率。 用銜接物連接法獲得的重組體分子，只要用同樣的限制酶在插入位點切割，便可以重新分離出原來的DNA插入片段，方便于克隆片斷的再刪除或進(jìn)一步研究；而用T4 DNA連接酶的平末端連接法，或是同聚物加尾法構(gòu)建的重組體DNA，就無法用原來的限制酶作特異性的切割，因而不能獲得插入的DNA片段。 5.2.2.3 用接頭連接平末端用接頭連接平末端DNA片段片段 在應(yīng)用銜接物連接法時，如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部，含有與所加的銜接物相同的限制位點，則在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把克隆基因切成不同的片段，給后繼的亞克隆及其它操作造成麻煩。這時可以改用DNA接頭連接法。 DNA接

8、頭(adapter)是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當(dāng)它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之后，便會使后者成為具有粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。 接頭與銜接物的區(qū)別在于，接頭是一個具有粘性末端的短核苷酸雙鏈，它與平末端DNA連接后，不用經(jīng)過切割就可以與載體相連。 為防止各個DNA接頭分子的粘性末端之間通過互補配對形成二聚體分子，通常要對DNA接頭末端的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行必要的修飾與改造，使其平末端仍與天然雙鏈DNA分子一樣，具有正常的5P和3OH末端結(jié)構(gòu)，而其粘性末端5P則被修飾移走，被暴露出來的5OH所取代。 這樣，雖然兩個接頭分

9、子粘性末端之間仍具有互補堿基配對的能力，但因為DNA連接酶無法在5OH和3OH之間形成磷酸二酯鍵，而不會產(chǎn)生出穩(wěn)定的二聚體分子。但它們的平末端照樣可以與平末端的外源DNA片段正常連接，只是在連接之后需用多核苷酸激酶處理，使異常的5OH末端恢復(fù)成正常的5P末端，讓其可以插入到適當(dāng)?shù)目寺≥d體分子上。 5.2.3 連接反應(yīng)條件連接反應(yīng)條件1. 為了使連接反應(yīng)物中有盡可能多的外源DNA片段都能插入載體分子形成重組DNA ，必須盡量避免經(jīng)限制酶切割后線性載體分子自身的再環(huán)化作用，以提高DNA片段的插入效率。采取的措施有：(1) 采用不同的限制酶進(jìn)行切割，如BamH I和Hind III的粘性末端不同，自

10、身無法環(huán)化。 (2) 用堿性磷酸酶處理由限制酶消化產(chǎn)生的線性載體分子，除去載體DNA的5P末端，而留下5OH基團(tuán)，這樣的線性載體分子，除非插入了外源DNA片段，否則就不能重新環(huán)化成有功能的載體分子。 (3) 使用同聚物加尾連接技術(shù)，可以自動地防止線性載體DNA分子自身再環(huán)化作用，這是因為切割后形成的線性DNA分子的兩個3OH末端，都被加上了具有同樣堿基結(jié)構(gòu)的同聚物尾巴。 (4) 應(yīng)用柯斯質(zhì)粒，也可以防止質(zhì)粒DNA分子發(fā)生自身的再環(huán)化作用。 防止線性載體分子發(fā)生自身再環(huán)化作用十分重要，因為載體分子的重建，會導(dǎo)致非重組噬菌斑或抗藥性菌落的大量產(chǎn)生，結(jié)果使非重組體克隆的比例大幅度上升，從而也增加了選

11、擇或篩選重組體克隆的工作量。 2. 在連接反應(yīng)中，正確的選擇載體DNA和外源DNA之間的比例，是能否獲得高產(chǎn)量的重組體轉(zhuǎn)化子的一個重要因素。 (1) 用噬菌體或柯斯質(zhì)粒作載體時，連接反應(yīng)體系中載體DNA / 給體DNA的比例高，有利于重組體分子的形成，這是因為只有當(dāng)給體DNA片段的兩個末端都同載體分子結(jié)合之后，才能被有效地包裝。 (2) 用質(zhì)粒分子作為克隆的載體，載體DNA與給體DNA的比值為1時，有利于重組體分子的形成，因為這類重組體分子是由一個載體分子和一個給體DNA片段連接環(huán)化而成的。 3. 在體外連接反應(yīng)中，DNA的總濃度對形成什么樣的DNA分子類型也會有所影響。一般低濃度（低于20g

12、 DNA/mL）時，DNA分子間的相互作用機會少，有利于環(huán)化作用；而高濃度的DNA（高于300400g DNA/mL），則有利于形成長的多連體DNA分子。 4. 連接反應(yīng)的溫度也是影響連接效果的一個重要因素，研究表明，在4下保溫4h，沒有出現(xiàn)任何轉(zhuǎn)化子；而在26下連接1h就會產(chǎn)生很多的轉(zhuǎn)化子。事實上，在26下連接4h所得的轉(zhuǎn)化子數(shù)目，大約是4下連接23h的90%，而且是在4下連接4h的25倍以上。因而連接反應(yīng)通?？梢栽谑覝叵逻M(jìn)行。 16（用冰浴調(diào)節(jié)溫度），612小時。 5.3 重組體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入重組體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入 帶有外源DNA片段的重組體分子在體外構(gòu)成之后，需要導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞進(jìn)行

13、繁殖，才能獲得大量的純一的重組體DNA分子，這一過程叫做基因的擴(kuò)增。 將外源重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑有多種，其中轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適用于細(xì)菌一類的原核細(xì)胞和酵母這樣的低等真核細(xì)胞，而顯微注射和電穿孔則主要應(yīng)用于高等動植物的真核細(xì)胞。 選定的寄主細(xì)胞必須具備使外源DNA進(jìn)行復(fù)制的能力，而且還應(yīng)該能夠表達(dá)由導(dǎo)入的重組體分子所提供的某種表型特征，這樣才有利于轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的選擇與鑒定。 在所有的關(guān)于重組DNA的研究工作中，都使用了大腸桿菌K12突變體菌株，該菌株由于喪失了限制體系，故不會使導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的未經(jīng)修飾的外源DNA發(fā)生降解作用。對于大腸桿菌寄主，無論是轉(zhuǎn)化還是轉(zhuǎn)導(dǎo)，都是十分有效的導(dǎo)入外源

14、DNA的手段。 5.3.1 重組體重組體DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)化（transformation）嚴(yán)格地說是指將質(zhì)粒DNA分子引入大腸桿菌細(xì)胞的過程；而轉(zhuǎn)染則是指噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞的過程。從本質(zhì)上講，兩者并沒有根本的區(qū)別。 無論轉(zhuǎn)化還是轉(zhuǎn)染，其關(guān)鍵因素都是用氯化鈣處理大腸桿菌細(xì)胞，以提高膜的通透性。細(xì)菌轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）的具體操作程序是： (1) 選取新鮮幼嫩的受體細(xì)胞（如大腸桿菌HB101），培養(yǎng)一定時間使其OD550nm達(dá)到0.5；將培養(yǎng)好的細(xì)胞放在冰浴中冷凍10min，然后在4000 rpm下離心5min，收集沉淀細(xì)胞。 (2) 將沉淀細(xì)胞重新懸浮在預(yù)冷的無菌

15、的50mM CaCl2和TrisHCl (pH 8.0)中，放置冰浴5min，同樣離心收集沉淀細(xì)胞，重新懸浮，即成為感受態(tài)細(xì)胞，冰凍備用。 (3) 取出冰凍感受態(tài)細(xì)胞，加入連接反應(yīng)混合物（重組DNA），在42水浴中作2min的熱刺激（讓外源DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)）。 (4) 如果使用的是噬菌體DNA（即轉(zhuǎn)染過程），那么可以將經(jīng)過上述處理的細(xì)菌直接涂布在培養(yǎng)基平板上，于37下培養(yǎng)，此時已經(jīng)捕獲了DNA的細(xì)胞經(jīng)過一段時間后，會釋放出大量的子代噬菌體顆粒，如此重復(fù)下去，最終會在平板的細(xì)菌菌苔上形成噬菌斑。 (5) 如果使用的是質(zhì)粒的DNA（即轉(zhuǎn)化過程），那么首先應(yīng)將細(xì)菌放置在非選擇性的LB培養(yǎng)基中，37保

16、溫一段時間，以促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型（Tetr或Ampr）得到充分的表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂布在含有四環(huán)素或氨芐青霉素的選擇性平板上。 注意控制轉(zhuǎn)化條件，使每個細(xì)胞只進(jìn)入一個重組體質(zhì)粒DNA分子，在選擇性平板上一個轉(zhuǎn)化子細(xì)胞便會生長成為一個單菌落。每一個這樣的菌落都只含有一種來源于同一個轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的同源質(zhì)粒群體，這樣的單菌落通常又稱為克隆。 在普通的轉(zhuǎn)化實驗中，每微克pBR322質(zhì)粒DNA可以獲得106左右的轉(zhuǎn)化子菌落，每微克噬菌體的DNA可以獲得104106噬菌斑。然而當(dāng)使用重組DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，轉(zhuǎn)化的頻率一般要下降102104倍，這是因為：一方面由于載體分子同插入DNA片段間的

17、連接作用經(jīng)常是無效的，結(jié)果便大大地降低了有功能的質(zhì)粒或噬菌體DNA的實際數(shù)量；另一方面由于含有插入DNA片段的載體分子一般都比較大，這樣也會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）的頻率再度明顯下降。 因此，為了提高轉(zhuǎn)化的頻率必須采取必要的措施，抑制那些不帶有外源插入DNA片段的噬菌體DNA或質(zhì)粒DNA分子形成轉(zhuǎn)化子菌落。應(yīng)用堿性磷酸酶處理法，可以阻止不帶有插入DNA片段的載體分子發(fā)生自身再環(huán)化的作用，從而提高了轉(zhuǎn)化效率。 5.3.2 重組體的體外包裝及重組體的體外包裝及 噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo) 另一種將外源重組DNA分子導(dǎo)入寄主細(xì)胞的方法，即所謂的體外包裝顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)，它先將重組的噬菌體DNA或重組的柯斯載體DN

18、A，包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒，然后經(jīng)由在受體細(xì)胞表面上的 DNA接受器位點，使這些帶有目的基因序列的重組體DNA注入大腸桿菌寄主細(xì)胞。 在第四章中已經(jīng)討論過，將外源重組的 DNA包裝成為具有感染活性的噬菌體顆粒，需要從兩株對噬菌體溶源性的大腸桿菌中制備出一對互補的提取物。例如，在噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因A和E發(fā)生了無義突變的兩個溶源性菌株（如NS1128和433），或者是在噬菌體基因D和E發(fā)生了無義突變的兩個溶源性菌株（如BHB2690和2688）。 從突變體D菌株純化的蛋白質(zhì)提取物，含有大量未成熟的噬菌體頭部前體顆粒，從突變體A菌株純化的蛋白質(zhì)提取物，同樣也含有大量中空的頭部前體顆粒，而從突變體E菌株純化的蛋白質(zhì)提取物中，積累了大量的尾部蛋白質(zhì)。因此，E菌株的提取物可同另一種含有中空的頭部前體顆粒的D菌株（或A菌株）的提取物互補，完成噬菌體的形態(tài)建成。 在良好的體外包裝反應(yīng)條件下，每微克野生