PCNP沉默真核表達載體重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1、PCNP沉默真核表達載體重組質(zhì)粒的構(gòu)建PCNP沉默克核卷達載怵逐組質(zhì)粒，可冇效沉默細胞中PCNP的表達“世成功轉(zhuǎn)染進鞫穽狀細1后.WiPCNP15種寵壽命飯白的功能特説例如對婦嵐生長血紅的匪響.甘卿咆増曬周期的宀圧一八1：忙1也為卜步研究時淋巴祥刖并訕怕對妙I(lǐng)MI胞的功昵性作用莫定基礎(chǔ).井為研咒樹哭狀縮魁中較為重要的功能例如調(diào)控H7-怙號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抗原遞呈尊握佻蚪期理論恢擁沉默質(zhì)粒的構(gòu)建也足前汨的技術(shù)我們通過國內(nèi)外不冏sRNA設(shè)計網(wǎng)站，結(jié)合自身的特點，優(yōu)化對比了不同設(shè)計恩路*選泄其發(fā)L結(jié)構(gòu)為最終方案.Z后按照買設(shè)計特點優(yōu)化和修改實鑒步軌.2.2材料，試劑與儀器工工1載體，菌種來源11】頁枝義達

2、pSilence4.1-CMVne口由本實驗探存匸2）EooliTOP10為本實矗晝凍存2.2,2主要試劑1）逆曙堿試刊盒購口Promega公司:（.2）TrizalReagent曲打|Invitrogen公m:3）E3TaqDNA#合晦、Hind/ABamH/限制杵內(nèi)切酶、T4連接蕭等購目TaflraRa公司：4）質(zhì)料DNA小礙提取試劑盒“DNA片段回收試劑盒.脾自TIANGEN司：主要儀器（D生拘安全柜ThemiaA/B3,USA）(2) 恒溫搖床(ThermoForma_Ma:xQ?000)制冰機ScotsmanAF10.USA)(3) 髙圧滅茵器(LDZX40BI,上海屮安)PCR儀(

3、BioRad)(4) 紫外分光光度計(Beckman),凝膠圖像成橡儀(AlphaImitech公司產(chǎn)骷)(5) 恒漏水浴Ifi(Gi-ant,GD100,England)超純水設(shè)備(Elix5Millipore,Milli-Qplus,France)(10)臺式高速離心機(Eppendoif)(11)臺式低隘離心機(EppaicLorf.USA)2.3實驗方法2.3.1 siRNA設(shè)計迪過不同網(wǎng)站設(shè)計出以卜三対符合發(fā)K結(jié)構(gòu)并沉默效率較髙的弓I物，酶切位點肉為卜游BamL下游HindIII.pS-l：5；GATCCCGTJAACCAGTATTCTGAATTICAAGAGAATTCAGAAIAC

4、TUGTTCACrrmTCCAA.GCTT3pS-2：5GGATCCCGGTATAGCATTOTATGAAGTIUAAGAGACTICAIACAATGCrmCCrmTIVCAAAAGCTT3，pS-3:5GGATCCCGTCGTACCTnCTAAGAATTT7AAGAGAATirTTA.GAAAGGTACCACTITmrCAAAAGC3附設(shè)計網(wǎng)站:http酶切pSilence4.1-CMVneo載體及其回收引物設(shè)計分別以Hind/和BamH/作為兩個基因的酶切位點，將典核我達載體pSilence4.1-CMVneo進行酶切.之后通過瓊脂稱膠進行回收.純化.酶切體系如下:pSilence4.1-

5、CMTneo2MlHindHI0.51BamHI0.5plddH3O6idlOKBufferHd10山TotalvolumeZ后37C酚切l(wèi)-2h.爾切反應(yīng)完成啟根據(jù)TIANGENDNA凝膠冋收試劑翕說明書進行11的解因的冋收.tVDL2000標(biāo)淮條帶分離刊各個位豐后.便用議外了提燈找到位貿(mào)大小相符合的*帝AjOJT-術(shù)刀切下含LI的英因的凝膠塊.在夭平秤進行稱重，Z后按照噴膠質(zhì)量休枳比加入3侶體枳的澆股液PN仕預(yù)溫dire的1ML水浴箱中水浴8mim直至膠塊完全希化。將得到的涪膠液便出移液槍轉(zhuǎn)移至吸附柱CA?內(nèi).放豐空溫2mm,Z后將吸附柱放于離心機中按照12000rpm.離心1min進行離

6、心,隨后丿川入70唄漂洗液PW,再次族十離心機屮按照12000ipm、離心1min再次離心.此步驟取貝一次.Z后將吸附柱CA?放置空溫數(shù)分鐘，用移液槍在吸附膜中央懸空滴加預(yù)熱65C301的詵脫緩沖液，室溫按照12000ipm再次離心2imn.收集DNA溶液，即為LI的基岡回收產(chǎn)物。雙鏈RNA合成RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是由取鏈RNA(double-strandedRNA.dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特界性降解的.所以需鄆設(shè)計好的肌鏈RNAft成為女錘RNA“片先將公訶合成好的RNA稀釋至1Opmol/nL按20fill入EP潼中，Z后將裝入RNA的EP管放

7、入裝有沸水的保溫杯中：便保溫杯中的水溫任l2h內(nèi)逐步降溫至37VO此時單儀RNA即可合成為雙隧RNA為鑒定合成效率,在同等條件下同時設(shè)計?3組陰性對照(不加入oligo(55bp),克接進行轉(zhuǎn)化雙酶切連接，鑒定將中酶切，回收，純化好的pSilence4.1-CMVneo載體同臺成好的女鏈RNA按脫F列體系混合均勻。連接體系為：雙詵RNA6山pSilence4.1-CMTneo1山10xT4DNA緩沖液0.5idL5pl1唄T4DNA連接酚ddH3OTotalvolume16C連接過夜.制備EcollTOPI0感受態(tài)細胞(1)試劑配制1) LB培養(yǎng)基：NaCl5g胰不白腺5g酵母提取物2.5g煤

8、上述試劑定iffJ500ml水中，便用磁力攪拌器lOminZ后LB璃界基分裝到50mL培養(yǎng)瓶屮，高壓火菌厲.放Sf4-C保存?zhèn)溆谩?) 含瓊脂軸LB培養(yǎng)基：酵母提取物0.5g胰蛋白腺lgNaCllg瓊脂耕1.5g將I述試劑定干100ml水中.使用越力攪拌器lOnum齋樂滅閑后.取出均勻搖動諾養(yǎng)瓶，但需緩慢以免產(chǎn)牛氣泡.待培養(yǎng)呈溫度降至約5(TC時加入Amp溶劑(100Fig/ml).在紫外消奇后的超凈工作臺內(nèi)鋪不同的培養(yǎng)皿中.3) 0.5mol/LPIPES：PEPES3O.2g超純水160ml用固體KOH調(diào)節(jié)pH至6.7.定容至200ml.4) Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液:MnCly4H3O5.4

9、4gCaCl3-2H3O1.10gKC19.3gPIPES(0.5mol/LpH=6.7)10ml蒸懾水使用0.22pm微孔濾膜過濾除菌5001（2）操作步陳1）將超凈工作臺進行紫外消毒半小時以上.ffiffl酒轉(zhuǎn)柿球擦拭揮發(fā)后便用2）將凍存于809的E.coliTOPlOliR按照順時什均勻劃【AMLB培養(yǎng)皿中，Z后倒遇放邊J：37C溫箱培界12-14小時：3）12-14小時后挑選形態(tài)敘好的單龍隆用小槍尖取出后打入5ml液態(tài)LB培養(yǎng)基中,放于379.200ipm恒溫怛定搖加14小時：4）収過夜培養(yǎng)的曲液2ml接種F200ml培養(yǎng)液中，放Sf37*C.200rpm搖床中,大約3hr直至菌液OD

10、Mo比值約為0.6即可:5）將茵液冰浴10min,2500g,4C離心10mm.棄去卜.淸；6）在菌液沉淀中加入80ml預(yù)冷的Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液審懸細菌.Z后放于4C,2500g離心機離心10min再次棄去上淸：7）再次加入5ml預(yù)冷Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液機懸細菌：8）用后加入0.3mlDMSO,10min冰浴，100山分裝，凍存干-80轉(zhuǎn)化從-SO*C冰箱取感受:態(tài)細胞E.coliTOP10一支.StF冰中解凍，然后冰浴10min.把連接產(chǎn)物10山加入E.coliTOPI0中.輕輕混勻，30min冰浴，429水浴90sec,冰浴2min.在超凈工作臺中加入37C預(yù)熱無抗生素的LB焙養(yǎng)液800

11、pl混勻，放入37C180rpm恒溫搖床中，振蕩焙養(yǎng)45minZ后離心30sec恭部分卜淸，悄取約100心便用然蕩儀氓懇后按照順時針方向均勻涂任含Amp（WQ“g/ml）的37C固體LB培券皿上.待兀晾T倒連培探37恒溫箱中14hr.挑取陽性克隆挑取單個歯落至5ml的培養(yǎng)基中（含100g/mlAmp）,37*C.180rpm|定搖動培養(yǎng)14hr按照質(zhì)粒小提試劑盒說明提取陽性克隆的顧粒：首先取4ml菌液至EP管內(nèi)，離心1mm12000g,盡屋棄除卜.淸液.在菌液沉積中加入300山濟液I用移液槍或者菖蕩儀充分匝懇葡體，然后加入300山濟液II立即溫和上下翻轉(zhuǎn)8J0次.以便葡液充分裂解.之萬加入40

12、0ulin液III再次立即溫和顛倒810次.離心lOmin12000g.小心吸取上淸轉(zhuǎn)至（2平衡過的吸附住CP3內(nèi)，離心limn.12000g.棄人廢液，加入700山?jīng)鱿匆?，離心1min12000g.棄去廢液，此步驟審復(fù)兩次以便洗凈.然后空離2min.12000gHi乙醇充分揮發(fā).將吸附柱CP3轉(zhuǎn)移至一干凈的EP管內(nèi)，宅溫靜置5mm后，在膜中央滴入50山預(yù)熱60C的洗脫液，宅溫放E2mm.離心1nun,12（JOOgZ后把質(zhì)粒（復(fù)到離心管中.挑取克隆并提前質(zhì)粒后送上海英駿生物技術(shù)（Invitmgen）有限公司測序.2.4實驗結(jié)果因所設(shè)計的siRNA片段校?。?5bp）無法用PCR悔切進行鑒定所

13、以提取質(zhì)粒后貢接送往公司進行測序，測序結(jié)果如下：2.4.1 pS-1鑒定結(jié)果PCNP-NM_001024622-CMV-PS4.1-1（圖2-1）測序結(jié)果：NNNAAGNNNGAGCTTATAGCAGAGCTGGTTTAGTGaACCGTGGATCCCGTGAACCAG1ATTCTGAATTTCAAGAGAATTCAGAA1ACTGGTTCACTTTTTTCCAAAAGCT1AATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTATGCGGCCGCTAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGT

14、TACCCAACT1AATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAA1AGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCA1AGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTC

15、CGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTC

16、AGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGN圖2-1PS4.1-1測序結(jié)果2.4.2 pS-2鑒定結(jié)果PCNPNM_0（

17、H024622CMVPS4.12（I暫2-2）測序結(jié)果：NNCAANTNGGNGNTTATATAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTGGATCCCGGTA1AGCATTGTATGAAGTTCAAGAGACTTCATACAATGCTATACCTTTTTTCCAAAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGATCTCTGTGTTCGTTTTTTGTATGCGGCCGCTAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCG

18、TAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCAIAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGC

19、GAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATG

20、CAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTT1ATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCNCTGCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGANCTTGTATTATCCAT圖2-2PS4.L2測序結(jié)果2.4.3 pS3鑒定結(jié)果PCNP-NM_OO1024622-CMV-PS4.1-3（圖2-3）測序結(jié)果：CNNN

21、NANGNGGGGNTATATAAGCAGAGCTGGTT1AGTGAACCGTGGATCCCGTGGTACCTTTCTAAGAATTTCAAGAGAATTCTTAGAAAGGTACCACTTTTTTCCAAAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTATGCGGCCJGCTAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCC

22、TTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTA.CAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTAT

23、TTTTATAGGT1AATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAA1ACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCNAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAGCTCCCGGGAGCTGTA圖2-3PS4.1-3測序結(jié)果鑒定結(jié)果表明所設(shè)計的三對PCNP沉默況孩表達栽體業(yè)組頗粒均