乙肝疫苗的制備課件

1、基因工程(jyn gngchng) 乙肝疫苗的制備 演 講 者： 鞠 林 PPT 制 作者(zuzh)：楊秀蘭 李翠華 歐永銀資料(zlio)提供者：鞠林劉珍王偉杰彭博周永斌李凱向運新朱曉東第一頁，共二十二頁?；蚬こ潭x：又稱為重組DNA技術(shù)，指將某些特定的基因(jyn)或DNA片斷，通過載體或其它手段送入受體細(xì)胞，使它們在受體細(xì)胞中增殖并表達(dá)的一種遺傳學(xué)操作。是生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀并能穩(wěn)定遺傳。作用：可把來自任何生物的基因轉(zhuǎn)移到與其毫無關(guān)系的任何其他受體細(xì)胞中，可以任意改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀。某一段DNA可在受體細(xì)胞內(nèi)進行復(fù)制，為制備大量純化的DNA

2、片段提供了可能.第二頁，共二十二頁。獲得目的(md)基因表達(dá)(biod)載體重組的表達(dá)(biod)載體酶切、連接宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等原核生物細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞卵細(xì)胞培養(yǎng)的動物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動物胚胎發(fā)育藥物、疫苗轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因微生物基因工程藥物人類細(xì)胞基因治療第三頁，共二十二頁。蛋白質(zhì)名稱 用 途 促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotrophic hormone） 治療風(fēng)濕（rheumatic disease）B細(xì)胞生長因子（B-cell growth factor） 治療免疫系統(tǒng)功能失調(diào)降鈣素(calcitonin) 治療軟骨病(osteomalacia)集落刺激因子(colony

3、stimulating factor) 治療血液病、腫瘤輔助治療絨毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin) 治療不排卵癥內(nèi)啡肽和腦啡肽(endorphine and enkephalin) 鎮(zhèn)痛劑(analgesic agent)上皮生長因子(epidermal growth factor) 促進傷口愈合紅細(xì)胞生成素(erythropoietin) 治療貧血(anemia)凝血因子(factor ) 治療血友病(hemophilia)凝血因子(factor ) 治療血友病生長激素(growth hormone) 促進生長生長激素釋放(shfng)因子(growth hor

4、mone releasing factor) 促進生長胰島素(insulin) 治療糖尿病(diabetes)干擾素(interferon) 抗病毒抗腫瘤白細(xì)胞介素(interleukin) 治療癌癥第四頁，共二十二頁。第五頁，共二十二頁。 基因重組乙肝疫苗基因重組乙肝疫苗 用基因重組技術(shù)把乙型肝炎病毒用基因重組技術(shù)把乙型肝炎病毒(bngd)的表面抗原的表面抗原 （HbsAg）基因片段插入酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞的基）基因片段插入酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞的基因中，在體外培養(yǎng)增殖過程中組裝或分泌出乙型肝炎表因中，在體外培養(yǎng)增殖過程中組裝或分泌出乙型肝炎表面抗原，然后把表面抗原收集起來提純之后做成乙型

5、肝面抗原，然后把表面抗原收集起來提純之后做成乙型肝炎疫苗。炎疫苗。第六頁，共二十二頁。乙肝疫苗的制備(zhbi)第七頁，共二十二頁。目的基因(jyn)的獲取編碼乙型肝炎表面抗原的基因的獲取一般的目的基因的獲取方法(fngf)有：反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法cDNA文庫(wnk)的建立？第八頁，共二十二頁。cDNA文庫文庫(wnk)的建立的建立第九頁，共二十二頁。工程菌的構(gòu)建(u jin) CHO細(xì)胞的特點具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能 ,表達(dá)的糖基化藥 物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最 接近于天然蛋白分子具有產(chǎn)物胞外分泌功 能 ,便于下游產(chǎn)物分離純化;具有重組基因的高效 擴增

6、和表達(dá)能力; 具有貼壁生長特性 ,且有較高的 耐受剪切力和滲透壓能力 ,可以進行懸浮培養(yǎng) ,表達(dá) 水平較高; CHO 細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞 (fibrob2last) ,很少分泌(fnm)自身的內(nèi)源蛋白 ,利于外源蛋白的后分離第十頁，共二十二頁。 材料菌株質(zhì)粒及細(xì)胞大腸桿菌(d chn n jn) DH5 和質(zhì)粒 pMD18-Sm（攜帶改變稀 有密碼子后的 S 基因）質(zhì)粒 pCIneoCHO dhfr-細(xì)胞pMD18-T 載體第十一頁，共二十二頁。 主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4 DNA ligase、質(zhì)粒 DNA 提取 和柱式膠回收試劑盒乙型肝炎表面抗原檢測(jin c)試劑盒DMEM 和透析胎牛

7、血清胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂質(zhì)體 Lipofectamine TMHBsAg 血凝檢測試劑盒第十二頁，共二十二頁。 目的基因(jyn)的表達(dá)第十三頁，共二十二頁。 蛋白質(zhì)的分離(fnl)純化第十四頁，共二十二頁。 濃縮與初步純化離子交換層析疏水層析親和層析 固液分離離心沉淀膜過濾雙水相萃取 高度純化DNA的去除(q ch)熱原質(zhì)的去除病毒的去除第十五頁，共二十二頁。 分離純化的基本要求技術(shù)條件溫和，保持其生物活性選擇性好，達(dá)到有效分離純化的目的技術(shù)間可以直接連接，節(jié)省工藝步驟(bzhu)收率高，過程快 選擇分離純化方法的依據(jù)根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇根據(jù)分離單元之間的銜接來選擇根據(jù)分離純化

8、工藝的要求來選擇第十六頁，共二十二頁。分離純化(chn hu)工藝流程第十七頁，共二十二頁。 1、發(fā)酵液的預(yù)處理連續(xù)高速離心，除去細(xì)胞殘片，再超濾濃縮 2、疏水柱層析介質(zhì)： Butyl S Sepharose FF 加入適量硫酸銨，調(diào)節(jié)電導(dǎo)率與柱層析平衡液電導(dǎo)率相等按照平衡柱床、上樣吸附、平衡液洗柱、降低(jingd)硫酸銨濃度解析、清柱再生程序?qū)游?第十八頁，共二十二頁。 3、陰離子交換柱層析 介質(zhì)：DEAE Sepharose FFHBsAg活性蛋白經(jīng)Sephadex G-25柱脫鹽換液，使緩沖鹽系統(tǒng)的PH、離子強度和IEC平衡液一致按照平衡柱床、丄樣吸附、氯化鈉濃度梯度分段洗脫(x tu)、清柱再生程序?qū)游龅谑彭?，共二十二頁?4、凝膠過濾柱層析介質(zhì)：Sepharose 4 FF 超濾濃縮到適當(dāng)(shdng)體積按照平衡柱床、丄樣、洗脫程序?qū)游?5、除菌收取到的HBsAg除菌過濾，即為純品第二十頁，共二十二頁。謝謝(xi xie)觀賞第二十一頁，共二十二頁。內(nèi)容(nirng)總結(jié)基因工程。是生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀并能穩(wěn)定遺傳。某一段DNA可在受體細(xì)胞內(nèi)進行復(fù)制，為制備大量純化的DNA片段提供了可能.。具有產(chǎn)物胞外分泌功 能