免疫學試驗技術

1、現(xiàn)在學習的是第一頁，共22頁現(xiàn)在學習的是第二頁，共22頁免疫學技術免疫學技術 利用免疫學反應的特異性原利用免疫學反應的特異性原理建立的各種檢測與分析技術以及建立理建立的各種檢測與分析技術以及建立這些技術的各種制備方法。這些技術的各種制備方法。 包括包括 ：l免疫血清學技術免疫血清學技術 用于抗原或抗體檢測用于抗原或抗體檢測的體外免疫反應技術；的體外免疫反應技術；l細胞免疫技術細胞免疫技術 用于研究機體細胞免用于研究機體細胞免疫功能與狀態(tài)的技術；疫功能與狀態(tài)的技術；l免疫制備技術免疫制備技術 指制備與免疫檢測有關指制備與免疫檢測有關制劑的各種技術。制劑的各種技術。 現(xiàn)在學習的是第三頁，共22頁

2、淋巴細胞計淋巴細胞計數(shù)與分類數(shù)與分類淋巴細胞功淋巴細胞功能測定能測定細胞因子測定細胞因子測定 E玫瑰花環(huán)試驗玫瑰花環(huán)試驗T細胞亞群檢測試驗細胞亞群檢測試驗淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗細胞毒性細胞毒性T細胞試驗細胞試驗巨噬細胞移動抑制試驗巨噬細胞移動抑制試驗白介素測定白介素測定干擾素測定干擾素測定 用用 途途免疫機理免疫機理 診斷診斷 治療治療 藥物選擇藥物選擇類類 型型 + + - + + - - + + + - + + + - + + + - + + - + + + - + +體內(nèi)細胞免疫試驗體內(nèi)細胞免疫試驗皮膚試驗皮膚試驗+ + - +試驗名稱試驗名稱現(xiàn)在學習的是第四頁，共22頁1.1

3、 T1.1 T細胞細胞E E玫瑰花環(huán)試驗玫瑰花環(huán)試驗 檢測檢測T T細胞細胞 T T淋巴細胞表面淋巴細胞表面CD2CD2分子是綿羊紅細胞（分子是綿羊紅細胞（SRBCSRBC）受體，也稱）受體，也稱E E受體，在一定條件下，受體，在一定條件下，SRBCSRBC環(huán)環(huán)繞繞T T細胞與之結(jié)合，形成花環(huán)狀，稱細胞與之結(jié)合，形成花環(huán)狀，稱E E花環(huán)（花環(huán)（E-rosetteE-rosette），形成此種花環(huán)的細胞稱），形成此種花環(huán)的細胞稱E E花環(huán)形成細花環(huán)形成細胞。胞。 1.2 EA1.2 EA玫瑰花環(huán)試驗玫瑰花環(huán)試驗 檢測檢測B B細胞細胞 B B淋巴細胞有表面淋巴細胞有表面FcFc受體，以雞紅細胞作

4、為指示細胞與相應的抗紅細胞抗體形成受體，以雞紅細胞作為指示細胞與相應的抗紅細胞抗體形成EAEA，B B淋巴細胞可以通過淋巴細胞可以通過FcFc受體與受體與EAEA形成花環(huán)，以此計算形成花環(huán)，以此計算B B淋巴細胞的數(shù)目。淋巴細胞的數(shù)目。 1.3 EAC1.3 EAC玫瑰花環(huán)試驗玫瑰花環(huán)試驗 檢測檢測B B細胞細胞 B B淋巴細胞表面具有補體淋巴細胞表面具有補體C3C3受體，紅細胞可與相應的抗體結(jié)合形成抗原抗體復合受體，紅細胞可與相應的抗體結(jié)合形成抗原抗體復合物（物（EAEA），進而與補體結(jié)合），進而與補體結(jié)合( EAC)( EAC)，然后與，然后與B B淋巴細胞表面的補體淋巴細胞表面的補體C3

5、C3受體結(jié)合而形成受體結(jié)合而形成花環(huán)，以供計數(shù)花環(huán)，以供計數(shù)B B淋巴細胞。淋巴細胞。 現(xiàn)在學習的是第五頁，共22頁現(xiàn)在學習的是第六頁，共22頁現(xiàn)在學習的是第七頁，共22頁1.4 1.4 酯酶染色法酯酶染色法 ANAEANAE+ + 檢測檢測T T細胞細胞 T T淋巴細胞的胞漿內(nèi)存在著酸性淋巴細胞的胞漿內(nèi)存在著酸性a a 醋酸萘酯酶醋酸萘酯酶(ANAE(ANAE+ + ) )，在酸性條件下，能使底物醋酸萘酯水，在酸性條件下，能使底物醋酸萘酯水解產(chǎn)生解產(chǎn)生a a 萘酚，萘酚， 而而a a 萘酚與六偶氮副品紅作萘酚與六偶氮副品紅作用形成不溶性的紅色沉淀物而沉積在用形成不溶性的紅色沉淀物而沉積在T

6、T淋巴細胞淋巴細胞胞漿內(nèi)酯酶所在的部位。胞漿內(nèi)酯酶所在的部位?，F(xiàn)在學習的是第八頁，共22頁l2.T2.T細胞亞群檢測技術細胞亞群檢測技術 T T細胞總數(shù)：細胞總數(shù)：CDCD3 3；T TH H:CD:CD4 4；T Tc c:CD:CD8 8 應用針對應用針對CDCD抗原的單抗來鑒別各抗原的單抗來鑒別各T T細胞亞群。細胞亞群。 2.1 2.1 間接免疫熒光法間接免疫熒光法 分離淋巴細胞分離淋巴細胞 CDCD單抗單抗 熒光二抗熒光二抗 鏡檢計數(shù)鏡檢計數(shù) 2.2 2.2 流式細胞術流式細胞術 分離淋巴細胞分離淋巴細胞 CDCD單抗單抗 熒光二抗熒光二抗 FACSFACS測試管測試管 計數(shù)計數(shù) 現(xiàn)

7、在學習的是第九頁，共22頁 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 淋巴細胞在體外培養(yǎng)時，受到非淋巴細胞在體外培養(yǎng)時，受到非特異性有絲分裂原（如特異性有絲分裂原（如PHAPHA、ConAConA）或特異性抗原刺）或特異性抗原刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加、細激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加、細胞體積增大并能進行分裂的淋巴母細胞，此稱為淋巴胞體積增大并能進行分裂的淋巴母細胞，此稱為淋巴細胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低，可以反映機細胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低，可以反映機體的細胞免疫水平，因此，可作為測定機體免疫功能體的細胞免疫水平，因此，可作為測定機體免疫功能的指標之一。

8、的指標之一。 淋巴胞轉(zhuǎn)化試驗的方法有淋巴胞轉(zhuǎn)化試驗的方法有形態(tài)學方法、形態(tài)學方法、MTTMTT法、法、3H-3H-胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（3H-TdR3H-TdR）摻入法）摻入法?，F(xiàn)在學習的是第十頁，共22頁l1 1、原理、原理 淋巴細胞在體外培養(yǎng)過程中受有絲分裂原淋巴細胞在體外培養(yǎng)過程中受有絲分裂原如植物血凝素（如植物血凝素（PHAPHA）等刺激后，可轉(zhuǎn)化為體積較）等刺激后，可轉(zhuǎn)化為體積較大的母細胞，胞漿增多而深染，核增大并可見核大的母細胞，胞漿增多而深染，核增大并可見核仁部分細胞可出現(xiàn)有絲分裂，計數(shù)轉(zhuǎn)化細胞的百仁部分細胞可出現(xiàn)有絲分裂，計數(shù)轉(zhuǎn)化細胞的百分率可反映機體的細胞免疫功能。分率

9、可反映機體的細胞免疫功能。現(xiàn)在學習的是第十一頁，共22頁l2、方法、方法 （1 1）取無菌肝素抗凝血）取無菌肝素抗凝血0.1ml0.1ml，加入，加入1.8ml1.8ml細胞培養(yǎng)液中，同時細胞培養(yǎng)液中，同時加入加入PHAPHA（1000g/ml1000g/ml）0.1ml0.1ml，對照管不加，對照管不加PHAPHA，將細胞置，將細胞置3737、5%CO25%CO2培養(yǎng)培養(yǎng)3 3天，每天搖動天，每天搖動1 1次。次。 （2 2）培養(yǎng)結(jié)束時吸棄大部分上清液，加入）培養(yǎng)結(jié)束時吸棄大部分上清液，加入4mlNH4Cl4mlNH4Cl（8.5g/L8.5g/L）混勻，）混勻，置置3737水浴水浴10mi

10、n10min。 （3 3）2500r/min2500r/min離心離心10min10min后棄去上清液，沉淀加后棄去上清液，沉淀加5ml5ml固定液，室固定液，室溫作用溫作用10min10min。 （4 4）離心（）離心（2500r/min2500r/min，10min10min）后棄上清液，留）后棄上清液，留0.2ml0.2ml沉淀細胞制沉淀細胞制片，迅速吹干。片，迅速吹干。 （5 5）吉姆薩染色）吉姆薩染色1020min1020min，水洗，干燥。，水洗，干燥。 （6 6）油鏡計數(shù)）油鏡計數(shù)200200個淋巴細胞中轉(zhuǎn)化的細胞數(shù)，計算轉(zhuǎn)化率。個淋巴細胞中轉(zhuǎn)化的細胞數(shù)，計算轉(zhuǎn)化率?，F(xiàn)在學習的是

11、第十二頁，共22頁l3 3、結(jié)果、結(jié)果 （1 1）淋巴母細胞的形態(tài)學標準是細胞核的大小，核與胞漿的比例、）淋巴母細胞的形態(tài)學標準是細胞核的大小，核與胞漿的比例、胞漿染色性及核的構(gòu)造與核仁的有無。胞漿染色性及核的構(gòu)造與核仁的有無。 成熟的小淋巴細胞：成熟的小淋巴細胞：與未經(jīng)培養(yǎng)的小淋巴細胞一樣為與未經(jīng)培養(yǎng)的小淋巴細胞一樣為68m68m，核染色質(zhì)致，核染色質(zhì)致密，無核仁，核與胞漿比例大，胞漿染色為輕度嗜堿性。密，無核仁，核與胞漿比例大，胞漿染色為輕度嗜堿性。l過渡型淋巴細胞：過渡型淋巴細胞：比小淋巴細胞大，約比小淋巴細胞大，約1020m1020m，核染色質(zhì)致密，但，核染色質(zhì)致密，但出現(xiàn)核仁，此為與

12、成熟小淋巴細胞鑒別要點。出現(xiàn)核仁，此為與成熟小淋巴細胞鑒別要點。l淋巴母細胞：淋巴母細胞：細胞體積增大，約細胞體積增大，約2030m2030m，形態(tài)不整齊，常有小突出，形態(tài)不整齊，常有小突出，核變大，核染色質(zhì)疏松，有核仁核變大，核染色質(zhì)疏松，有核仁1212個，胞漿變多，常出現(xiàn)胞漿空泡。個，胞漿變多，常出現(xiàn)胞漿空泡。l其它細胞：其它細胞：如中性粒細胞在培養(yǎng)如中性粒細胞在培養(yǎng)72h72h后，絕大部分衰變或死亡呈碎片。后，絕大部分衰變或死亡呈碎片?，F(xiàn)在學習的是第十三頁，共22頁l（2 2）淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的計算按上述分類檢查推片頭體尾三部）淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的計算按上述分類檢查推片頭體尾三部分，計數(shù)分，計

13、數(shù)200200個淋巴細胞，算出百分率。個淋巴細胞，算出百分率。l轉(zhuǎn)化的淋巴細胞包括淋巴母細胞和過渡型淋巴細胞，未轉(zhuǎn)化的淋轉(zhuǎn)化的淋巴細胞包括淋巴母細胞和過渡型淋巴細胞，未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞指的是成熟的小淋巴細胞。在正常情況下，巴細胞指的是成熟的小淋巴細胞。在正常情況下，PHAPHA誘導的淋誘導的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率為巴細胞轉(zhuǎn)化率為60%-80%60%-80%，如為，如為50%-60%50%-60%則偏低，則偏低，50%50%以下則為降以下則為降低。低。圖 淋巴細胞轉(zhuǎn)化示意圖100%未轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的淋巴細胞轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)化率轉(zhuǎn)現(xiàn)在學習的是第十四頁，共22頁l1 1、原理、原理 MTTMTT法即四

14、甲基偶氮唑鹽微量反應比色法。法即四甲基偶氮唑鹽微量反應比色法。MTTMTT是一種是一種噻唑鹽，化學名噻唑鹽，化學名3-3-（4 4，5 5二甲基二甲基-2-2-噻唑）噻唑）-2-2，5-5-二苯溴化二苯溴化四唑，水溶液為黃橙色。淋巴細胞受到四唑，水溶液為黃橙色。淋巴細胞受到ConAConA作用紅發(fā)生增作用紅發(fā)生增殖活化，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應升高，殖活化，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應升高，MTTMTT作作為其底物參與反應，形成藍色的甲為其底物參與反應，形成藍色的甲臢臢顆粒沉積于細胞內(nèi)或顆粒沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍，經(jīng)細胞周圍，經(jīng)SDS/SDS/鹽酸鹽酸- -異丙醇溶解為藍色溶液，可

15、用酶標異丙醇溶解為藍色溶液，可用酶標測定儀測定細胞培養(yǎng)物的測定儀測定細胞培養(yǎng)物的ODOD值，測定波長值，測定波長570nm570nm。根據(jù)。根據(jù)ODOD值值的大小計算反應體系中細胞增殖程度。的大小計算反應體系中細胞增殖程度?，F(xiàn)在學習的是第十五頁，共22頁l2 2、方法、方法l（1 1）淋巴細胞的分離與培養(yǎng)）淋巴細胞的分離與培養(yǎng) 常用來分離常用來分離淋巴細胞的分層液淋巴細胞的分層液（聚（聚 蔗糖蔗糖(Ficoll)-(Ficoll)-泛影葡胺泛影葡胺(Urografin)(F(Urografin)(FH)H)分層液，比重是分層液，比重是 1.0771.0770.001 0.001 ）。）。 Fi

16、collFicoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400,000400,000，當密度為，當密度為1.2g1.2gmlml時仍未超出正常生理性滲透壓時仍未超出正常生理性滲透壓, ,也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到淋巴細胞。吸取分

17、層液液面的細胞，就可從外周血中分離到淋巴細胞?，F(xiàn)在學習的是第十六頁，共22頁l 取抗凝血取抗凝血1ml1ml，加入，加入3737預溫的預溫的PH7.4 0.01M PBSPH7.4 0.01M PBS溶液溶液1ml1ml，混勻后加在混勻后加在1ml1ml淋巴細胞分離液上，淋巴細胞分離液上，25002500rlminrlmin離心離心1010分鐘，用分鐘，用毛細滴管尖伸入單核細胞層，經(jīng)輕吸出全部細胞懸液。用毛細滴管尖伸入單核細胞層，經(jīng)輕吸出全部細胞懸液。用3737預預溫的溫的PH7.4 0.01M PBSPH7.4 0.01M PBS溶液洗溶液洗2 2次，第一次次，第一次2500r/min152

18、500r/min15分鐘。第分鐘。第二次二次1010分鐘。棄上清，將沉積細胞用分鐘。棄上清，將沉積細胞用pH7.4pH7.4含含10%10%小牛血清的小牛血清的RPMI-1640RPMI-1640營養(yǎng)液液配成營養(yǎng)液液配成1 12 210106 6個個/ml/ml的單細胞懸液，的單細胞懸液，100l/100l/孔，接種于孔，接種于9696孔平板，并加入適量的孔平板，并加入適量的ConAConA液。置液。置3737、5% CO2 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4848小時。小時。現(xiàn)在學習的是第十七頁，共22頁現(xiàn)在學習的是第十八頁，共22頁l（2 2）加入）加入5mg/ml5mg/ml的的M

19、TTMTT溶液溶液(10l/(10l/孔孔) )，于振蕩器上混勻后約，于振蕩器上混勻后約1min1min，置置3737、5% CO2 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-64-6小時。小時。l（3 3）取出培養(yǎng)板，每孔加入）取出培養(yǎng)板，每孔加入10%SDS-0.01mol/LHCL100ul, 10%SDS-0.01mol/LHCL100ul, 置置3737、5% 5% CO2 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 2小時后，取出，室溫下將平板置于微孔板振蕩器上振小時后，取出，室溫下將平板置于微孔板振蕩器上振蕩蕩1010分鐘，使結(jié)晶物溶解。分鐘，使結(jié)晶物溶解。l（4 4）使用酶聯(lián)檢測儀檢測波長）使用酶聯(lián)檢測儀檢測波長570nm570nm下的吸光度值。下的吸光度值?，F(xiàn)在學習的是第十九頁，共22頁l【注意事項】l1.操作應輕柔，細胞懸液應充分混勻，避免損傷細胞活性及細胞丟失。l2.細胞分層液在室溫下應為(l.