醫(yī)藥-臨床-護(hù)理基因工程菌的發(fā)酵ppt課件

1、第六節(jié) 基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策 基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制 改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn) 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性， 這種 不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式： 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性 重組 DNA 分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表 觀生物學(xué)功能的喪失 分配不穩(wěn)定性 整個(gè)重組 DNA 分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機(jī)制 受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組 DNA 分子的降解 外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝 能量、物

2、質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生 應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動(dòng)降解程序 重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配 這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因 受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機(jī)制 受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組 DNA 分子的降解 外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝 能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生 應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動(dòng)降解程序 重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配 這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因 受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排基因工程菌的穩(wěn)定性重組質(zhì)粒

3、的逃逸率 當(dāng)含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長時(shí)，培養(yǎng)系統(tǒng)中一部分細(xì)胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比稱為重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率。 重組質(zhì)粒逃逸的原因有： 高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料促使重 組質(zhì)粒滲漏 受體細(xì)胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配，細(xì)胞所含重組質(zhì)?？截?數(shù)的差異隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而加劇 影響基因工程菌穩(wěn)定性的因素 載體的選擇 遺傳特性 宿主的選擇 外源基因整合到宿主染色體上 培養(yǎng)基 生長速率 發(fā)酵工藝 限制性基質(zhì) 溫度 pH 和溶氧 外源基因表達(dá)基因工程菌的穩(wěn)定性 提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 改進(jìn)載體受體系統(tǒng)

4、 以增加質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括： 將 R1 質(zhì)粒上的 parB 基因引入表達(dá)型載體中 其表達(dá)產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細(xì)胞 正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn) 禁止 DNA 片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi) 將受體細(xì)胞的致死性基因安裝在載體上 同時(shí)構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的 ssb 基因 （DNA 單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）基因工程菌的穩(wěn)定性培養(yǎng)基 一些基因重組菌在復(fù)合培養(yǎng)基中顯示較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性 微生物在含有有機(jī)氮源如酵母抽提物、蛋白胨等營養(yǎng)豐富的復(fù)合培 養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，由于培養(yǎng)基提供了生長必須的氨基酸和其他物質(zhì)， 微生物的生長較在基本培養(yǎng)基中快。 培養(yǎng)條件對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性

5、的影響比生長速率 基因重組菌的比生長速率對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性有很大影響。提高比生長速率有助于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。 基因重組菌的比生長速率與培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，如溫度，pH，溶氧，限制性營養(yǎng)物質(zhì)濃度，有害代謝產(chǎn)物濃度等。在一定的溫度和 pH 下，限制性基質(zhì)濃度往往是決定比生長速率的主要因素。培養(yǎng)條件對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性的影響限制性基質(zhì) 一般培養(yǎng)基中各成分并不是完全平衡的，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，微生物的生長通常會(huì)受到一種或幾種物質(zhì)的限制。限制性基質(zhì)的種類對(duì)重組菌有不同的影響培養(yǎng)條件對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性的影響pH 和溶解氧 pH 和溶氧影響重組酵母菌的穩(wěn)定性。 pH 和溶氧是影響微生物生長的重要參數(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)基因重組菌

6、時(shí)，通常都需要維持一定的 pH 和溶氧水平。在基因重組菌的高密度培養(yǎng)時(shí)，為了維持所需的溶氧水平，除了提高攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，往往還要在通入的空氣中補(bǔ)充氧氣，以提高發(fā)酵罐的供氧能力。培養(yǎng)條件對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性的影響外源基因的表達(dá) 外源基因的表達(dá)會(huì)引起重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定 外源基因高效表達(dá)時(shí)，有可能因競(jìng)爭(zhēng)利用物質(zhì)、能量、核糖體等干擾宿主細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)，并造成質(zhì)粒不穩(wěn)定。 例如，吲哚丙烯酸（IAA ）是 trp 操縱子阻遏物的部分去阻遏劑，在培養(yǎng)大腸桿菌 MV12（pVH5）時(shí)，在培養(yǎng)基中加入不同量的 IAA，發(fā)現(xiàn)隨 IAA 量的增加，pVH5 帶有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表達(dá)水平有很大提高

7、，同時(shí)比生長速率下降，培養(yǎng)液中 Trp 的比例上升。電泳分析表明 60%70% 色氨酸合成能力喪失是由于質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的變化，其余是由于質(zhì)粒丟失造成。培養(yǎng)條件對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性的影響提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 施加選擇壓力 根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素 藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素 加入大量的抗生素會(huì)使生產(chǎn)成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時(shí)間 添加抗生素選擇壓力對(duì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無能為力 載體上的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份 培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 分階段控制培養(yǎng) 因外源基因表達(dá)造成質(zhì)粒不穩(wěn)

8、定時(shí)，可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制 在生長階段使外源基因處于阻遏狀態(tài)，避免因表達(dá)造成不穩(wěn)定性問 題的發(fā)生；在獲得需要的菌體密度后，再去阻遏或誘導(dǎo)外源基因表 達(dá)。 連續(xù)培養(yǎng)時(shí)可以考慮采用多級(jí)培養(yǎng)，如在第一級(jí)進(jìn)行生長，維持菌 體的穩(wěn)定性，在第二級(jí)進(jìn)行表達(dá)。 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 控制目的基因的過量表達(dá) 使用可控型啟動(dòng)子控制目的基因的定時(shí)表達(dá)及表達(dá)程度 使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時(shí)增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù) 優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝 培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定 培養(yǎng)溫度： 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略

9、優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝 工程菌的培養(yǎng)條件對(duì)其質(zhì)粒的穩(wěn)定性和表達(dá)效率影響很大 可調(diào)控的環(huán)境參數(shù)為：培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)溫度、pH 和溶解氧濃度。 有些含質(zhì)粒的菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而采用 間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率，從而改善質(zhì) 粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提 高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定 培養(yǎng)溫度： 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 控制培養(yǎng)條件 有些含質(zhì)粒的菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌

10、的比生長速率，從而改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 例如研究表達(dá)干擾素 a 的大腸桿菌 W3110(pEC901) 在不同比生長速率下的質(zhì)粒穩(wěn)定性，隨著稀釋率的增加，質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加，干擾素的比效價(jià)也明顯增大. 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 固定化 固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性 基因重組大腸桿菌進(jìn)行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的產(chǎn)物的 表達(dá)率都有了很大提高。 在游離重組菌系統(tǒng)中常用抗生素，氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質(zhì) 粒的手段，往往在大規(guī)模生產(chǎn)中難以應(yīng)用。而采用固定化方法 后，這種選擇壓力則可被省去

11、。 不同的宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。一、基因工程菌的培養(yǎng)方式二、基因工程菌的發(fā)酵工藝第七節(jié) 基因工程菌的培養(yǎng)基因工程菌發(fā)酵的基本操作方式有： 分批培養(yǎng) 分批培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單，但因不能控制生長，獲得的菌體密度也有限 半連續(xù)培養(yǎng)（補(bǔ)料分批） 在一次投料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，流加一定量的營養(yǎng)，使細(xì)胞進(jìn)一步的 生長，或得到更多的代謝產(chǎn)物 連續(xù)培養(yǎng) 不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。 連續(xù)培養(yǎng)則多用于動(dòng)力學(xué)特性和穩(wěn)定性等研究。 透析培養(yǎng) 固定化培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)方式補(bǔ)料分批培養(yǎng) 補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時(shí)間，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的培養(yǎng)方法

12、。 在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長所需的良好微環(huán)境，延長其生長對(duì)數(shù)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補(bǔ)料措施結(jié)合起來，根據(jù)基因工程菌的生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補(bǔ)料的流加速率?；蚬こ叹囵B(yǎng)方式連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到一定程度后，開動(dòng)進(jìn)料和出料蠕動(dòng)泵，以一定稀釋率進(jìn)行不間斷培養(yǎng)。 連續(xù)培養(yǎng)可以為微生物提供恒定的生活環(huán)境，控制其比生長速率，為研究基因工程菌的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、生理生化特性、環(huán)境因素對(duì)基因表達(dá)的影響等創(chuàng)造了良好的條件。 但是由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。為了解決這一問題，人們將工程菌的生長階段和基因表達(dá)階段分開，進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。在

13、這樣的系統(tǒng)中關(guān)鍵的控制參數(shù)是誘導(dǎo)水平、稀釋率和細(xì)胞比生長速率。優(yōu)化這三個(gè)參數(shù)以保證在第一階段培養(yǎng)時(shí)質(zhì)粒穩(wěn)定，菌體進(jìn)入第二階段后可獲得最高表達(dá)水平或最大產(chǎn)率?；蚬こ叹囵B(yǎng)方式透析培養(yǎng) 透析培養(yǎng)技術(shù)是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對(duì)生產(chǎn)菌的不利影響。 采用膜透析裝置是在發(fā)酵過程中用蠕動(dòng)泵將發(fā)酵液抽出打入罐外的膜透析器的一側(cè)循環(huán)，其另一側(cè)通入透析液循環(huán)，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，大量乙酸在透析器中透過半透膜，降低培養(yǎng)基中的乙酸濃度，并可通過在透析液中補(bǔ)充養(yǎng)分而維持較合適的基質(zhì)濃度，從而獲得高密度菌體。 膜的種類、孔徑、面積，發(fā)酵液和透析液的比例，透析

14、液的組成，循環(huán)流速，開始透析的時(shí)間和透析培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間段都對(duì)產(chǎn)物的產(chǎn)率有影響。基因工程菌培養(yǎng)方式固定化培養(yǎng) 基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。有人將固定化技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對(duì)分泌型菌更為有利。由于這一優(yōu)點(diǎn)，基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展?；蚬こ叹呐囵B(yǎng)方式基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備 應(yīng)用發(fā)酵罐來大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。為了防止工程菌丟失攜帶的質(zhì)粒，保持基因工程菌的遺傳特性，因而對(duì)發(fā)酵罐的要求十分嚴(yán)格。由于生化工程學(xué)和計(jì)算機(jī)的發(fā)展，新型自動(dòng)化發(fā)酵罐完全能滿足這些要求。 常規(guī)的微生物發(fā)酵設(shè)備可直接用于基因工程

15、菌的培養(yǎng)。不同點(diǎn)在于，微生物發(fā)酵主要收獲的是它們的初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物，細(xì)胞生長并非主要目標(biāo)。 基因工程菌培養(yǎng)是為了獲得最大量的基因表達(dá)產(chǎn)物。由于這類物質(zhì)是相對(duì)獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的重組質(zhì)粒上的外源基因所合成的、細(xì)胞并不需要的蛋白質(zhì)，因此，培養(yǎng)設(shè)備以及設(shè)備控制應(yīng)滿足獲得高濃度的受體細(xì)胞和高表達(dá)的基因表達(dá)產(chǎn)物。 發(fā)酵罐的組成部分有： 發(fā)酵罐體 保證高傳質(zhì)作用的攪拌器、 精細(xì)的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、 空氣無菌過濾裝置 殘留氣體處理裝置 參數(shù)測(cè)量與控制系統(tǒng)（如 pH、O2、CO2 等） 培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置等。 基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備基因工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中要求 環(huán)境條件恒定，不影響其遺傳特性，更不能引起所帶質(zhì)粒丟失。對(duì)發(fā)酵罐有特殊要求 如要提供菌體生長的最適條件 培養(yǎng)過程