實驗十三 堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA

1、食品生物技術(shù)實驗食品生物技術(shù)實驗食品科學系食品科學系徐文生徐文生 實驗一實驗一 小量制備質(zhì)粒小量制備質(zhì)粒DNADNA一實驗目的及背景一實驗目的及背景w質(zhì)粒是染色體外的質(zhì)粒是染色體外的DNADNA分子，大小可為分子，大小可為1kb1kb到到200kb200kb。w大多數(shù)來自細菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價閉合大多數(shù)來自細菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細菌內(nèi)的共生型遺傳因子。菌內(nèi)的共生型遺傳因子。w其復制和遺傳獨立于細菌染色體，但復制其復制和遺傳獨立于細菌染色體，但復制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。1.質(zhì)粒特點

2、質(zhì)粒特點w質(zhì)粒能在細菌中垂直遺傳并且賦予宿主細胞質(zhì)粒能在細菌中垂直遺傳并且賦予宿主細胞一些表型，是比病毒更簡單的原始生命。一些表型，是比病毒更簡單的原始生命。w質(zhì)粒通過細菌的結(jié)合作用，從雄性體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒通過細菌的結(jié)合作用，從雄性體轉(zhuǎn)移到雌性體，雌性體， 是細菌有性繁殖的性因子是細菌有性繁殖的性因子. .w年由年由LederburgLederburg正式命名為質(zhì)粒。正式命名為質(zhì)粒。2.質(zhì)粒類型質(zhì)粒類型w質(zhì)粒按復制方式分為兩種類型：質(zhì)粒按復制方式分為兩種類型： 松弛型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒 和和 嚴緊型質(zhì)粒嚴緊型質(zhì)粒w1.1.松弛型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒 松弛型質(zhì)粒的復制不需要質(zhì)粒編碼松弛型質(zhì)粒的復制不需要質(zhì)粒編

3、碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的較長的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復制依然進行。當抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細復制依然進行。當抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細菌染色體復制的氯霉素等抗生素存在時，質(zhì)菌染色體復制的氯霉素等抗生素存在時，質(zhì)粒的拷貝數(shù)可達粒的拷貝數(shù)可達2000-30002000-3000拷貝?？截?。3.3.嚴緊型質(zhì)粒嚴緊型質(zhì)粒w嚴緊型質(zhì)粒復制需要一個質(zhì)粒編碼的蛋白，嚴緊型質(zhì)粒復制需要一個質(zhì)粒編碼的蛋白，質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過用氯霉素等蛋白合成質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過用氯霉素等蛋白合成抑制劑來增加。抑制劑來增加。4.質(zhì)粒

4、的應用質(zhì)粒的應用w大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。w嚴緊型質(zhì)粒用來表達一些可使宿主細胞受毒嚴緊型質(zhì)粒用來表達一些可使宿主細胞受毒害致死的基因。害致死的基因。w質(zhì)粒的特點使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進入細質(zhì)粒的特點使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值。載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值。二、本實驗目的二、本實驗目的w本實驗要求掌握最常用的質(zhì)粒的提取方法。本實驗要求掌握最常用的質(zhì)粒的提取方法。分離質(zhì)粒分離質(zhì)粒DNADNA方法方法w從大腸桿菌中分離質(zhì)粒從大腸桿菌中分離質(zhì)

5、粒DNADNA方法眾多，目前常用的方法眾多，目前常用的w堿變性法；堿變性法；w煮沸法；煮沸法；wSDSSDS法；法；w 羥基磷灰石層析法等羥基磷灰石層析法等w各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點加以選擇的，其中堿變性法堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟且收得率較高既經(jīng)濟且收得率較高, ,提取的質(zhì)粒提取的質(zhì)粒DNADNA可用于酶切可用于酶切, ,連接與轉(zhuǎn)化。連接與轉(zhuǎn)化。堿變性法基本原理堿變性法基本原理w在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。

6、w將PH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA。實驗試劑實驗試劑w培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：胰化蛋白胨胰化蛋白胨 10g10g酵母提取物酵母提取物 5g 5g 定容定容 1000ml pH 1000ml pH 7.57.5NaCl 10gNaCl 10gw： 0.1M NaCl0.1M NaCl10mM Tris HCl(pH8.0)10mM Tris HCl(pH8.0)1m

7、M EDTA1mM EDTAw 50mg/ml50mg/mlw溶菌酶溶菌酶 10mg/ml (10mg/ml (用用10mM TrisHCl pH8.010mM TrisHCl pH8.0新鮮配制新鮮配制）試劑試劑w溶液溶液： 50mM 50mM 葡萄糖葡萄糖25mM TrisHCl25mM TrisHCl（pH8.0pH8.0）10mM EDTA10mM EDTAw溶液溶液：（新鮮配制）：（新鮮配制）0.2N NaOH0.2N NaOH1% SDS1% SDSw溶液溶液： 5M KAC 10ml5M KAC 10ml冰醋酸冰醋酸 11.5ml11.5ml水水 28.5ml28.5mlw酚，氯

8、仿，乙醇酚，氯仿，乙醇 RNase RNase 瓊脂糖瓊脂糖w： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTApUC18鏈長2,686 bp pUC18是適合于雙脫氧法DNA測序的載體，在lacZ領(lǐng)域中含有多克隆位點，因此在含有IPTG， X-Gal的平板培養(yǎng)基上，很容易判斷有無外源基因的插入。此外，也可以利用lac promoter表達外源基因。進行DNA測序時，可以很方便地使用M13系列Primers。w多克隆位點：EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Sal I, P

9、st I, Sph I 和Hind III 只有一個酶切位點。 w用途w克隆外源基因。 w利用lac promoter進行基因表達。 w使用M13 primers進行DNA測序。 wpUC18/pUC19 cloning site圖 w 三實驗方法三實驗方法w挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至5ml LB5ml LB培養(yǎng)液中（含培養(yǎng)液中（含AmP AmP 50g/ml50g/ml），）， 強烈搖蕩過度。強烈搖蕩過度。w取取1.5ml1.5ml培養(yǎng)液至培養(yǎng)液至EppendorfEppendorf管中，管中，12000g12000g離心離心3030秒，棄秒，棄上清，用上清，用ml

10、 STEml STE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復一次，懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復一次，棄上清，取沉淀。棄上清，取沉淀。w將細菌沉淀懸浮于將細菌沉淀懸浮于100l100l預冷溶液預冷溶液中，振蕩混勻，冰中，振蕩混勻，冰上放置上放置5 5分鐘。分鐘。w加入加入200l200l溶液溶液，蓋嚴管蓋輕柔顛倒次以混勻內(nèi)容，蓋嚴管蓋輕柔顛倒次以混勻內(nèi)容物，冰上放置物，冰上放置5 5分鐘。分鐘。w加入加入150l150l溶液溶液，溫和振蕩數(shù)次，冰上放置分鐘。，溫和振蕩數(shù)次，冰上放置分鐘。w12000g 4 12000g 4 離心分鐘，取上清移到個新的離心分鐘，取上清移到個新的EppendorfEpp

11、endorf管中。管中。 w( (加入等體積酚加入等體積酚/ /氯仿（：），振蕩混勻，氯仿（：），振蕩混勻，12000g 4 12000g 4 離心分鐘。取上清移至另個離心分鐘。取上清移至另個EppendorfEppendorf管中。管中。) )w加入倍體積無水乙醇，振蕩混勻，于室溫靜置加入倍體積無水乙醇，振蕩混勻，于室溫靜置2 2分鐘。分鐘。w g ,4 g ,4 離心分鐘。離心分鐘。w棄上清，加入棄上清，加入ml 70%ml 70%乙醇漂洗沉淀，蓋嚴管蓋顛倒乙醇漂洗沉淀，蓋嚴管蓋顛倒數(shù)次，數(shù)次，000g 000g 于于4 4 離心分鐘。離心分鐘。w棄上清，抽干乙醇，室溫干燥（棄上清，抽干乙

12、醇，室溫干燥（5-155-15分鐘）。分鐘）。w加入加入50l TE50l TE（含（含20g/ml20g/ml RNA RNA 酶，不含酶，不含DNADNA酶）酶）溶解溶解DNADNA。 1313取取10l DNA10l DNA溶解液用稀釋至溶解液用稀釋至1000ul1000ul測定測定OD260OD260和和OD280,OD280,計算計算OD260/OD2 80OD260/OD2 80之比；之比；14. 14. 同時以以下公式計算得率。同時以以下公式計算得率。質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA得率：得率：稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)OD260OD2600.050.0550/1.5ml50/1.5ml1515取取1

13、0l DNA10l DNA溶解液加溶解液加2l Loading buffer2l Loading buffer于于1%1%瓊脂糖瓊脂糖, ,電泳電泳3 3小時小時, ,電壓電壓4040伏。伏。1616電泳凝膠在透射式紫外檢測儀上觀察，記錄結(jié)果。電泳凝膠在透射式紫外檢測儀上觀察，記錄結(jié)果。四結(jié)果分析四結(jié)果分析w質(zhì)粒質(zhì)粒DNA OD260,OD280DNA OD260,OD280的值，由此計的值，由此計算質(zhì)粒算質(zhì)粒DNADNA得率和純度。得率和純度。w記錄電泳結(jié)果并說明結(jié)果內(nèi)容。記錄電泳結(jié)果并說明結(jié)果內(nèi)容。五、問題與討論：五、問題與討論：w簡要敘述溶液簡要敘述溶液、溶液、溶液和溶液和溶液的作的作用

14、，以及實驗中用，以及實驗中 分別加入上述溶液后，反應分別加入上述溶液后，反應體系出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因。體系出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因。w簡要敘述酚氯仿抽提體系后出現(xiàn)簡要敘述酚氯仿抽提體系后出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因。的現(xiàn)象及其成因。w3. 3. 沉淀時為什么要用無水乙醇及在沉淀時為什么要用無水乙醇及在高鹽、低溫條件下進行？高鹽、低溫條件下進行？DNA凝膠電泳凝膠電泳DNA agarose gel electrophoresis實驗二實驗二 瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNADNA、RNARNA分子混合物的方分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用法，這

15、種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNADNA分子在泳動時的電荷分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。DNADNA分子在高于其等電點的分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNADNA分子的分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。素。DNADNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構(gòu)型的分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構(gòu)型的DNADNA分子

16、的分子的遷移速度不同。如環(huán)形遷移速度不同。如環(huán)形DNADNA分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價閉合分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價閉合環(huán)狀的超螺旋分子（環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNAcccDNA）、開環(huán)分子）、開環(huán)分子(ocDNA)(ocDNA)、和線形、和線形DNADNA分子分子(IDNA)(IDNA)。這三種不同構(gòu)型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為。這三種不同構(gòu)型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNA:cccDNAIDNAIDNAocDNA ocDNA 當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)(Ethid

17、ium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以檢出染色，在紫外光下至少可以檢出1-10ng1-10ng的的DNADNA條帶，從而可以確定條帶，從而可以確定DNADNA片片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNADNA條帶，條帶，用于以后的克隆操作。用于以后的克隆操作。 實驗原理實驗原理實驗材料：實驗材料：質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA等，購買或自行提取純化。等，購買或自行提取純化。實驗試劑：實驗試劑：5 5TBETBE電泳緩沖液：電泳緩沖液： 6 6電泳載樣緩沖液：電泳載樣緩沖液：0.250.25 溴粉藍，溴粉藍，4

18、040(w/v) (w/v) 蔗糖蔗糖水溶液，貯存于水溶液，貯存于 44。 溴化乙錠溴化乙錠(EB)(EB)溶液母液：將溶液母液：將EBEB配制成配制成10 mg/mL10 mg/mL，用鋁箔，用鋁箔或黑紙包裹容器或黑紙包裹容器, ,儲于室溫即可。儲于室溫即可。 實驗材料和試劑實驗材料和試劑微波爐微波爐實驗儀器實驗儀器凝膠電泳槽凝膠電泳槽凝膠成像凝膠成像系統(tǒng)系統(tǒng)實驗步驟實驗步驟取取5 5TBETBE緩沖液緩沖液20mL20mL加水至加水至200mL200mL，配制成，配制成0.50.5TBETBE稀釋緩沖液，待用。稀釋緩沖液，待用。 膠液的制備：稱取膠液的制備：稱取0.4g0.4g瓊脂糖，置于

19、瓊脂糖，置于200mL200mL錐形瓶中，加入錐形瓶中，加入50mL 50mL 0.50.5TBETBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為此為0.80.8瓊脂糖凝膠液。瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。脂糖顆粒進入溶液。膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意

20、觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持面保持1mm1mm左右的間隙。左右的間隙。 向冷卻至向冷卻至50-6050-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠錠(EB)(EB)溶液使其終濃度為溶液使其終濃度為0.5g /mL0.5g /mL。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入傷梳底部的凝膠，然后

21、向槽內(nèi)加入0.50.5TBETBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。膠板上表面。 加樣：取加樣：取10L DNA10L DNA樣品與樣品與2L 62L 6上樣液混勻，用微量移液槍小心上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若加入樣品槽中。若DNADNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tiptip頭，以防止互頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞?/p>

22、凝膠刺穿。刺穿。 電泳：加完樣后電泳：加完樣后, ,合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-60-80V80V，電流在，電流在40mA40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm2cm時，停時，停止電泳。止電泳。染色：未加染色：未加EBEB的膠板在電泳完畢后移入的膠板在電泳完畢后移入0.5g/mL0.5g/mL的的EBEB溶液中，室溫溶液中，室溫下染色下染色20-25min20-25min。 觀察和拍照：在波長為觀察和拍照：在波長為254nm254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加的長波長紫外燈下觀

23、察染色后的或已加有有EBEB的電泳膠板。的電泳膠板。 瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。瓊脂糖主要在電泳。瓊脂糖主要在DNADNA制備電泳中作為一種固體支持制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中，在中性基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中，在中性pHpH值下帶負電荷的值下帶負電荷的DNADNA向陽極遷移，其遷移速率由下列向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定：多種因素決定： 1 1、 DNADNA的分子大小的分子大小 2 2、 瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度 3 3、 DNADNA分子的構(gòu)象分子的構(gòu)象 4 4、

24、 電源電壓電源電壓 5 5、嵌入染料的存在、嵌入染料的存在 6 6、 離子強度影響離子強度影響 DNADNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶 EBEB是強誘變劑并有中等毒性，配制和使用時都應戴手套，是強誘變劑并有中等毒性，配制和使用時都應戴手套，并且不要把并且不要把EBEB灑到桌面或地面上。凡是沾污了灑到桌面或地面上。凡是沾污了EBEB的容器或的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗。沾染了物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗。沾染了EBEB的垃圾要專門的垃圾要專門處理后才可丟棄。處理后才可丟棄。 當當EBEB太多太多, , 膠染色過深，膠染色過深，DNADNA帶看

25、不清時，可將膠放入蒸帶看不清時，可將膠放入蒸餾水沖泡，餾水沖泡，30min30min后再觀察。后再觀察。 制備凝膠時，倒膠的溫度不可太低，否則凝固不均勻：速制備凝膠時，倒膠的溫度不可太低，否則凝固不均勻：速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。實驗注意事項實驗注意事項 泳道中的質(zhì)粒泳道中的質(zhì)粒DNADNA有幾條帶？為什么？有幾條帶？為什么？ 溴酚藍的遷移率相當于多少溴酚藍的遷移率相當于多少bpbp的的DNA?DNA? 影響本實驗結(jié)果的因影響本實驗結(jié)果的因素有哪些？素有哪些？思考題思考題實驗三實驗三 PCRPCR擴增實驗擴增實驗原理：原理： 利用特異的引物，以重組質(zhì)粒利

26、用特異的引物，以重組質(zhì)粒pMD18-TpMD18-T為模板擴增基因。為模板擴增基因。 擴增反應擴增反應1 1）擴增引物）擴增引物2 2）模板：重組質(zhì)粒）模板：重組質(zhì)粒pGEX-4T-1pGEX-4T-1（HisHis）6-C-X6-C-X3 3）PCRPCR反應試劑盒（購置）反應試劑盒（購置）4 4）5050TAETAE緩沖液：緩沖液： 242g Tris242g Tris堿堿 57.1ml 57.1ml 冰醋酸冰醋酸 100ml 100ml 0.5M EDTA0.5M EDTA H H2 2O O補充至補充至1000 ml 1000 ml 5 5）6 6凝膠加樣緩沖液：凝膠加樣緩沖液：0.2

27、50.25溴酚蘭，溴酚蘭，0.25%0.25%二甲苯青二甲苯青FFFF，40%40%蔗糖，蔗糖，44保存保存6 6）溴化乙錠保存液：）溴化乙錠保存液：10mg10mgmlml，避光保存，避光保存7 7）0.80.8瓊脂糖凝膠：瓊脂糖凝膠：0.80.8克瓊脂糖加熱溶于克瓊脂糖加熱溶于100 ml 1100 ml 1TAETAE。1.1.材料材料1)1)按以下次序，將各成分在按以下次序，將各成分在0.5ml0.5ml滅菌離心管內(nèi)混合：滅菌離心管內(nèi)混合：(100ul)(100ul) ddH ddH2 2O 79ulO 79ul 10 10擴增緩沖液擴增緩沖液 10ul10ul 4 4種種dNTPdN

28、TP混合物，混合物， 2ul (2ul (終濃度為終濃度為0.2mmol0.2mmolL)L) MgCl2 6ul MgCl2 6ul ( (終濃度為終濃度為1.5mmol1.5mmolL)L) 引物引物1 1ul 1 1ul ( (終濃度為終濃度為50pmmol50pmmolL )L ) 引物引物2 1ul 2 1ul ( (終濃度為終濃度為50pmmol50pmmolL )L ) 模板模板DNA 1ulDNA 1ul2)1002)100加熱反應混合液加熱反應混合液1010分鐘，冰浴分鐘，冰浴55，使，使DNADNA完全變性。完全變性。3)3)將將1ulTaqDNA1ulTaqDNA聚合酶聚

29、合酶(5(5單位單位/ul)/ul)，加入反應混合液中。，加入反應混合液中。4)4)用用100ul100ul石蠟油覆蓋于反應混合液之上，防止樣品在反復加石蠟油覆蓋于反應混合液之上，防止樣品在反復加熱熱- -冷卻的過程中蒸發(fā)。冷卻的過程中蒸發(fā)。2.2.操作步驟操作步驟5 5）按以下方法進行）按以下方法進行PCRPCR反應：反應：常用循環(huán)參數(shù)：變性：常用循環(huán)參數(shù)：變性：94 194 1分鐘、退火：分鐘、退火：55 155 1分鐘、分鐘、延伸：延伸：72 172 1分分3030個循環(huán)。個循環(huán)。6)6)制備制備1.51.5瓊脂糖凝膠板：將瓊脂糖凝膠板：將1.51.5瓊脂糖凝膠置微波爐中瓊脂糖凝膠置微波

30、爐中溶化溶化, ,稍等冷卻，倒入制膠槽中，充分凝固后拔出樣品梳；稍等冷卻，倒入制膠槽中，充分凝固后拔出樣品梳；7)7)將凝膠板放人電泳槽，加入將凝膠板放人電泳槽，加入1 1TAETAE緩沖液，使液面略高于緩沖液，使液面略高于凝膠。凝膠。8)8)從反應混合液中取出從反應混合液中取出DNADNA擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物2 ul2 ul并加并加1ul 61ul 6凝膠加凝膠加樣緩沖液，混勻后全部加入凝膠板的樣品孔中進行電泳。樣緩沖液，混勻后全部加入凝膠板的樣品孔中進行電泳。9)9)電泳電泳100V100V約約1 1小時；小時；10)10)在在500 ml 500 ml 水中加入溴化乙錠保存液水中加入溴化乙錠

31、保存液, (EB, (EB終濃度終濃度0.5-0.5-1ug/ml),1ug/ml),混勻；混勻；11)11)將疑膠輕輕滑入染色液，染色將疑膠輕輕滑入染色液，染色20-3020-30分鐘；分鐘；12)12)取出凝膠，用水稍漂洗；取出凝膠，用水稍漂洗；13)13)紫外燈下確定紫外燈下確定DNADNA區(qū)帶。區(qū)帶。 由于由于PCRPCR能夠使能夠使DNADNA分子大量擴增，所分子大量擴增，所以應當注意防止反應體系被痕量以應當注意防止反應體系被痕量DNADNA模板污模板污染染(Kwok(Kwok和和HiguchiHiguchi，1989)1989)。尤其在待擴增。尤其在待擴增靶序列濃度低的情況下，更有必要采取防靶序列濃度低的情況下，更有必要采取防備措施。備措施。注意事項注意事項1)1)在裝有紫外燈的層流式工作臺內(nèi)吸加在裝有紫外燈的層流式工作臺內(nèi)吸加PCRPCR試劑和試劑和進行反應。不用時應打開紫外燈。工作臺內(nèi)應配進行反應。不用時應打開紫外燈。工作臺內(nèi)應配置有置有PCRPCR專用的微量離心機、一次性手套、整套移專用的微量離心機、一次性手套、整套移液器和其他必需品。自動