第十章生物無機(jī)化學(xué)研究中的物理方法

1、第十章 生物無機(jī)化學(xué)研究中的物理方法 10.1 時(shí)標(biāo)評(píng)述 10.2 X射線方法 10.3 磁共振方法 10.4 穆斯鮑爾譜 10.5 電子光譜 為了在實(shí)驗(yàn)科學(xué)上取得進(jìn)步，必須用恰當(dāng)?shù)姆椒▉硌芯扛信d趣的問題 不需要掌握每一方法的技術(shù)原理 對(duì)目前生物無機(jī)化學(xué)常用的物理方法綜述 著重討論各種物理方法如何影響生物無機(jī)化學(xué)的發(fā)展，以及生物無機(jī)化學(xué)又如何促進(jìn)物理方法的改進(jìn) 本章要討論的是，在分子結(jié)構(gòu)測(cè)定和電子結(jié)構(gòu)表征方面，所應(yīng)用的特定物理方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性 金屬離子可作為一類生物功能基團(tuán)，他們的電子性質(zhì)和高電子密度使其特別適合用物理技術(shù)來研究，比如EXAFS（外延X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)），穆斯鮑爾譜(Mssb

2、auer)，共振拉曼譜（Raman)譜，電子順磁共振譜。 生物有機(jī)化學(xué)則很少使用這些方法。10.1 時(shí)標(biāo)評(píng)述電子和磁學(xué)現(xiàn)象是大部分波譜技術(shù)的基礎(chǔ)，波譜技術(shù)可用來監(jiān)控生物中金屬位置的化學(xué)反應(yīng)性。各種形式波譜的共同之處都是用給定頻率或頻率范圍的光輻照樣品。光可被散射或被吸收，其強(qiáng)度明顯變化是這些物理方法的基礎(chǔ)，與光的波長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)的光的頻率可用來估算時(shí)標(biāo)，化學(xué)現(xiàn)象能夠借助時(shí)標(biāo)，用給定的波譜方法來探測(cè)。技 術(shù) 時(shí)間電子衍射 10-20s中子衍射 10-18sX射線衍射 10-18sUV光譜 10-15s可見光譜 10-14s紅外光譜 10-13sEPR譜 10-410-9sNMR 10-110-9sNQ

3、R 10-110-8s穆斯鮑爾譜 10-7s分子光束 10-6s實(shí)驗(yàn)分離異構(gòu)體 102s 化學(xué)反應(yīng)的速率類似車輪轉(zhuǎn)動(dòng)的速率，快門開關(guān)的速率和表中列出的時(shí)標(biāo)類似 通常研究電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)比研究原子轉(zhuǎn)移的化學(xué)反應(yīng)要求更快的方法。電子光譜就是這一快速方法。波長(zhǎng)=500nm，頻率310-15s的光，可以分辨飛秒時(shí)標(biāo)范圍的化學(xué)變化10.2 X射線方法10.2.a 單晶X射線射線衍射 通常把大分子晶體浸泡在金屬配合物的溶液中，來制備具有電子密集原子或基團(tuán)的衍生物。通用的標(biāo)準(zhǔn)試劑中含有單一的重原子，諸如鉑、汞或金。當(dāng)生物分子的尺寸增大以及復(fù)雜性增加時(shí)，就要求有足夠量高電子密度的重原子衍生物，以便為同晶取代技術(shù)提

4、供足夠的物相。例如：四（乙酰汞基）甲烷（TAMM)和二-碘二（乙二胺）合鉑（PIP)可用來解析核小體的核心微粒結(jié)構(gòu)。 X射線被吸收后，能激發(fā)元素1s（K吸收邊）或2s、2p（L吸收邊）的電子到空的定域軌道，對(duì)能量更高的X光子還能激發(fā)出連續(xù)光譜 通過檢測(cè)X吸收邊的能量，可確定待測(cè)金屬離子的氧化態(tài) 相鄰原子通過背散射對(duì)X射線吸收能量譜的調(diào)制，能獲得廣延X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)（EXAFS)，從中可得出金屬配位幾何構(gòu)型的細(xì)節(jié) 可研究非晶體甚至溶液10.2.b X射線吸收光譜 對(duì)小分子配合物用EXAFS和單晶X射線射線衍射兩種方法研究比較可看出，對(duì)模型結(jié)構(gòu)，擬合EXAFS數(shù)據(jù)得到的幾何結(jié)構(gòu)信息的可靠性達(dá)0.

5、01 最早應(yīng)用EXAFS譜獲得成功的是屬鐵硫蛋白的紅氧還蛋白 金屬生物高聚物的EXAFS測(cè)試結(jié)果，往往于對(duì)稱位置最精確，即第一配位層內(nèi)相對(duì)重的元素（Z14)的金屬離子所處的位置 通過控制實(shí)驗(yàn)來確定，生物樣品置于高強(qiáng)度X輻照下，樣品的結(jié)構(gòu)、生物活性、或化學(xué)性質(zhì)都不變。然后在測(cè)試酶樣品在溶液中的活性10.3磁共振方法 10.3.a 電子順磁共振（EPR) 要求：樣品具有未成對(duì)電子，對(duì)于研究金屬蛋白是理想的 Cu(II)，Co(II)，F(xiàn)e(II)，Mn(II)，Mn(III)，Mo(V) 以及Fe2O3+和Fe4S4+,3+金屬原子簇。 EPR譜可用于諸如鐵氧還蛋白等含鐵蛋白的分離和純化過程 對(duì)確

6、定電子結(jié)構(gòu)，以及電子結(jié)構(gòu)對(duì)配位層組成的和構(gòu)型相關(guān)性很有價(jià)值10.3.b核磁共振（NMR） 對(duì)于大分子結(jié)構(gòu)的測(cè)定更為有效，可以獲得有關(guān)生物高分子及所結(jié)合的金屬離子的三維結(jié)構(gòu)的信息，可得到距離和扭轉(zhuǎn)角 順磁金屬離子具有相當(dāng)快的電子自旋馳豫時(shí)間，能夠適于鑒別氨基酸側(cè)鏈配體的位移NMR信號(hào) 無化學(xué)位移變幻的譜線寬化存在于Mn(II)和Gd(III)的配位環(huán)境中，當(dāng)這些金屬取代了金屬蛋白中的Mg2+，Ca2+，Zn2+等反磁金屬時(shí)，能夠獲得遠(yuǎn)處基團(tuán)的信息 順磁過渡金屬離子引起的譜線寬化對(duì)確定水對(duì)金屬酶活性位的親和性也很有用 NMR對(duì)動(dòng)力學(xué)研究也常常很有用10.4穆斯鮑爾譜 方法：從處于激發(fā)態(tài)能級(jí)的源元素

7、核中，發(fā)射出的-射線又被樣品中的同一元素吸收。 研究生物無機(jī)化學(xué)中57Fe特別有意義。 同位素位移（，mm/s）中能獲得有關(guān)金屬氧化態(tài)和自旋態(tài)以及鐵配體類型的某些信息 從結(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)來看，最有用的是信號(hào)的四極分裂EQ，它顯示出圍繞金屬中心電場(chǎng)的不對(duì)稱性 對(duì)于生物體中的鐵原子穆斯鮑爾譜可用于研究磁耦合現(xiàn)象 對(duì)于混合價(jià)態(tài)的物種可估算內(nèi)部的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)速率。10.5電子光譜 金屬配合物的電子光譜有三個(gè)主要來源： 1）內(nèi)部配體的譜帶； 2）僅僅與金屬軌道有關(guān)的躍遷，如d-d躍遷光譜 3）金屬和配體之間的電荷遷移光譜 指認(rèn)金屬的氧化態(tài)并根據(jù)反應(yīng)來鑒別新近發(fā)現(xiàn)的體系的化學(xué)物種。10.6圓二色性（CD)和磁圓二色光譜（MCD) 圓二色性與左圓偏振光和右圓偏振光被光活性物質(zhì)樣品吸收的差值相關(guān)。 CD對(duì)檢測(cè)和分辨電子躍遷很有用 CD是檢測(cè)生物大分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的有力工具可從蛋白質(zhì)的CD譜估算-螺旋，折疊以及其他結(jié)構(gòu)的數(shù)量。另外，CD譜能夠用于跟蹤多肽中折疊-去折疊的轉(zhuǎn)變，可用來檢測(cè)核酸