生化課件靈遺傳信息的復(fù)制與傳遞

1、Biochemistry遺傳信息的與傳遞鄭莉靈浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，科研A-707：zhengliling本篇主要內(nèi)容v DNA 的及重組v RNA的v 蛋白質(zhì)的與Thecentraldogmaofgenetics(中心法則)DNA的及重組組的主要特點(diǎn)DNA 結(jié)構(gòu)組DNA的特點(diǎn)Watson and Crick; Nobel Laureates inPhysiology or Medicine (1962) for the Discovery of double helix structure of DNADirectionality of DNAnucleotidePO4basea nuc

2、leotidesugarphosphoric acidN baseYou need tonumber the carbons! it matters!5CH2O14ribose32OHThe DNA backbonePutting the DNA backbone together refer to the 3 and 5 ends of the DNA 5PO4base5 CH2O41C3OPO2the last trailing carbonOObase5 CH24O13OH 32TAnti-parallel strandsNucleotides in DNA backbone are b

3、onded from phosphate to sugar between 3 & 5 carbons DNA molecule has “direction” complementary strand runs in opposite direction 5 3 3 5Bonding in DNA 5 3covalent phosphodiester bonds 3 5Chemical analysis had shown that DNA wascomposed of 4 chemical entities called bases:Adenine (A)Thymine (T)Erwin

4、ChargaffGuanine (G)Cytosine (C)Parity Rule:A = TG = CBase pairing in DNAPurines adenine (A) guanine (G)Pyrimidines thymine (T) cytosine (C)Pairing A : T 2 bonds C : G 3 bonds堿基堆積力 （Base stacking force）堿基堆積力：相鄰疏水性堿基對(duì)在旋進(jìn)過(guò)程中彼此堆積在一起相互吸引形成的作用力 。DNA的及重組組的主要特點(diǎn)DNA 結(jié)構(gòu)組DNA的特點(diǎn)一、組DNA的幾個(gè)基本定義組 (genome)：含有一種生物的一整套

5、遺傳信息的1.遺傳物質(zhì)。一套完整單倍體DNA（DNA）真核生物體的組線粒體DNA的全部序列Prokaryotic cellsEukaryotic cells原核細(xì)胞中，每個(gè)DNA只有一個(gè)起始點(diǎn)，而真核是從許多起始點(diǎn)同生物卻有多個(gè)時(shí)開始的。起始點(diǎn)，DNA的一、組DNA的幾個(gè)基本定義泡 (replication bubble): 親代DNA在起始點(diǎn)兩條3.鏈解開形成泡，也叫眼（replication eye)。一、組DNA的幾個(gè)基本定義子 (replicon): 從一個(gè)起始點(diǎn)開始所的DNA4.或DN段是一個(gè)基本的，這種DNA中任何可以作為單一制單元。進(jìn)行的DN段稱為子或復(fù)每個(gè)子使用一次，并且在每個(gè)

6、細(xì)胞周期中只有一次。子中含有具有原點(diǎn)，在需要的元件。在的起始位點(diǎn)的終止位點(diǎn)具有終點(diǎn) (Terminus)。多子及泡組為單一環(huán)狀DNA=單一原核生物子真核生物具有多條線性且每條上有多個(gè)子。真核生物的長(zhǎng)的線性有多子，每個(gè)子都有的起始點(diǎn)。典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞由50000-100000個(gè)子，每個(gè)長(zhǎng)約40-200kb。在相鄰泡相遇處，新生DNA叉的完整的DNA。融二、組DNA的特點(diǎn)Anti-parallel nature of double stranded DNA關(guān)于DNA的三種猜測(cè)CsCl gradient centrifugeConservative hypothesisExpected densi

7、ty gradient resultsDispersive hypothesisExpected density gradient resultsSemiconservative hypothesisExpected density gradient resultsConservativeDispersiveSemi- conservativeSemi-conservative DNA replication:A beautiful experimental approach which deserves a highest award in scienceReplication(+ N15-

8、labeled dNTP)Matthew MeselsonFranklin StahlEach daughter strand is with a parental stand (late 1950s and early 1960s)continuedAB 2X 2XUltra-Centrifugal Sedimentation (CsCl gradient)BA1st2ndor2nd round replication(+ N14-dNTP)2nd round replication(+ N15-labeled dNTP)Evidence supportsthe semi-conservat

9、ive mode: after replication, each parental strandis with a newly synthesized strand二、組DNA的特點(diǎn)1. DNA的方式為半保留(semiconservative replication)The enzymes that catalyzeDNA biosynthesis are called DNA polymerases為什么DNA的方向總是從5端3端？ DNA聚合酶總是作用于自由的3末端，因此DNA新鏈的方向就是53 。 無(wú)論是dsDNA 還是ssDNA ，沒(méi)有引物提供自由的3端，DNA聚合酶是沒(méi)法起始的。D

10、NA polymerase reacts on the 3 end onlyNew DNA elongation from 5 to 3 directionTC AC+5OHpppOHTC AC5OH 3+ppi如果DNA的延伸方向是3 5GATCGpppOH5 pppOH3+GATCG5 pppOH 3因能量的需要， DNA的5 端必須帶有PPP游離dNTP具有pppGATCGpppOH5 pppOH3+ATCGGpppOH35 ppp在0.1-0.2M NaCl 的生理環(huán)境中，磷酸基團(tuán)間的強(qiáng)負(fù)電荷產(chǎn)生的排斥效應(yīng)使dNTP難以聚合到DNA的5端，DNA的5端堿基配對(duì)The DNA polym

11、erase contains 2 active sites: the P (Polymerization) site for DNA synthesis and the E (Error- correcting) site for proof-readingA need for proofreading explains why DNA chains aresynthesized only in the 5 to 3 directionOops, paradox?35535How ?岡崎片段(Okazaki fragments)的發(fā)現(xiàn)In 1968, Japanese scientist Re

12、iji Okazaki discovred Okazaki fragments and proposed that semidiscontinuous replication is a mode in which one new strand is synthesized continuously while the other is synthesized discontinuously.leading and lagging strands,Okazaki fragment355Okazaki fragmentsOkazaki fragments are the short stretch

13、es of 1- 2kb bases produced during discontinuous replication; they are later joined into a covalently intact strand.前導(dǎo)鏈和后隨鏈前導(dǎo)鏈 (leading strand):The leading strand of DNA is synthesized continuously in the 53 direction.后隨鏈 (lagging strand ): The lagging strand of DNA mustgrowoverall in the 35 directi

14、on and is synthesized discontinuously in the form of short fragments (53) that are called Okazaki Fragments and later connected covalently.二、組DNA的特點(diǎn)1. DNA的方式為半保留(semiconservative replication)2. DNA的為半不連續(xù)(discontinuous replication)Direction of DNA replication, bidirectional or unidirectional ?Experim

15、ental demonstration of bidirectional DNA replicationReplication is bi-directionalDNA replication is bidirectional組DNA二、的特點(diǎn)1.DNA的(semiconservative replication)方式為半保留2.DNA的(discontinuous replication)為半不連續(xù)3.絕大多數(shù)的DNA為雙向的4.起點(diǎn)由多個(gè)短重復(fù)序列組成起點(diǎn)（ori）The origin is a sequence of DNA at which replication is initiat

16、ed.起點(diǎn)（origin，常用ori表示）是指DNA所必需的一段特殊DNA序列。DNA的就是從起點(diǎn)開始。細(xì)菌的、質(zhì)粒和一些起點(diǎn)。細(xì)菌和酵母的的環(huán)形DNA通常具有比較明顯起點(diǎn)長(zhǎng)約200-300bp。起點(diǎn)特征A/T rich1.細(xì)菌起始點(diǎn)DNA所有原核生物，噬菌體及都呈環(huán)形且只有子。在與唯一起點(diǎn)相對(duì)180o處有單一終點(diǎn)。單一酵母起始點(diǎn)v 酵母含有多個(gè)起始點(diǎn)。v 酵母序列（autonomously起點(diǎn)為replicating sequences, ARS):元件A（富含A/T的共有序列）：結(jié)合一個(gè)特異的蛋白質(zhì)復(fù)合物起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物（ORC)。3個(gè)序列（B1、B2、B3）可以增加起點(diǎn)的效率，其中B2的9

17、個(gè)堿基與上述ARS共有序列相同。v起始一般特征：1. 由多個(gè)短的重復(fù)序列組成；2. 通常為富含A/T序列；3.被決定起始的蛋白復(fù)合體識(shí)別2.起點(diǎn)特征“呼吸現(xiàn)象”呼吸作用的定義：氫鍵的迅速斷裂和再生.DNA起點(diǎn)處氫鍵迅速斷裂與再生，導(dǎo)致兩條DNA鏈迅速解鏈與聚合，形成瞬間的單泡狀結(jié)構(gòu)的過(guò)程。在富含AT的區(qū)域內(nèi)尤為明顯多數(shù)生物的起點(diǎn)，都是DNA呼吸作用強(qiáng)烈（變性實(shí)驗(yàn)）的區(qū)段，即經(jīng)常開放的區(qū)段，富含A、T。組DNA二、的特點(diǎn)1.DNA的(semiconservative replication)方式為半保留2.DNA的(discontinuous replication)為半不連續(xù)3.絕大多數(shù)的DN

18、A為雙向的4.起點(diǎn)由多個(gè)短重復(fù)序列組成5. DNA必須有引物需要引物RNADNA多數(shù)DNA使用RNA引物，DNA聚合酶不能從頭，即不能從游離的核苷酸開始DNA 鏈， 必須有引物（ primer ） 提供自由的3-OH末端，通過(guò)加入核苷酸使之不斷延伸。由酶催化的RNA 將提供3 -OH 末端， 作為DNA引物的DNA的及重組v組的主要特點(diǎn)DNA 結(jié)構(gòu)組DNA的特點(diǎn)v DNA的酶學(xué)DNA的酶學(xué)體（replisome） 位于每叉處，是執(zhí)行DNA復(fù)個(gè)制功能的含有多種蛋白質(zhì)的復(fù)合體，包含DNA聚合酶和其它輔助因子。DNA需要多種酶參與DNA聚合酶 (DNA polymerase): 催化DNA大腸桿菌D

19、NA聚合酶DNA損傷修復(fù)涉及DNA的跨損傷，主要是在不修復(fù)原初損傷的情況下繼續(xù)DNA的。類似于SOS修復(fù)。催化DNA 重要作用。的酶，在DNA及修復(fù)中起大腸桿菌DNA聚合酶 I功能： 在中去除引物。5 3聚合活性5 3外切酶活性: 用于切除引物3 5 外切酶活性: 用于校正結(jié)構(gòu)： 有3個(gè)酶促活性結(jié)構(gòu)域在胰蛋白酶(或枯草桿菌蛋白酶)作用下可切割成兩個(gè)片段：大片段(68 kD) ： Klenow片段，近C端的2/3部分含53聚合酶活性及3 5外切酶活性，可用于體外；小片段(35 kD) ：近N端的1/3部分含53核酸外切酶，可一次切除最大約為10bp的較短的寡核苷酸DNA 聚合酶 I 的特殊功能：

20、 從DNA切口處開始（切口平移，translation）。Klenow在工程中可分別用于酶切后黏性末端的抹平和補(bǔ)齊，再用T4DNA連接酶連接平末端。大腸桿菌DNA聚合酶IIIDNA聚合酶III全酶結(jié)構(gòu)：酶：由a、e、q 亞基組成2個(gè)1個(gè)g-復(fù)合物：含有6個(gè)亞基：含一對(duì)b亞基可滑動(dòng)的DNA（酶(core enzyme)與全酶(holo-enzyme)的概念DNDNA聚合酶III的酶(core enzyme)酶功能：組成：a 亞基：DNADNAe亞基：具有35外切酶活性（校讀功能），由dnaQq亞基：可能起組裝作用編碼g-復(fù)合物 （加載者）可滑動(dòng)的 DNA2個(gè)酶分別負(fù)責(zé)前導(dǎo)鏈和后隨鏈(b-clam

21、p)DNA聚合酶的DNAg-復(fù)合物 （加載者）可滑動(dòng)的 DNADNA制的兩個(gè)亞基形成一個(gè)環(huán)狀包圍著DNA雙鏈，控 組分與DNA的結(jié)合。DNA聚合酶的g-復(fù)合體 (clamp loader)功能：酶與DNA結(jié)合的橋梁，增強(qiáng)聚合酶對(duì)DNA的親和力組成：6種亞基t亞基：與酶相互作用g、d、d 、c、y（g-復(fù)合體是一種DNA子）加載于DNA。加載蛋白，負(fù)責(zé)將可沿DNA鏈滑動(dòng)的一對(duì)b亞基（DNA夾g-復(fù)合體能結(jié)合ATP，具有ATPase活性，使2個(gè)b亞基形成DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。特性： 只有ATP結(jié)合型g-復(fù)合體才能結(jié)合DNA，使之結(jié)合DNA。DNDNA聚合酶在DNA鏈上的組裝過(guò)程1. g-復(fù)合體利用能

22、量將DNA裝載到DNA模板-引物復(fù)合體中。2.DNA與b、g復(fù)合體 結(jié)合的位點(diǎn)構(gòu)象發(fā)生變化，與催化組分的親和力極強(qiáng)，于是結(jié)合上催化組分，這樣組分就與DNA連接了。3. t亞基結(jié)合到組分，并提供二聚化功能，使得另一個(gè)攜帶有滑動(dòng)鉗的組分也結(jié)合上來(lái)。這樣的全酶并不對(duì)稱，因?yàn)橹挥幸粋€(gè)滑動(dòng)的鉗載復(fù)合物。E. coli DNA聚合酶III全酶的結(jié)構(gòu)模型真核生物DNA聚合酶真核生物有很多種DNA聚合酶與有關(guān)的聚合酶，忠實(shí)度都很高，而與修復(fù)相關(guān)的酶除了聚合酶b外，忠實(shí)度都很低。與有關(guān)的聚合酶，通常結(jié)構(gòu)巨大，有多種酶活的亞基，而與修復(fù)相關(guān)的DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)通常較簡(jiǎn)單五種常見的真核DNA聚合酶 DNA聚合酶：起

23、始兩條DNA鏈的。前RNA-DNA，然后由和代替。負(fù)責(zé) DNA聚合酶/ ： DNA 聚合酶前導(dǎo)鏈，后隨鏈可能由DNA聚合酶完成。 DNA聚合酶g：負(fù)責(zé)線粒體DNA傷修復(fù)。和損 DNA聚合酶b：和堿基切除修復(fù)有關(guān)。真核細(xì)胞DNA pol含有由PCNA三個(gè)亞基的滑動(dòng)鉗結(jié)構(gòu)（被包被的是DNA模板）PCNA:增殖細(xì)胞核抗原DNA需要多種酶參與DNA聚合酶 (DNA polymerase):催化DNADNA解旋酶 (helicase):解開DNA雙螺旋，模板鏈DNA解旋酶(helicase)功能：1.依賴ATP水解產(chǎn)生的能量打開DNA雙螺旋，形成叉。2.結(jié)合酶，激活引物。DNA解旋酶通常以六聚體的形式發(fā)

24、揮作用，如大腸桿菌DnaB蛋白和SV40的螺旋酶T抗原都為六聚體型DNA需要多種酶參與DNA聚合酶 (DNA polymerase): 催化DNADNA解旋酶 (helicase): 解開DNA雙螺旋，鏈模板酶 (primase)：OH開始延伸RNA引物，利用引物3-，即酶 (Primase)實(shí)質(zhì)：特殊的RNA聚合酶大腸桿菌：由 dnaG編碼的DnaG蛋白，催化引物RNA分，長(zhǎng)度為11-12個(gè)堿基。子的真核生物：DNA聚合酶a的三個(gè)小亞基中的兩個(gè)亞基負(fù)責(zé)RNA引物。E. Coli酶（ DnaG蛋白）的結(jié)構(gòu)模型結(jié)構(gòu)包括：N端結(jié)構(gòu)域p12：典型的結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)模體鋅指結(jié)構(gòu)C端結(jié)構(gòu)域p16：與Dn

25、aB蛋白（DNA解旋酶）相互作用的區(qū)域結(jié)構(gòu)域p35：RNA 聚合酶活性C端結(jié)構(gòu)域與DnaB蛋白相互作用，被DnaB蛋白招募到DNA雙螺旋上N端結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合 RNA引物結(jié)構(gòu)域進(jìn)行聚合反應(yīng)，生成74或轉(zhuǎn)錄的解旋過(guò)程會(huì)導(dǎo)致正超螺旋的產(chǎn)生，因此需DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA topoisomerase）來(lái)解決DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)問(wèn)題DNA需要多種酶參與DNA聚合酶 (DNA polymerase): 催化DNADNA解旋酶 (helicase): 解開DNA雙螺旋，鏈模板酶 (primase)：OH開始延伸RNA引物，利用引物3-，即DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 (DNA topoisomerase)：解決DNA的

26、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)問(wèn)題Note:The torsion can be created during DNAtranscription as well onereason that sometimes topo-isomerase(s) can be identifiedas atranscriptionfactor(s)in vitroDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 (DNA topoisomerase)對(duì)于閉合環(huán)狀的DNA而言，解旋過(guò)程會(huì)導(dǎo)致正超螺旋的產(chǎn)生，雖然DNA本身有負(fù)超螺旋，但不足以抵消產(chǎn)生的正超螺旋，因此需要DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶。p Enzymes that can introduce negative su

27、percoils are called gyrases (促旋酶,旋轉(zhuǎn)酶)導(dǎo)入負(fù)超螺旋，緩解過(guò)度的正超螺旋；p those that can introduce positive supercoils are called reversegyrases (反向促旋酶)導(dǎo)入正超螺旋，緩解過(guò)度的負(fù)超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶的類型原核生物中的兩類拓?fù)洚悩?gòu)酶：Type I ：topoisomerase I & III（不需ATP，作用于單鏈）Type II ：topoisomerase IV & gyrase（需ATP，作用于雙鏈）兩類拓?fù)洚悩?gòu)酶都有DNA剪切和連接酶的活性。 Gyrase有時(shí)候又稱為topo

28、isomerase II拓?fù)洚悩?gòu)酶有兩類： 拓?fù)洚悩?gòu)酶 I：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應(yīng)不需要能量，主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。 拓?fù)洚悩?gòu)酶II：使DNA兩條鏈發(fā)生斷裂和再連接。當(dāng)引入負(fù)超螺旋時(shí)需要由ATP提供能量，同有關(guān)。DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。二者共同Type I topoisomeraseA type I topoisomerase 作用于DNA雙螺旋中的一條鏈,暫時(shí)切斷一條ssDNA鏈，形成酶-DNA共價(jià)中間物而使超螺旋DNA松弛化然后再將切斷的ssDNA連接起來(lái)。不需ATP供能。Type II topoisomerases大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶(gyrase) ， 是典型的

29、拓?fù)洚悩?gòu)酶，能 暫 時(shí) 性 地 切 斷dsDNA 并重新連接成dsDNA ， 將負(fù)超 螺旋引入DNA需要ATP水解供能。，II型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用機(jī)制ATP存在時(shí)，一個(gè)DNA雙螺旋上的兩條鏈同時(shí)出現(xiàn)切口；隨后另一個(gè)DNA 雙螺旋穿過(guò)切口；最后切口重新連接。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶功能：過(guò)程中，DNA 每10bp，叉前方的模板DNA雙螺旋就要在繞其長(zhǎng)軸旋轉(zhuǎn)一周，產(chǎn)生正超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種可逆的核酸酶。它們可共價(jià)結(jié)合DNA團(tuán)，切斷磷酸二酯鍵。上的磷酸基消除正超螺旋，使叉能夠順利前進(jìn)。維持E.coli、噬菌體和質(zhì)粒DNA起始模板DNA負(fù)超螺旋狀態(tài)。環(huán)形后產(chǎn)生的兩個(gè)子連環(huán)體解連環(huán)。DNA需要多種酶參與

30、DNA聚合酶 (DNA polymerase): 催化DNADNA解旋酶 (helicase): 解開DNA雙螺旋，鏈模板酶 (primase)：OH開始延伸RNA引物，利用引物3-，即DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 (DNA topoisomerase)：解決DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)問(wèn)題切除引物的核酸酶 : 切除引物RNA岡崎片段的成熟過(guò)程是指將不連續(xù)產(chǎn)生的岡崎片段轉(zhuǎn)變成長(zhǎng)的無(wú)間隙DNA產(chǎn)物，這一過(guò)程包括切除RNA引物，填補(bǔ)間隙，連接兩個(gè)DN段等。切除引物的酶真核生物的DNA聚合酶都沒(méi)有5 3外切酶活性，因此沒(méi)有切除RNA引物的可能。vv大腸桿菌：DNA聚合酶I 或RNase H I真核生物：RNase H I

31、和FEN1或FEN1/Dna2vRNaseH I：一種內(nèi)切酶，專門水解DNA/RNA雜合鏈中的RNA但是通常會(huì)留下最后一個(gè)核苷酸v FEN1 (flap endonuclease1): 是一種特異切割具有“帽邊”或“蓋子”(flap) 結(jié)構(gòu)的DNA底物的內(nèi)切酶，具有核酸內(nèi)切酶和53核酸外切酶活性。形成蓋子結(jié)構(gòu)：FEN1表現(xiàn)內(nèi)切酶活性。沒(méi)有蓋子結(jié)構(gòu)：FEN1表現(xiàn)53外切酶活性。切除RNA引物的兩種機(jī)制1. 依賴RNase HI/FEN1切除方式：首先RNaseHI利用核酸內(nèi)切酶活性切割連接在岡崎片段5端的RN段，在RNA-DNA引物連接點(diǎn)旁留下1個(gè)核糖核苷酸；然后FEN1利用53核酸外切酶活性切

32、除這最后一個(gè)核糖核苷酸。切除RNA引物的兩種機(jī)制2. 依賴Dna2/FEN1切除方式：解旋酶Dna2具有依賴DNA 的ATPase和35解旋酶活性， 其解旋作用可以使前一個(gè)岡崎 片段的5端引物形成“蓋子” 結(jié)構(gòu)，再由FEN1的內(nèi)切酶活性切除引物。DNA需要多種酶參與DNA聚合酶 (DNA polymerase): 催化DNADNA解旋酶 (helicase): 解開DNA雙螺旋，鏈模板酶 (primase)：OH開始延伸RNA引物，利用引物3-，即DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 (DNA topoisomerase)：解決DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)問(wèn)題切除引物的酶 (RNase H): 切除引物RNA Pol d或P

33、ol e：填補(bǔ)空隙DNA需要多種酶參與DNA聚合酶 (DNA polymerase): 催化DNADNA解旋酶 (helicase): 解開DNA雙螺旋，鏈模板酶 (primase)：OH開始延伸RNA引物，利用引物3-，即DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 (DNA topoisomerase)：解決DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)問(wèn)題切除引物的酶 (RNase H): 切除引物RNA Pol d或Pol e：填補(bǔ)空隙DNA連接酶 (DNA ligase)DNA連接酶 (DNA ligase)將相鄰的核苷酸鏈通過(guò)3-5磷酸二酯鍵連接。岡崎片段的連接是依靠DNA連接酶的作用。What happen after removing

34、 the last RNA primer in bacterial DNA ?Perfect !End-loss problem in replicationNote:The very 5 of the leading strand, although not drawn here,also may have the same end-loss problem because?it is primed by an RNA primeras wellDNA需要多種酶參與DNA聚合酶 (DNA polymerase): 催化DNADNA解旋酶 (helicase): 解開DNA雙螺旋，鏈模板酶 (

35、primase)：OH開始延伸RNA引物，利用引物3-，即DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 (DNA topoisomerase)：解決DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)問(wèn)題切除引物的酶 (RNase H): 切除引物RNA Pol d或Pol e：填補(bǔ)空隙DNA連接酶 (DNA ligase):端粒酶 (telomerase):v末端有端粒 (telomere), 端粒由富含G的重復(fù)序列組成。的3端比5端長(zhǎng)，形成單鏈重復(fù)序列多為雙鏈，但每個(gè)ssDNA。v TTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)的末端5TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3（富含G鏈）3AACCCCAACCCCAACCCC 5（富含C鏈）起點(diǎn)，用于募

36、集一種特異的DNAv 這一特殊結(jié)構(gòu)作為新的聚合酶，即端粒酶（telomerase）。v端粒酶包括：端粒酶RNA(human telomerase RNA, hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein1, hTP1)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerase reverseriptase, hTRT)端粒酶催化作用模式DNA需要多種酶參與DNA聚合酶 (DNA polymerase): 催化DNADNA解旋酶 (helicase): 解開DNA雙螺旋，模板鏈酶 (primase)：延伸RNA引物，利用引物3-OH開始，即DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 (

37、DNA topoisomerase)：解決DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)問(wèn)題切除引物的酶 (RNase H): 切除引物RNA Pol d或Pol e：填補(bǔ)空隙DNA連接酶 (DNA ligase):端粒酶 (telomerase):其它酶和蛋白因子如：起穩(wěn)定作用的單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB） 等。單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)SSB的作用：1）使DNA單鏈保持一種伸展構(gòu)象，作為模板； 2）使解開的單鏈不形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；3）保護(hù)DNA單鏈免受Dnase水解。DNA的及重組v組的主要特點(diǎn)DNA 結(jié)構(gòu)組DNA的特點(diǎn)v DNA的酶學(xué)v DNA的詳細(xì)機(jī)制DNA的詳細(xì)機(jī)制v 原核生物DNA的：以大腸桿菌為例原點(diǎn)（oriC

38、）大腸桿菌的（priming）的DNA鏈的延伸的終止次數(shù)的小結(jié)：原核生物DNA的v 真核生物DNA的v 線粒體DNA的DNA的滾環(huán)v原點(diǎn)（oriC）大腸桿菌的v 富含A/T，長(zhǎng)約245bp;v 含有兩類短的重復(fù)序列:一個(gè)為9bp，位于oriC的右側(cè)，是DnaA蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，共4個(gè)拷貝； 另一個(gè)為13bp，位于oriC的左側(cè)，是雙鏈解鏈的部位，共3個(gè)拷貝；DNA的詳細(xì)機(jī)制v 原核生物DNA的：以大腸桿菌為例原點(diǎn)（oriC）大腸桿菌的 的（priming）DNA鏈的延伸的終止次數(shù)的小結(jié)：原核生物DNA的v 真核生物DNA的v 線粒體DNA的vDNA的滾環(huán)（一）在起點(diǎn)解旋酶和多種因子形成復(fù)合物Dn

39、a A 蛋白結(jié)合oriC的4個(gè)9bp反向重復(fù)序列形成起始復(fù)合物。作用于oriC的3個(gè)13bp正向重復(fù)序列，DNA在這3個(gè)位點(diǎn)解鏈，形成開放型復(fù)合物（open complex）Dna B 蛋白(解旋酶）53解旋酶作用產(chǎn)生兩條模板鏈DnaB蛋白與酶DnaG結(jié)合，激活酶, 形成體DnaG蛋白酶，是一種特殊的RNA聚合酶（一）在起點(diǎn)解旋酶和多種因子形成復(fù)合物DnaC蛋白確保解旋酶DnaB蛋白結(jié)合于起始位點(diǎn)SSB蛋白穩(wěn)定解旋 后的單鏈DNA構(gòu)象，有助于解旋。HU蛋白DNA結(jié)合蛋白，對(duì)起促進(jìn)作用。HU蛋白能夠使DNA發(fā)生折疊。II類拓?fù)洚悩?gòu)酶促旋酶(gyrase)a) DnaA結(jié)合于oriC 的4個(gè)9bp

40、反向重復(fù)序列，形成合物。起始復(fù)ATPb) DnaA 作用于oriC的3個(gè)13bp正向重復(fù)序列，DNA在3 個(gè)位點(diǎn)解鏈，形成開放型復(fù)合物。開放型復(fù)合物(c)DnaC和DnaB組成復(fù)合物，識(shí)別起始位點(diǎn)，將DnaB運(yùn)送到指置，從而形成預(yù)復(fù)合物(prepriming complex)。單鏈DNA結(jié)合蛋白SSBSSB形成四聚體，結(jié)合DNA單鏈區(qū)，起穩(wěn)定解旋后的單鏈DNA構(gòu)象，有助于解旋。RNA引物（二）酶(d) 預(yù)復(fù)合體中的DnaB解旋酶招募DnaG蛋白(酶)結(jié)合到DNA上起始引物的。酶DnaG蛋白是一種特殊的RNA聚合酶，催化RNA引物，引物長(zhǎng)度一般1112個(gè)堿基。小E. coli DNA過(guò)程中體的形

41、成C小結(jié)：DNA的過(guò)程1：幾個(gè)的DnaA蛋白單體互相協(xié)作結(jié)合到oriC的4個(gè)9bp重復(fù)序列上，使得oriC DNA發(fā)生扭曲；2：然后DnaA蛋白作用于位于oriC左側(cè)的3個(gè)13bp串聯(lián)重復(fù)序列，在ATP存在的條件下，DnaA蛋白打開這3個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，形成一個(gè)開放復(fù)合物；3：這3個(gè)13bp保守的串連重復(fù)序列打開后，DnaA蛋白吸引(招募)DnaBDnaC復(fù)合物（前體，prepriming）加入其中，形成叉（6個(gè)DnaC單體和1個(gè)六聚體DnaB1個(gè)DnaBDnaC復(fù)合物；DnaB是解旋酶，起打開DNA雙鏈的作用，而DnaC通過(guò)水解ATP獲得能量來(lái)與DnaB，讓DnaB獨(dú)自行動(dòng)發(fā)揮作用 ）；Dna

42、A蛋白+oriC4：DnaBDnaC結(jié)合其上形成叉后，DnaA蛋白從3個(gè)13bp的串聯(lián)重；通過(guò)ATP水解供能，復(fù)序列處DnaC蛋白解離，DnaB蛋白結(jié)合到單鏈DNA上行使其功能，不斷擴(kuò)大雙鏈DNA的開放區(qū)域；5：SSB蛋白結(jié)合到單鏈DNA上，以保DnaA蛋白；DnaB蛋白+DnaC復(fù)合物DnaA蛋白；DnaC蛋白持DNA的單鏈狀態(tài)（每個(gè)60個(gè)SSB蛋白）；6：DnaB解旋酶招募DnaG蛋白(叉約DnaB蛋白；SSB蛋白酶)結(jié)合到DNA上形成體，起始引物的。DnaB蛋白；SSB蛋白；DnaG蛋白DnaB蛋白；SSB蛋白； DnaG蛋白；DNA聚合酶IIIDNA的詳細(xì)機(jī)制v 原核生物DNA的：以大

43、腸桿菌為例原點(diǎn)（oriC）大腸桿菌的的DNA鏈的延伸的終止次數(shù)的小結(jié)：原核生物DNA的v 真核生物DNA的v 線粒體DNA的vDNA的滾環(huán)DNA鏈的延伸體的定義前導(dǎo)鏈連續(xù)與后隨鏈的斷續(xù)前導(dǎo)鏈與后隨鏈的協(xié)同岡崎片段的連接體(replisome)DNA聚合酶III全酶加入體后，由DNA和多種蛋白質(zhì)組裝而成DNA的超體（replisome）。的能夠復(fù)合物就是The replisome is the multi-protein structure that assembles at the bacterial replicating fork to undertake synthesis of DNA

44、. It contains DNA polymerase and other enzymes and accessoryproteins.叉處，是執(zhí)行DNA位于每個(gè)功能的多種蛋白質(zhì)復(fù)合體，包含DNA聚合酶和其它輔助因子。前導(dǎo)鏈連續(xù)與后隨鏈的斷續(xù) 在前導(dǎo)鏈引物的只發(fā)生一次而在后隨鏈中每個(gè)岡崎片段的起始前都會(huì)有引物的。 在半不連續(xù)聚合酶III同時(shí)過(guò)程中，一個(gè)DNA前導(dǎo)鏈和后隨鏈。DNA 聚合酶DNA聚合酶I： 負(fù)責(zé)切除RNA引物DNA聚合酶 II：可利用損傷尚未修復(fù)的DNA鏈作為模板合成DNA，但不能修復(fù)損傷。DNA聚合酶 III：負(fù)責(zé)DNA。酶的組成包括：DNAa亞基（130000）主要功能是e

45、亞基具有35外切酶活性（校正功能）a亞基可增強(qiáng)其活性q亞基可能起組裝作用大腸桿菌DNA聚合酶IIIg復(fù)合體功能：酶與DNA結(jié)合的橋梁，增強(qiáng)聚合酶對(duì)DNA的親和力組成：6個(gè)亞基t亞基：與酶相互作用g、d、d 、c、y（g-復(fù)合體是一種DNA）加載于DNA。加載蛋白，負(fù)責(zé)將可沿DNA鏈滑動(dòng)的一對(duì)b亞基（DNAg-復(fù)合體能結(jié)合ATP，具有ATPase活性，使2個(gè)b亞基形成DNA化。結(jié)構(gòu)發(fā)生變特性： 只有ATP結(jié)合型g-復(fù)合體才能結(jié)合DNA，使之結(jié)合DNA。DN前導(dǎo)鏈與后隨鏈的協(xié)調(diào)會(huì)導(dǎo)致一個(gè)ssDNA環(huán)的形成，這個(gè)ssDNA前導(dǎo)鏈的的模板；這個(gè)單鏈DNA必須長(zhǎng)到足以環(huán)就是后隨鏈一個(gè)岡崎片段。前導(dǎo)鏈與后

46、隨鏈的協(xié)調(diào)DnaB前導(dǎo)鏈與后隨鏈的協(xié)調(diào)解旋酶DnaB的特點(diǎn)：1.與DNA聚合酶III的g-復(fù)合物t亞基的結(jié)合可協(xié)調(diào)解旋、聚合速度。叉，解旋酶一旦與DNA聚合酶的在g-復(fù)合物t亞基結(jié)合，就開始將DNA雙螺旋打開，其解旋的速度和DNA聚合酶III全酶的速度相同。如解旋酶不與全酶結(jié)合，解旋速度降低，DNA聚合酶III的速度將超過(guò)解旋酶的解旋速度，趕上并抓住解旋酶。前導(dǎo)鏈與后隨鏈的協(xié)調(diào)解旋酶DnaB的特點(diǎn)：2.與酶周期性的結(jié)合，利用后隨鏈模板當(dāng)一個(gè)岡崎片段引物。完畢，酶將脫離DNA，后隨鏈的核心酶也脫離滑動(dòng)的DNADNA。然后， g-復(fù)合物將一個(gè)新的滑動(dòng)和的DNA加在剛剛的后隨酶也結(jié)鏈引物-模板連接處

47、，合與引物-模板連接處，起始下一個(gè)岡崎片段。前導(dǎo)鏈與后隨鏈的協(xié)同后隨鏈斷續(xù)Each Okazaki fragment starts with a primer and stops before the next fragment.DNA polymerase I removes the primer by its 53 exonuclease activity and replaces it with DNA in anaction that resemblestranslation.DNA ligase makes the bond that connects the 3 end of one Okazaki fragment to the 5 beginning of the next fragment.每個(gè)岡崎片段都從引物開始，在下一個(gè)片段前停止。DNA聚合酶I：（ 53 外切酶活性）切除RNA引物 并補(bǔ)齊缺口。(n-1 RNA引物也可由 RNaseH 切除) DNA連接酶將前一個(gè)岡崎片段的3端與后一個(gè)岡崎片 段的5端相連，形成連續(xù)的核苷酸鏈。每個(gè)岡崎片段都是的1：DnaG ( primer；酶) synthesizes RNA2：DNA polymerase