蛋白純化AKTA操作說明

1、AKTA pure操作說明分子篩層析操作步驟：1. 開機(jī)：打開AKTA pure開關(guān)，看指示燈，泵同步（泵內(nèi)有注入液體的聲音）。2. 打開系統(tǒng)：打開電腦：雙擊 Unicorn 7.0打開系統(tǒng)，進(jìn)入log on 界面，用戶名默認(rèn)為Default，輸入密碼：default，點(diǎn)ok鍵，出現(xiàn)提示對(duì)話框，繼續(xù)點(diǎn)確定，進(jìn)入系統(tǒng)。注意：進(jìn)入系統(tǒng)時(shí)會(huì)彈出三個(gè)界面：System Control界面， Evaluation界面和Administration界面。其中system Control界面為主操作窗口，所有的設(shè)置選項(xiàng)都是在該界面下完成：Manual-Execute Manual instructions-

2、.； Evaluation界面為結(jié)果數(shù)據(jù)查看及處理窗口；Administration界面為Unicorn 7.0系統(tǒng)設(shè)置界面。3. 洗泵：把A1泵頭從20%乙醇中取出，用去離子水沖洗，放入分子篩緩沖液中，在System Control界面下，點(diǎn)擊manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash-點(diǎn)開inlet，選擇A1-Excuse。4. 設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)：設(shè)柱壓：Alams-alam systerm pressure-high alam-設(shè)置柱壓-Execute；設(shè)流速：Pumps-System flow -設(shè)置system flow（1m

3、L/min）-Execute。注意：流速和柱壓設(shè)置參照“GE蛋白純化柱表”，不要超出最高限制。5. 裝柱子(先上后下)：接柱子的上面：擰下連接進(jìn)樣閥和檢測(cè)器之間的線，等進(jìn)樣閥出口有液體流出時(shí)，擰開柱上面線頭的螺帽，將它連到進(jìn)樣閥出口；接柱子的下面：去掉柱下端連接的注射器，連上接頭，連上一段線，待液體滴出滴出液體滴到檢測(cè)器上的連接口的洞里，滴滿，將接頭連到檢測(cè)器的連接口里。6.平衡柱子：分子篩buffer平衡柱子，一般要兩個(gè)小時(shí)左右，鹽離子濃度達(dá)到5.5%左右。7.設(shè)置系統(tǒng)及收集參數(shù)：命 名：先end-Manual instructions，點(diǎn)擊browse，彈出select result na

4、me&location 界面，點(diǎn)開文件夾“defaultHome”，找到文件夾“l(fā)abdata”，點(diǎn)開，選擇自己名字首字母縮寫文件夾(已創(chuàng)建)，在界面下方“name”指令框進(jìn)行命名。注意：命名時(shí)要標(biāo)明日期，柱子型號(hào)，樣品名稱。設(shè)流速：Pumps-System flow-設(shè)流速（1 mL/min）-Execute；設(shè)柱壓：Alams- alam systerm pressure-high alam-設(shè)置柱壓-點(diǎn)擊Execute；洗A泵：Pumps-Pump A wash-點(diǎn)開inlet，選擇A1-Excuse；紫外調(diào)零：Monitors-Auto zero UV-Execute；設(shè)置收集

5、體積：Fracton collection-peak fractionation-fraction size-設(shè)置收集體積- Execute；一般設(shè)為1 mL(可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整)。 設(shè)置收集水平：Fracton collection-peak fractionation parameters-Start level-設(shè)置起始收集水平- Execute。注意：對(duì)于初次純化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可設(shè)低些，如10 mAU,避免損失蛋白。8.上樣：沖洗Loop環(huán)：取5mL注射器，吸取5 mL分子篩（不能有氣泡），從進(jìn)樣口注射2倍Loop體積的分子篩來清洗Loop環(huán)；蛋白樣品處理：取出蛋白

6、樣品（< 2 mL），12000 rpm離心3 min，把上清轉(zhuǎn)移至新的離心管管，重復(fù)一次，以去除沉淀，避免堵塞系統(tǒng)；手動(dòng)蛋白上樣：把蛋白樣品轉(zhuǎn)移至注射器內(nèi)，從進(jìn)樣口把樣品注射入Loop環(huán)內(nèi)； 注意：上樣時(shí)應(yīng)小心操作，首先彈出注射器內(nèi)的氣泡，隨后稍推注射器，使注射器出口處懸掛一樣品液滴（別太用力，導(dǎo)致液滴滴落），然后把注射器插入進(jìn)樣口，把蛋白樣品推入Loop環(huán)中。Inject:點(diǎn)擊Flow path-injection valve-點(diǎn)開position選項(xiàng)-inject-Execute-走2倍Loop體積的分子篩緩沖液；Load:點(diǎn)擊Flow path-injection valve-點(diǎn)

7、開position選項(xiàng)-manual load-Execute，調(diào)回Load狀態(tài)。9.收集目標(biāo)蛋白：參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，估計(jì)樣品出峰位置，收集蛋白樣品，做好標(biāo)記，過完后，peak fracstop 900 停止收集。10. 20%乙醇平衡柱子：等精氨酸峰出來，離子濃度平衡后，點(diǎn)擊pause，進(jìn)分子篩的buffer的泵頭用去離子水洗，放入20%的乙醇中，continue-洗泵（A1泵），平衡柱子。20%的乙醇平衡柱子，一般要兩小時(shí)左右，鹽離子濃度達(dá)到0%。11.收柱子（先下后上）：調(diào)節(jié)流速至0.5 mL/min，擰下柱下面的接頭，連上注射器，再調(diào)流速至1 mL/min，注射器內(nèi)吸入3-5 mL 2

8、0%乙醇，取下柱上面的接頭看是不是往外流液體，因?yàn)樽⑸淦鲀?nèi)有壓力，液體會(huì)倒流，蓋子內(nèi)滴滿液體，立即擰上蓋子，防止進(jìn)氣泡，將進(jìn)樣閥的線接到檢測(cè)器上。12.關(guān)閉系統(tǒng)：點(diǎn)擊End 關(guān)閉系統(tǒng)界面，關(guān)閉AKTA pure電源，關(guān)電腦。2018-09-01AKTA pure操作說明離子交換蛋白純化步驟（RESOURCE Q/S）1. 開機(jī)：打開AKTA pure開關(guān)，看指示燈，泵同步（泵內(nèi)有注入液體的聲音）。2. 打開系統(tǒng)：打開電腦：雙擊 Unicorn 7.0打開系統(tǒng),進(jìn)入log on 界面，用戶名默認(rèn)為Default,輸入密碼：default,點(diǎn)ok鍵，出現(xiàn)提示對(duì)話框，繼續(xù)點(diǎn)確定，進(jìn)入系統(tǒng)。注意：進(jìn)入

9、系統(tǒng)時(shí)會(huì)彈出三個(gè)界面：System Control界面, Evaluation界面和Administration界面。其中system Control界面為主操作窗口，所有的設(shè)置選項(xiàng)都是在該界面下完成：Manual-Execute Manual instructions-.； Evaluation界面為結(jié)果數(shù)據(jù)查看及處理窗口；Administration界面為Unicorn 7.0系統(tǒng)設(shè)置界面。3. 洗泵：點(diǎn)擊pause暫停系統(tǒng)-去離子水沖洗A1,B1進(jìn)液泵頭-分別放入A，B液中；洗B泵： 選擇System Control界面manual-Execute Manual instructions

10、-Pumps-Pump A wash-點(diǎn)開inlet，選擇B1-Excuse；洗A泵： 選擇System Control界面manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash-點(diǎn)開inlet,選擇A1-Excuse,洗泵結(jié)束后調(diào)B至100%，0min-Execute。4. 設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)：設(shè)柱壓：Alams-alam systerm pressure-high alam-設(shè)置最高柱壓-Execute。設(shè)流速：Pumps-System flow-設(shè)置system flow（1 mL/min）-execute；注意：流速和柱壓設(shè)置參照“GE蛋白純

11、化柱表”，不要超出最高限制。5. 安裝RESOURCE柱（先上后下）：裝離子柱時(shí)先擰開離子柱上面，連上來自進(jìn)樣閥的線，邊擰緊上面邊擰松柱下面，在離子柱子下端出口連上轉(zhuǎn)接頭，接上一根較短的先并連到檢測(cè)器上（流出液體，滴滿檢測(cè)器上的連接口的洞里，再擰緊）。6. 平衡RESOURCE 柱：等B液平衡后，點(diǎn)擊Pumps-gradient-Target-調(diào)B至0%，0min-Execute。等平衡后，記錄最高和最低鹽離子濃度：離子交換B液鹽離子濃度約為84%，離子交換A液鹽離子濃度約為1.7%。7.設(shè)置系統(tǒng)及收集參數(shù)：命 名：先end-Manual instructions，點(diǎn)擊browse，彈出sel

12、ect result name&location界面，點(diǎn)開文件夾“defaultHome”，找到文件夾“l(fā)abdata”，點(diǎn)開，選擇自己名字首字母縮寫文件夾(已創(chuàng)建)，在界面下方“name”指令框進(jìn)行命名。注意：命名時(shí)要標(biāo)明日期，柱子型號(hào)，樣品名稱。設(shè)流速：Pumps-System flow-設(shè)流速（1 mL/min）-Execute;設(shè)柱壓：Alams-alam systerm pressure-high alam-設(shè)置柱壓-點(diǎn)擊Execute；紫外調(diào)零：Monitors-Auto zero UV-Execute；設(shè)置收集體積：Fracton collection-peak frac

13、tionation-fraction size-設(shè)置收集體積- Execute；一般設(shè)為1 mL (可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整) 。設(shè)置收集水平：Fracton collection-peak fractionation parameters-Start level-設(shè)置起始收集水平- Execute。注意：對(duì)于初次純化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可設(shè)低些，如10 mAU，避免損失蛋白。8.上樣：沖洗Loop環(huán)：取5 mL注射器，吸取5 mL分子篩（不能有氣泡），從進(jìn)樣口注射2倍Loop體積的分子篩來清洗Loop環(huán)；蛋白樣品處理：取出蛋白樣品（< 2 mL），12000 rpm離心3 mi

14、n，把上清轉(zhuǎn)移至新的離心管管，重復(fù)一次，以去除沉淀，避免堵塞系統(tǒng)；手動(dòng)蛋白上樣：把蛋白樣品轉(zhuǎn)移至注射器內(nèi)，從進(jìn)樣口把樣品注射入Loop環(huán)內(nèi)； 注意：上樣時(shí)應(yīng)小心操作，首先彈出注射器內(nèi)的氣泡，隨后稍推注射器，使注射器出口處懸掛一樣品液滴（別太用力，導(dǎo)致液滴滴落），然后把注射器插入進(jìn)樣口，把蛋白樣品推入Loop環(huán)中。Inject: 點(diǎn)擊Flow path-injection valve-點(diǎn)開position選項(xiàng)-inject-execute-走2倍Loop體積的分子篩緩沖液；Load: 等流穿峰出來后，點(diǎn)擊Flow path-injection valve-點(diǎn)開position選項(xiàng)-manual

15、load-Execute，調(diào)回Load狀態(tài)。注意：流穿峰蛋白先別丟棄，它有可能是樣品沒有掛上柱子而直接流出來的目標(biāo)蛋白。9. 洗脫目的蛋白：Pumps-Gradient target 50%，length 50 min (可調(diào))-Execute，自離子柱上洗脫結(jié)合的蛋白10. 收集目標(biāo)蛋白：收集洗脫下來的蛋白樣品，做好標(biāo)記，過完后，peak fracstop 900停止收集。11. B液平衡離子柱：Pumps-Gradient target 50%，length 0 min- Execute，至鹽離子濃度達(dá)到最高且平衡。如繼續(xù)純化其他蛋白樣品：要用A液再平衡后再上樣，步驟同上1-11。如不再純化其他蛋白樣品：點(diǎn)擊pause暫停系統(tǒng)-去