細胞培養(yǎng)技術

1、馮曉桃廣西中醫(yī)藥科學實驗中心l從機體內取出組織或細胞，在體外模擬體內的生理環(huán)從機體內取出組織或細胞，在體外模擬體內的生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下進行孵育培境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下進行孵育培養(yǎng)，使之生存、生長，并維持其結構和功能的方法。養(yǎng)，使之生存、生長，并維持其結構和功能的方法。1、條件可控：研究影響因素2、體外： 可用各種手段研究3、長期： 遺傳性狀4、大量提供條件相同的細胞1、科學研究藥物研究與開發(fā) l新藥篩選：如化學合成藥物藥效研究,中藥有效成分篩選與鑒定等。l疫苗研究與開發(fā)：如病毒性疫苗的研究與開發(fā)(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),腫瘤疫苗(多肽疫苗)等。l基因

2、工程藥物研究與開發(fā)：如干擾素研究與開發(fā),細胞生長因子研究與開發(fā)等。l細胞工程藥物研究與開發(fā)：生物活性多肽研究與開發(fā),人參皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究與開發(fā)。 l單克隆抗體制備：包括診斷用單克隆抗體,治療用單克隆抗體?；A研究 (1) 藥物作用機理； (2) 基因功能； (3) 疾病發(fā)生機理。 2、生物制藥 l疫苗生產：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),腫瘤疫苗(多肽疫苗)等。l基因工程藥物生產：如在臨床醫(yī)學中具有治療價值的一些細胞生長因子如干擾素,粒細胞生長因子,胸腺肽等。 l診斷用和藥用單克隆抗體生產。 l細胞工程藥物生產：生物細胞內的一些生物活性多肽,生物活性物質等。（一） 實

3、驗室準備l1. 無菌操作實驗室 無菌操作間、緩沖間、更衣室等。 2. 生物安全柜（超凈工作臺） 生物安全柜是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標本等具有感染性的實驗材料時，用來保護操作者本人、實驗室環(huán)境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產生的感染性氣溶膠和濺出物而設計的。 生物安全柜分類 一級：可保護工作人員和環(huán)境而不保護樣品，目前已很少用。 二級：提供工作人員、環(huán)境和產品的保護。l A（A1和A2）l B（B1和B2）l 三級：生物安全3、4級實驗室用。ESCO AC2-4S1l3.相關儀器設備 （1）CO2培養(yǎng)箱 （2）倒置顯微鏡、普通顯微鏡及照相系統(tǒng) （3）冰箱（4度，-20

4、度，-80度） （4）超純水系統(tǒng)（電阻率 18.2M.cm ） （5）細胞存儲器（液氮罐，深低溫冰箱、-80度冰箱） （6）高溫高壓滅菌裝置、清洗裝置 （7）濾菌相關儀器（針式濾器，泵加壓過濾） （8）離心機、天平、pH儀、移液槍等l（二）培養(yǎng)用品 （1）培養(yǎng)瓶（25 、75 cm3） 培養(yǎng)板（96、48、24、12、6孔） 培養(yǎng)皿（各種直徑規(guī)格） l（二）培養(yǎng)用品 （2）離心管（15、50 ml） （3）移液管、吸管 （4）凍存管、EP管 （5）試劑瓶等。 （三）細胞培養(yǎng)用試劑 （1）培養(yǎng)基 MEM，DMEM，RPMI1640 4保存，避免光照；用前放在37溫熱。 （三）細胞培養(yǎng)用試劑 （1

5、）培養(yǎng)基 水 無機鹽 氨基酸 維生素 其他成分葡萄糖、酚紅、HEPES、丙酮酸鈉 （三）細胞培養(yǎng)用試劑 （1）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基選擇：按提供細胞來源的要求準備。 什么情況下選擇無酚紅培養(yǎng)基： 酚紅影響到實驗結果 流式細胞儀檢測細胞樣品（三）細胞培養(yǎng)用試劑（2）血清 l血清分類l1、特級胎牛血清（最高級別的） （1）Hyclone 北美特級胎牛血清北美特級胎牛血清（SH30070.03） （2）Gibco北美特級胎牛血清北美特級胎牛血清（16000-044）l2、優(yōu)等級胎牛血清（1）Hyclone加拿大優(yōu)等胎牛血清加拿大優(yōu)等胎牛血清（SH30396） （2）Hyclone澳大利亞優(yōu)等胎牛血清澳大利亞

6、優(yōu)等胎牛血清（SH30084）（3）Gibco澳大利亞胎牛血清澳大利亞胎牛血清（10099-141）l血清分類l3、普通進口胎牛血清 l 如如Hyclone南美胎牛血清南美胎牛血清（SV30087）l4、國產的各種系列胎牛血清 國產的胎牛血清，國內沒有嚴格意義的胎牛血清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而國內都是剖腹產出胎牛，8小時左右取血，然后，進行過濾分裝。l5、其他血清 新生牛血清，小牛血清，一般國產的。（三）細胞培養(yǎng)用試劑（2）血清 使用：5 20%。 保存：20-70儲存； 4存放勿超過一個月。 解凍步驟： -20或70至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝或使用。 （三）細胞培養(yǎng)用試

7、劑l血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀物出現(xiàn)，該如何處理? 原因：脂蛋白的變性； 血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會存在于血清中，也是造成絮狀物的主要原因之一。這些絮狀物的產生不會影響血清本身的質量。 去除方法：可以將血清分裝至無菌離心管內，以400g 稍微離心，將上清液加入培養(yǎng)基內一起過濾。我們不建議您直接過濾血清以去除這些絮狀物，因為它可能會阻塞過濾膜。 （三）細胞培養(yǎng)用試劑 血清熱滅活： 56, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。目的：使血清中補體成份失活。 啟動的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，啟動淋巴細胞和巨噬細胞活化。在免疫學研

8、究、培養(yǎng)ES 細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。 除非必須，一般不建議作此熱處理。 （二）細胞培養(yǎng)用試劑 （3）緩沖液 Hanks、PBS 4保存，避免光照；用前放在37溫熱。 （4）抗生素 工作濃度 儲存溫度 殺滅細菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-

9、) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds （5）添加因子 生長因子（ EGF、FGF、BFGF）、胰島素、肝素、二巰基乙醇等 （6）消化液 胰酶（0.25%、0.125%）、EDTA（0.02%） 消化效果與濃度、溫度、時間、pH值等相關 （三）細胞培養(yǎng)用試劑 （7）其他 谷氨酰胺： 終濃度2 mmol/L HEPES： 10-25 mmol/L 丙

10、酮酸鈉： 終濃度1 mmol/L 2-巰基乙醇：終濃度50 uM1.細胞培養(yǎng)介紹.flv （一）基本操作 1. 無菌操作 防止微生物污染； 培養(yǎng)用一切物品、液體都無菌。 （37度預熱，或室溫平衡） 2. 操作區(qū)消毒 75%酒精擦拭（生物安全柜，進入操作區(qū)物品） 紫外消毒20-30 min 3.洗手和著裝 4. 實驗操作 動作穩(wěn)、準，幅度??； 物品擺放合理，工作有序，縮短暴露時間。 2.滅菌消毒.flv （二）細胞來源 1. 原代培養(yǎng) 從機體上取下細胞、組織或器官，讓它們在體外維持與生長。（實際中，傳10代以內的細胞用作原代培養(yǎng)細胞） 特點：表現(xiàn)來源組織或細胞特征。 （二）細胞來源 （1） 組織

11、塊培養(yǎng)法 從機體上取下組織，使其在體外維持與生長，細胞從組織塊邊緣向外長出，鋪滿培養(yǎng)瓶（皿），即可進行傳代。 特點：表現(xiàn)來源組織或細胞特征。 （二）細胞來源 （1） 組織塊培養(yǎng)法 基本過程： 無菌條件下，取組織，去掉組織表面血污 剪成小塊（0.5 1 mm3） 反復漂洗 （Hanks液和完全培養(yǎng)液） 接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)箱培養(yǎng) 長滿后傳代 （二）細胞來源 （2） 消化培養(yǎng)法 與組織塊培養(yǎng)法區(qū)別： A. 用酶制劑處理組織塊，除去細胞間質，使細胞分離，形成細胞懸液； B. 細胞生長方式多為單層。 優(yōu)點：更易攝取營養(yǎng)、排除代謝產物生長較快。 缺點：操作繁雜，易污染；消化可能對細胞有損傷。 （二）細胞來

12、源 2. 細胞系（cell line） 原代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（Finite Cell Line）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系（Infinite Cell Line）。無限細胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細胞，因此本質上已是發(fā)生轉化的細胞系。 l原代培養(yǎng)期l傳代期l衰退期（二）細胞來源 3.細胞株（cell strain） 從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細

13、胞群，亦可稱之為亞株（substrain）。 細胞庫： 美國菌種保藏中心（ATCC） / 中國典型培養(yǎng)物保藏中心中國典型培養(yǎng)物保藏中心 上海細胞庫上海細胞庫 各科研機構各科研機構 培養(yǎng)細胞的特性培養(yǎng)細胞的生長方式l貼附生長： 必須貼附于支持物表面才能生長。大多數(shù)細胞屬此型。失去在體內特有形態(tài)。成纖維細胞型、上皮細胞型、游走型、多形型。l懸浮生長： 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞。每代貼附生長細胞的生長過程l游離期l貼壁期l潛伏期l對數(shù)生長期l停止期（平臺期）l游離期：l 細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)也稱懸浮期。此時

14、細胞質回縮，胞體呈圓球形。l 10分鐘一4小時l貼壁期： 細胞附著于底物上，游離期 結束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。l 底物底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等l 血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。l進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質（化學合成的功能基團）l潛伏期l 此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為624小時。l對數(shù)生長期：l 細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。l停止期（平臺期）：l 細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂。l 機制：接觸

15、抑制、密度依賴性（三）細胞培養(yǎng)常規(guī)操作技術 1. 細胞傳代培養(yǎng) 細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。 貼壁細胞傳代操作流程： （1）棄去培養(yǎng)液。 （2）加入胰酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中。 （3）消化時間約為1 3分鐘。倒置鏡下觀察細胞。原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，細胞間出現(xiàn)空隙，細胞未漂起時棄去胰酶，同時用Hanks或培養(yǎng)液終止消化。 （4）制作細胞懸液，細胞計數(shù)（有經驗者可?。?/p>

16、，根據細胞數(shù)目和細胞生長特點，按1:2 1:6進行傳代，置37下繼續(xù)培養(yǎng)。 附：消化液配制方法： 稱取0.25克胰酶蛋白酶（活力為1：250），加入100ml無Ca 2+ 、Mg 2+ 的Hanks液（D-Hanks ）溶解，濾器過濾除菌，4保存，用前可在37下回溫。 可配成1%溶液， -20保存，用前稀釋成0.25%。 胰酶溶液中也可加入EDTA，使最終濃度達0.02。3.細胞傳代.flv 2. 細胞凍存 在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰

17、點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在130以下的低溫中能減少冰晶的形成。 目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。細胞凍存操作 （1）收集對數(shù)生長期細胞，細胞定量。 （2）加入保護液（10%DMSO），調整至410106/ml左右。 （3）將懸液分至凍存管中，每管1 ml。 （4）將凍存管口封嚴。 （5）貼上標簽，寫明細胞名稱、代數(shù)、凍存日期等。 （6）標準降溫速度： -1-2 /min； 溫度達到-25 時，-5-10 /min； 到-70 時，直接放入液氮。 細胞凍存操作 一般降溫順序：室溫4（20分鐘低

18、溫冰箱（20 30 min）超低溫冰箱（80 ）或直接放入液氮。 注意：操作時應小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，絕對不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用11.5月。 細胞凍存量很大時：可用細胞凍存儀。置80 冰箱過夜后，直接放入液氮保存。 凍存液配制： 培養(yǎng)基加入甘油或DMSO，使其終濃度達520%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4下保存。4.細胞凍存.flv 3. 細胞復蘇 細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的50，細胞仍能生長，活力受損不大。 3. 細胞復蘇 操作： （1）從液氮中取出凍存管、迅速置于37 溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融

19、化。 （2）打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中，加10ml培養(yǎng)液或Hanks液，1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。 （3）細胞沉淀加10ml培養(yǎng)液或Hanks液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。 （4）加適當培養(yǎng)基后將細胞轉移至培養(yǎng)瓶中，37培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。 解凍時務必注意安全，預防冷凍管爆裂。 細胞復蘇 高清.kux4. 細胞計數(shù)及活力測定 培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數(shù)。計數(shù)結果以每毫升細胞數(shù)表示。細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同。 在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分

20、離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。 （1） 細胞計數(shù) A. 將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。 B. 將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。 C. 靜置3分鐘。 D. 鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：l 細胞數(shù)/ml4大格細胞總數(shù)/ 4104 （1） 細胞計數(shù) 注意： 細胞要分散成單個細胞； 鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液； 對于壓線的細胞：只計算上線和左線。 （1） 細胞計數(shù) 另外：可以用細胞計數(shù)儀

21、。 （2） 細胞活力測定 A. MTT法 B. XTT法 C. CCK-8法 l5. 細胞增殖檢測 （1）MTT：化學名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。l缺點：由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對

22、實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。 （2）XTT法 XTT：化學名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylamino)carbonyl-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲瓚產物。當XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯(lián)合應用時，其所產生的水溶性的甲瓚產物的吸光度與活細胞的數(shù)量成正比。l優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復性優(yōu)于MTT。l缺點：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫

23、保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。 （3）CCK-8法或稱WST-8法lCCK-8試劑中含有WST8：化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。l （3）CCK-8法或稱WST-8法l

24、優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復性優(yōu)于MTT；5、對細胞毒性小；6、為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。l缺點：1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產生漏加或多加。 操作步驟： a. 96孔板細胞經過干預處理 b. MTT法：去掉培養(yǎng)液，加入80ul培養(yǎng)液+20ulMTT（0.5%） XTT法：直接加入XTT 50ul （0.1%XTT+1.5%硫酸甲醋吩嗦PMS：1ml：30ul） CCK-8：直接加入CCK-8

25、10ul c. MTT法：培養(yǎng)4 h，加入DMSO 150ul溶解結晶，酶標儀檢測。 XTT法：培養(yǎng)4 h，酶標儀檢測。 CCK-8：培養(yǎng)1-4 h，酶標儀檢測。 MTT法XTT法CCK-8法甲瓚物水溶性難溶性水溶性水溶性檢測波長490 nm450nm450nm性狀粉末2瓶溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用毋需預制使用有機溶劑DMSO或其它溶劑 方便性+檢測速度+重復性+穩(wěn)定性+工作量-對細胞毒性-對人體毒性-（4）BrdU法（5）實時監(jiān)測系統(tǒng) l6. 細胞周期分析 6. 細胞周期分析 細胞周期（cell cycle）是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，分為間期與

26、分裂期兩個階段。 G1期（first gap）從有絲分裂完成到DNA復制前的一段時期，又稱合成前期，此期主要合成RNA和核糖體。該期特點是物質代謝活躍，迅速合成RNA和蛋白質，細胞體積顯著增大。這一期的主要意義在于為下階段S期的DNA復制作好物質和能量的準備。 6. 細胞周期分析 G1期（first gap）細胞進入G1期后，并不是毫無例外地都進入下一期繼續(xù)增殖，在此時可能會出現(xiàn)三種不同前景的細胞：增殖細胞：這種細胞能及時從G1期進入S期，并保持旺盛的分裂能力。暫不增殖細胞或休止細胞（G0期）：這類細胞進入G1期后不立即轉入S期，在需要時，如損傷、手術等，才進入S期繼續(xù)增殖。不增殖細胞：此種細

27、胞進入G1期后，失去分裂能力，終身處于G1期，最后通過分化、衰老直至死亡。例如高度分化的神經細胞、肌細胞及成熟的紅細胞等。 6. 細胞周期分析 S期（synthesis）即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同時還要合成組蛋白。 G2期（second gap）期為DNA合成后期，是有絲分裂的準備期。在這一時期，DNA合成終止，大量合成RNA及蛋白質，包括微管蛋白和促成熟因子等。 分析方法： （1）顯微鏡下細胞形態(tài)分析； （2）BrdU法； （3）流式細胞術：明確各期細胞數(shù)及百分比。 7. 細胞凋亡分析 細胞凋亡是指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因基控制的細胞自主的有序的死亡。 形態(tài)學形態(tài)學觀察細胞

28、凋亡的變化是多階段的，細胞凋亡往往涉及單個細胞，即便是一小部分細胞也是非同步發(fā)生的。首先出現(xiàn)的是細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離，然后是細胞質密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細胞色素C到胞漿，核質濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180bp-200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結構仍然完整，最終可將凋亡細胞遺骸分割包裹為幾個凋亡小體，無內容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬。 7. 細胞凋亡分析 （1） 電鏡檢查：在電鏡下可見細胞膜表面凸出形成典型的凋亡小體，內含有正常形態(tài)的線粒體和其他細胞器。

29、細胞質高度濃縮。核染色質濃縮成月牙狀，同時形成一些核仁碎片，核膜凹陷使胞核裂開。 （2）DNA檢測：凋亡細胞的基因組DNA核小體之間連接的雙鏈DNA被切斷，從而產生180-200bp的多倍體DNA片段。應用瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)一典型的DNA梯形(DNA ladder)，與壞死細胞出現(xiàn)的DNA隨機降解帶型有明顯的區(qū)別。7. 細胞凋亡分析 （3）TdT介導的dUTP缺口標記分析法：細胞在凋亡時，其基因組DNA在核小體之間被切斷，產生許多3-OH末端。用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)將地高辛標記的dUTP摻入到DNA片段的3-OH末端，然后再加入經熒光標記的抗地高辛抗體，使其與地高辛特異結合，在熒光顯微鏡下，凋亡細胞呈現(xiàn)黃綠色熒光。 （4）應用流式細胞儀分析 8. 細胞培養(yǎng)過程中常見的問題 （1）培養(yǎng)液pH值快速偏離 ：CO2濃度異常，培養(yǎng)瓶蓋過緊 ；細菌、酵母或霉菌污染 。 （2）培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀 ：細菌或霉菌污染。 （3）細