第五章環(huán)境化學(xué)物的特殊毒性及其評(píng)價(jià)

1、 第五章第五章 環(huán)境化學(xué)物的特殊毒環(huán)境化學(xué)物的特殊毒性及其評(píng)價(jià)性及其評(píng)價(jià)第一節(jié)第一節(jié) 環(huán)境化學(xué)物的致突變性及其評(píng)價(jià)環(huán)境化學(xué)物的致突變性及其評(píng)價(jià)一、概述一、概述 物種的各個(gè)體和各代之間的種種變化稱為變異?？蛇z傳變異即稱為突變（mutation）。有自發(fā)的和誘發(fā)的。 相當(dāng)多的外來化學(xué)物能直接損傷DNA或產(chǎn)生其他遺傳學(xué)改變而使基因和染色體發(fā)生改變遺傳毒物或致突變物或誘變劑。二、突變的類型二、突變的類型突變的基礎(chǔ)是遺傳物質(zhì)的DNA改變，根據(jù)DNA改變牽涉的范圍大小，可以將遺傳損傷分為三類：基因突變、染色體突變和基因組突變。（一）基因突變 指在基因序列中DNA序列的改變，也叫點(diǎn)突變。 1、堿基置換 堿基

2、置換指DNA序列上的某個(gè)堿基被其他堿基取代。首先在DNA復(fù)制時(shí)會(huì)使互補(bǔ)鏈的相應(yīng)位點(diǎn)配上一個(gè)錯(cuò)誤的堿基，即發(fā)生錯(cuò)誤配對(duì)。這一錯(cuò)誤配上的堿基在下一次DNA復(fù)制時(shí)卻能按正常規(guī)律配對(duì)，于是一對(duì)錯(cuò)誤的堿基置換了原來的堿基對(duì)，亦即最終產(chǎn)生堿基對(duì)置換或簡稱堿基置換。 轉(zhuǎn)換（轉(zhuǎn)換（transition）：嘌呤與嘌呤堿基之間的置換，或嘧）：嘌呤與嘌呤堿基之間的置換，或嘧啶與嘧啶之間的置換。啶與嘧啶之間的置換。顛換（顛換（transversion）：嘌呤與嘧啶堿基之間的置換。）：嘌呤與嘧啶堿基之間的置換。 2、移碼 移碼是從mRNA到蛋白質(zhì)翻譯過程中遺傳密碼子讀碼順序的突變，通常是基因中增加或減少了一對(duì)或幾對(duì)不等

3、于3的倍數(shù)的堿基對(duì)所造成的突變。3、整碼突變 指在DNA中增加或減少的堿基對(duì)為一個(gè)或幾個(gè)密碼子。4、片斷突變 指基因中某些小片斷核苷酸序列發(fā)生改變。這種損傷有時(shí)可跨越兩個(gè)或數(shù)個(gè)基因。片斷突變包括缺失、重復(fù)、重組、重排。（二）染色體突變 也稱染色體畸變，是染色體或染色體單體受損而發(fā)生斷裂，且斷端不發(fā)生重接或雖重接卻不在原處。能使染色體或染色單體發(fā)生斷裂的物質(zhì)稱為斷裂劑，這種作用的發(fā)生及其過程稱為斷裂作用。斷裂作用的關(guān)鍵是誘發(fā)DNA鏈斷裂。（1）裂隙（gap） 在染色體上出現(xiàn)無染色質(zhì)的區(qū)域，但該區(qū)域兩端的染色體仍保持線狀連接者為裂隙。一般認(rèn)為裂隙屬于非染色質(zhì)損傷。裂隙不計(jì)入畸變范圍。（2）斷裂（b

4、reak） 指染色體上狹窄的非染色帶,無線狀連接者為斷裂。（3）斷片（fragment）和 缺失（deletion） 一個(gè)染色體發(fā)生一次或多次斷裂而不重接，并且這些已斷裂的節(jié)段遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開，常將無著絲粒斷片簡稱為斷片。 有著絲粒的部分稱為缺失，缺失有末端缺失和中間缺失。（4） 微小體（minute body） 中間缺失如斷片很小，小于染色單體寬度，呈圓點(diǎn)狀，稱為微小體。（5）無著絲粒環(huán)（acentric ring） 一條較長的無著絲粒斷片的兩端連接，就形成無著絲粒環(huán)。（6）環(huán)狀染色體（ring chromosome） 染色體兩臂各發(fā)生一次斷裂，其帶有著絲粒的節(jié)段的兩斷端連接形成一個(gè)環(huán)時(shí)，稱為環(huán)狀染

5、色體。（7）雙著絲粒染色體（dicentric chromosome） 兩條染色體斷裂后，兩個(gè)有著絲粒的節(jié)段重接形成。（8）倒位（inversion） 當(dāng)某一染色體發(fā)生兩次斷裂后，其中間節(jié)段倒轉(zhuǎn)180再重接，稱為倒位。臂間倒位：顛倒的是具有中間著絲粒的中間節(jié)段 臂內(nèi)倒位：顛倒的是長臂或短臂內(nèi)的一段（9）易位（translocation） 兩個(gè)非同源染色體斷裂后，從某個(gè)染色體斷下的節(jié)段接到另一染色體上稱為易位。 兩條染色體同時(shí)斷裂，相互交換斷片并重接相互易位 僅一個(gè)染色體節(jié)段連接到另一染色體上單方易位； 三個(gè)或三個(gè)以上染色體斷裂、重接復(fù)雜易位（10）插入（insertion）和重復(fù)（duplic

6、ation） 當(dāng)一個(gè)染色體發(fā)生三處斷裂，帶有兩斷端的斷片插入到另一臂的斷裂處或另一染色體的斷裂處重接起來，稱為插入。 如此時(shí)有缺失的染色體和有插入的染色體是同源染色體，且分別有一處斷裂發(fā)生于同一位點(diǎn)，則插入將使該染色體連續(xù)出現(xiàn)兩段完全相同的節(jié)段，此時(shí)稱為重復(fù)。（11）輻射體 染色體間的不平衡易位可形成三條臂構(gòu)型或四條臂構(gòu)型，分別稱為三輻射體和四輻射體。在多個(gè)染色體間的單體互換可形成復(fù)合射體。（三）基因組突變 指基因組中染色體數(shù)目的改變，也稱染色體數(shù)目畸變。1、非整倍體 指細(xì)胞丟失或增加一條或多條染色體。缺失一條染色體稱為單體，增加一條染色體稱為三體。2、整倍體 指染色體數(shù)目的異常是以染色體組為

7、單位的增減，如三倍體、四倍體。三、致突變作用機(jī)理三、致突變作用機(jī)理 外源化學(xué)物引起基因突變和染色體突變的靶部位主要是DNA，而導(dǎo)致染色體數(shù)目異常的靶部位主要是有絲分裂和減數(shù)分裂器，如紡錘絲。（一）（一）DNA損傷和突變損傷和突變1、堿基類似物的取代 有些化學(xué)物的結(jié)構(gòu)與堿基非常相似，稱堿基類似物。它們能可與天然堿基競爭，并取代其位置，而摻入到DNA分子中，引起劍姬配對(duì)特性的改變，引發(fā)突變。2、與DNA分子共價(jià)結(jié)合形成加合物 許多親電子性化學(xué)物可與DNA作用形成加合物（adduction）。不同誘變劑與DNA作用的堿基位置不同，可引起不同類型的突變。 烷化劑可提供甲基或乙基等烷基，與DNA發(fā)生共價(jià)

8、結(jié)合。對(duì)DNA和蛋白質(zhì)都有強(qiáng)烈烷化作用。各類烷化劑烷化活性有別，一般情況下甲基化乙基化高碳烷基化。3、改變或破壞堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)某些誘變劑可與堿基發(fā)生相互作用，使堿基發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)變化，引起錯(cuò)誤配對(duì)或引起DNA鏈斷裂。例如，亞硝酸根能使腺嘌呤和胞嘧啶發(fā)生氧化性脫氨，相應(yīng)變?yōu)榇吸S嘌呤和尿嘧啶。4、大分子嵌入DNA鏈 如吖啶類染料（吖啶橙），是一種平面型三環(huán)分子，結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤-嘧啶對(duì)十分相似，能嵌入兩個(gè)相鄰的DNA堿基對(duì)之間，造成移碼突變。(二二)非整倍體及整倍體的誘發(fā)非整倍體及整倍體的誘發(fā) 非整倍體畸變的原因：（1） 不分離：同源染色體在第一次減數(shù)分裂中不分離；姐妹染色體在第二次減數(shù)分裂或有絲分裂

9、中不分離。（2）染色體丟失 由于紡錘體形成不完全或著絲粒受損使得染色體在分離過程中沒有進(jìn)入任一個(gè)子細(xì)胞核中。 整倍體誘發(fā)的原因1、紡錘體受損，有絲分裂染色體組不分離，形成四倍體；2、減數(shù)分裂異常使配子形成二倍體，若二倍體的配子受精，可形成多倍體受精卵；3、一個(gè)卵子被多個(gè)精子受精，形成多倍體。（三）（三）DNA損傷的修復(fù)和突變損傷的修復(fù)和突變1、生物體、生物體DNA損失修復(fù)系統(tǒng)損失修復(fù)系統(tǒng)（1） 復(fù)制前的修復(fù)過程精確修復(fù)，包括直接修復(fù)和切除修復(fù)a、直接修復(fù)：包括光修復(fù)和O6甲基鳥嘌呤修復(fù)光修復(fù)：針對(duì)紫外線引起的嘧啶二聚體修復(fù)功能，修復(fù)的過程是通過在波長范圍為320370 mm的可見光中，二聚體可

10、直接恢復(fù)成原來的樣子。催化光復(fù)活反應(yīng)的酶叫做光裂合酶。O6-甲基鳥嘌呤修復(fù)：修復(fù)在O6位上含有烷基的鳥嘌呤，靠O6-甲基鳥漂吟-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶將O6-甲基鳥嘌呤的甲基轉(zhuǎn)移至該酶的半胱氨酸殘基上，而恢復(fù)鳥嘌呤正常的堿基配對(duì)特性，該酶在修復(fù)過程中被不可逆地失活。 b、切除修復(fù)(excixion-repair)由于這過程并不依賴于光的存在故又稱為暗修復(fù)（dark repair）。依據(jù)切除對(duì)象的不同，分為核苷酸切除修復(fù)（大段異常核苷酸）；堿基切除修復(fù)（個(gè)別異常堿基）；錯(cuò)配堿基修復(fù) 核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair)是所有生物體內(nèi)最常見的修復(fù)機(jī)制。它可修復(fù)幾乎所有

11、的DNA損傷類型，包括其他修復(fù)機(jī)制不能修復(fù)的加合物及DNA鏈間交聯(lián)等。 修復(fù)時(shí)，先靠內(nèi)切酶把DNA鏈從損傷兩端切斷；在解螺旋酶作用下，除去受損的寡核苷酸；再在修復(fù)多聚酶的作用下，以對(duì)應(yīng)的鏈為模板，以正確的堿基填補(bǔ)空隙；最后在DNA連接酶作用下連接，恢復(fù)原來的序列。堿基切除修復(fù)：abcde圖12-16 DNA堿基切除修復(fù) A：六邊型表示錯(cuò)誤的堿基：六邊型表示錯(cuò)誤的堿基 B：DNA糖基化酶切除錯(cuò)誤的堿基糖基化酶切除錯(cuò)誤的堿基 C：AP內(nèi)切核酸酶及內(nèi)切核酸酶及AP裂解酶切除裂解酶切除磷酸二酯鏈及糖基磷酸二酯鏈及糖基 D：DNA聚合酶填補(bǔ)單一核苷酸。聚合酶填補(bǔ)單一核苷酸。 E：DNA連接酶封閉連接酶封

12、閉 缺口缺口 錯(cuò)配堿基修復(fù)(mismatch base repair)是一種特殊的切除修復(fù)形式，通過該機(jī)制可去除不正確的堿基配對(duì)，如G：T和A：C。（2）復(fù)制后修復(fù) 這個(gè)系統(tǒng)是在DNA復(fù)制時(shí)模板鏈上含有損傷的堿基導(dǎo)致子鏈產(chǎn)生裂缺，這是在復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的，所此修復(fù)系統(tǒng)也屬于復(fù)制后修復(fù)。 復(fù)制時(shí)新合成的互補(bǔ)鏈相應(yīng)部位出現(xiàn)空隙，隨后以重組作用及鏈延長作用填補(bǔ)。通過此機(jī)制，使DNA合成得以通過損傷部位，避免了致死性的后果，但存在的DNA損傷并末移除，仍有待通過其他的修復(fù)機(jī)制而修復(fù)。 2. DNA損傷修復(fù)與突變損傷修復(fù)與突變 突變的產(chǎn)生不僅與DNA受損的情況有關(guān)，DNA損傷修復(fù)也是決定突變發(fā)生與否的重要因素

13、。DNA損傷修復(fù)功能的缺失或修復(fù)能力降低都會(huì)使突變的發(fā)生明顯增加。 不同生物損傷修復(fù)功能的類型及能力有所不同，如人類的修復(fù)能力比小鼠大10倍左右。在使用元原核生物及動(dòng)物進(jìn)行致突變?cè)囼?yàn)，并用其結(jié)果外推到人時(shí)，要考慮到DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)的差別。 DNA損傷修復(fù)過程涉及許多酶的參與。同代謝酶的多態(tài)性一樣，DNA損傷修復(fù)酶也有多態(tài)性，即其基因型或表型存在個(gè)體差異。DNA損傷修復(fù)酶的多態(tài)性在一定程度上影響著個(gè)體對(duì)遺傳毒性因素的易感性。四、突變的不良后果四、突變的不良后果 突變的靶細(xì)胞有體細(xì)胞和生殖細(xì)胞（一）體細(xì)胞突變的后果1、癌變2、畸變：胚胎體細(xì)胞突變，造成畸胎3、其他不良后果：動(dòng)脈粥樣硬化、衰老。（

14、二）生殖細(xì)胞突變的后果1、致死性2、可遺傳的改變：顯性遺傳病、隱性遺傳病五、致突變作用的評(píng)價(jià)五、致突變作用的評(píng)價(jià)（一）致突變?cè)囼?yàn)的分類（一）致突變?cè)囼?yàn)的分類 目前有200多種，重要的和常規(guī)使用的大約20多種。依據(jù)檢測的遺傳學(xué)終點(diǎn)的不同，可分為四類：基因突變?cè)囼?yàn)、染色體損傷試驗(yàn)、非整倍體試驗(yàn)和其他反映DNA損傷的試驗(yàn)。（二）常用的致突變?cè)囼?yàn)（二）常用的致突變?cè)囼?yàn)1、細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn) 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)是以營養(yǎng)缺陷的突變體菌株為試驗(yàn)系統(tǒng)，觀察受試物引起其回復(fù)突變的作用。 常用的菌株： 色氨酸營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌大腸桿菌回復(fù)試驗(yàn) 組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌Ames實(shí)驗(yàn)原理： Ames試驗(yàn)，檢測受試

15、物誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株(his-)回復(fù)突變成野生型(his+)的能力。試驗(yàn)菌株都有組氨酸突變(his-)，不能自行合成組氨酸，在不含組氨酸的最低營養(yǎng)平皿上不能生長，回復(fù)突變成野生型后能自行合成組氨酸，可在最低營養(yǎng)平皿上生長成可見菌落。計(jì)數(shù)最低營養(yǎng)平皿上的回變菌落數(shù)來判定受試物是否有致突變性。 2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)是利用嚙齒類和人體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因正向突變?cè)囼?yàn)。 常用細(xì)胞株常用細(xì)胞株 選用的基因選用的基因 小鼠淋巴瘤細(xì)胞小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y TK、HPRT 中國倉鼠卵巢組織細(xì)胞中國倉鼠卵巢組織細(xì)胞CHO HPRT 中國倉鼠肺組織細(xì)胞中

16、國倉鼠肺組織細(xì)胞V79 HPRT 人淋巴細(xì)胞人淋巴細(xì)胞 HPRT（1）tk基因 位于常染色體上，編碼胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脫氧核苷ATP 胸苷酸。存在嘧啶類似物5溴脫氧尿苷時(shí)，產(chǎn)生異常核苷酸使細(xì)胞死亡。受試物存在時(shí)若細(xì)胞不死亡說明TK發(fā)生突變。（2）hprt基因 位于X染色體上，編碼次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶：催化次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖焦磷酸 核苷-5-單磷酸（NMP）。如存在堿基類似物，生成相應(yīng)的NMP，摻入到DNA中可致死。加入受試物后能存活的細(xì)胞表示發(fā)生基因突變。3、染色體畸變?cè)囼?yàn) 制備細(xì)胞分裂中期相染色體標(biāo)本，在光鏡下可直接觀察染色體的數(shù)目和形態(tài)的改變。染色體畸變?cè)囼?yàn)也常稱為細(xì)胞遺傳

17、學(xué)試驗(yàn)(cytogenetic assay)。染色體畸變?cè)囼?yàn)可為體外試驗(yàn)，也可為體內(nèi)試驗(yàn)，包括對(duì)體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的分析。 結(jié)構(gòu)畸變：可觀察到裂隙、斷裂、斷片、微小體、環(huán)狀染色體、雙或多著絲粒染色體和射體。 數(shù)目畸變：需在染毒后經(jīng)過一次有絲分裂才能發(fā)現(xiàn)。但是經(jīng)過一次有絲分裂后，一些結(jié)構(gòu)畸變可能因遺傳物質(zhì)的丟失而致細(xì)胞死亡，因此不能發(fā)現(xiàn)。所以應(yīng)安排多次收獲時(shí)間，以便分別檢查斷裂劑的作用。體內(nèi)試驗(yàn)：多觀察骨髓細(xì)胞，其分裂旺盛、易于獲得和制備，優(yōu)勢在于可體現(xiàn)哺乳動(dòng)物的代謝過程、DNA修復(fù)和藥物動(dòng)力學(xué)特征。但應(yīng)注意受試物或其活性代謝產(chǎn)物有可能不易在骨髓中達(dá)到足夠的濃度。體外試驗(yàn)：常用中國倉鼠肺細(xì)胞(CH

18、L)，以及中國倉鼠卵細(xì)胞(CHO)和V79等細(xì)胞系，但任何細(xì)胞系的染色體皆不穩(wěn)定，不能準(zhǔn)確地觀察非整倍體，故在體外試驗(yàn)中，如考慮進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，應(yīng)當(dāng)使用原代或早代細(xì)胞 4、微核試驗(yàn) 微核是染色體的斷片或遲滯的染色體在細(xì)胞分裂后期，由于不能進(jìn)入子細(xì)胞的核中而在間期的子細(xì)胞胞漿內(nèi)形成的游離團(tuán)塊物質(zhì)，它與細(xì)胞主核著色一致，圓形或橢圓形。常用嚙齒類動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞(PCE)或外周血細(xì)胞進(jìn)行微核試驗(yàn)。PCE是紅細(xì)胞成熟的一個(gè)階段，此時(shí)紅細(xì)胞的主核已排出，微核容易辯認(rèn)，PCE胞質(zhì)含RNA染色與成熟紅細(xì)胞易于區(qū)別，故為骨髓微核試驗(yàn)的首選細(xì)胞群。一般采用多次染毒后24h采樣。5. 顯性致死試驗(yàn)(dom

19、inant lethal assay) 顯性致死(dominant lethal)指發(fā)育中的精子或卵子細(xì)胞發(fā)生遺傳學(xué)損傷，導(dǎo)致受精卵或發(fā)育中的胚胎死亡。一般認(rèn)為顯性致死主要是由于染色體損傷的結(jié)果。顯性致死試驗(yàn)以胚胎死亡為觀察終點(diǎn)，用于檢測受試物對(duì)動(dòng)物性細(xì)胞的染色體損傷作用。 一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接觸受試物，然后使之與未染毒的雌性交配，觀察胚胎死亡情況。計(jì)算出受孕率、總著床數(shù)、早期和晚期胚胎死亡率予以評(píng)價(jià)。 6、小鼠精子畸形試驗(yàn) 精子畸形指精子形態(tài)發(fā)生異常改變?？蓪?dǎo)致生育能力的改變。用于檢測外源化學(xué)物對(duì)精子生成和發(fā)育的影響，也可用于評(píng)價(jià)化學(xué)物對(duì)生殖細(xì)胞的致突變作用。 常用68周的小鼠，

20、連續(xù)5天染毒。在染毒后不同時(shí)間（1、4、10周）處死，取樣檢查精子形態(tài)。7 、 程 序 外 D N A 合 成 試 驗(yàn)(unscheduled DNA synthesis test，UDS) 正常細(xì)胞在有絲分裂過程中，僅在S期進(jìn)行DNA復(fù)制合成。 當(dāng)DNA受損后，DNA的修復(fù)合成可發(fā)生在正常復(fù)制合成期(S期)以外的其他時(shí)期，稱為程序外DNA合成。用同步培養(yǎng)將細(xì)胞阻斷于Gl期，并將正常的DNA半保留復(fù)制阻斷，然后用受試物處理細(xì)胞，并在加有3H-胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。利用放射自顯影法或液閃計(jì)數(shù)法測定摻入DNA的放射活性，檢測DNA修復(fù)合成，從而間接反映DNA的損傷程度。 8、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物致

21、突變?cè)囼?yàn) 近年來建立的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物致突變檢測模型為研究哺乳動(dòng)物體內(nèi)基因突變提供了有效的手段，可以在動(dòng)物個(gè)體水平研究突變的器官、組織特異性，包括生殖細(xì)胞。并可比較容易地從動(dòng)物基因組中重新回收導(dǎo)入的基因，進(jìn)行序列分析。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物指基因組中整合有用實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的DNA(可以是完整的基因，也可是不完整的DNA片段)，并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。 在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物致突變?cè)囼?yàn)時(shí)，在染毒后先抽提不同器官或組織的基因組DNA，然后把純化的基因組DNA與噬菌體體外包裝抽提物混合，而將導(dǎo)入的基因載體包裝進(jìn)噬菌體中，用這些噬菌體感染大腸菌，可形成噬菌斑，通過噬菌斑顏色變化進(jìn)行突變的判斷并獲得突變子。 （三）致突變?cè)囼?yàn)

22、在預(yù)測致癌性及遺傳危害性中的價(jià)值（三）致突變?cè)囼?yàn)在預(yù)測致癌性及遺傳危害性中的價(jià)值 致突變?cè)囼?yàn)的主要目的是研究外源化學(xué)物引起人類生殖細(xì)胞的突變并傳遞給后代的可能性；另外基于體細(xì)胞突變與腫瘤有關(guān)的認(rèn)識(shí)，也可用于外源化學(xué)物潛在致癌性的預(yù)測。 雖然致突變?cè)囼?yàn)可用于外源化學(xué)物致癌性的篩選，但也存在不足。在致癌性預(yù)測時(shí)致突變?cè)囼?yàn)適用于遺傳毒性致癌物和非遺傳毒性非致癌物。對(duì)于遺傳毒性非致癌物會(huì)出現(xiàn)假陽性，對(duì)于非遺傳毒性致癌物則會(huì)出現(xiàn)假陰性。預(yù)測遺傳學(xué)危害也即預(yù)測對(duì)哺乳動(dòng)物性細(xì)胞的致突變性。哺乳動(dòng)物性細(xì)胞致突變物的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)試驗(yàn)需較大的動(dòng)物數(shù)量，且費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢，不可能廣泛使用?？衫枚唐谥峦蛔?cè)囼?yàn)對(duì)哺乳動(dòng)物性細(xì)胞

23、致突變性及遺傳危害性進(jìn)行預(yù)測。 生殖細(xì)胞的致突變?cè)囼?yàn)在預(yù)測遺傳危害性中具有重要的意義。但一般認(rèn)為，體細(xì)胞致突變?cè)囼?yàn)陰性的化學(xué)物，在生殖細(xì)胞試驗(yàn)中一般也為陰性。所以，一般都是先進(jìn)行體細(xì)胞的誘變性檢測，發(fā)現(xiàn)部分試驗(yàn)結(jié)果陽性或有生殖細(xì)胞接觸證據(jù)時(shí)，再進(jìn)行生殖細(xì)胞的誘變性檢測。 哺乳動(dòng)物性細(xì)胞致突變性與對(duì)人的遺傳危害性之間還缺乏直接相關(guān)的證據(jù)。為評(píng)價(jià)外源化學(xué)物對(duì)人類的遺傳危害性，遺傳流行病學(xué)研究是最直接、最可靠的方法，但難度很大。 目前，評(píng)價(jià)遺傳危害主要還是依據(jù)致突變?cè)囼?yàn)的結(jié)果，特別是體內(nèi)生殖細(xì)胞的致突變?cè)囼?yàn)結(jié)果。如果一種化學(xué)物在多項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)中證明有致突變性，一般也假定其對(duì)人也可能具有遺傳危害性。第

24、二節(jié)第二節(jié) 環(huán)境化學(xué)物的致癌作用及其評(píng)價(jià)環(huán)境化學(xué)物的致癌作用及其評(píng)價(jià)一、環(huán)境致癌與化學(xué)致癌一、環(huán)境致癌與化學(xué)致癌 癌癥的發(fā)生8090由環(huán)境因素引起，包括物理因素、生物因素和化學(xué)因素。其中主要是化學(xué)因素。在環(huán)境因素引起的腫瘤中，80以上由化學(xué)因素引起。 化學(xué)致癌(chemical carcinogenesis)是指化學(xué)物質(zhì)引起正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并發(fā)展成腫瘤的過程，具有這種作用的化學(xué)物質(zhì)稱為化學(xué)致癌物(chemical carcinogen)。在此，“癌”的含義包括上皮的惡性變(癌)，也包括間質(zhì)的惡性變(肉瘤)及良性腫瘤。癌細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)：1、持續(xù)性增殖，分化不良，體外培養(yǎng)無接觸性抑制接觸性抑

25、制。永生性。2、浸潤性生長：可侵入其他組織，并發(fā)生轉(zhuǎn)移3、過分旺盛地合成核酸和氨基酸4、強(qiáng)烈的有氧酵解：在供氧充分時(shí)，仍能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，大量的乳酸使pH下降，影響細(xì)胞酶活力，破壞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。5、可將上述特征遺傳給子代細(xì)胞二、化學(xué)致癌的機(jī)制二、化學(xué)致癌的機(jī)制 尚未徹底闡明，大體可分為遺傳機(jī)制學(xué)說和非遺傳機(jī)制學(xué)說。（一）化學(xué)致癌的遺傳機(jī)制學(xué)說 該學(xué)說認(rèn)為，化學(xué)致癌物進(jìn)入細(xì)胞后作用于遺傳物質(zhì)，通過引起細(xì)胞基因的改變而發(fā)揮致癌作用。有關(guān)學(xué)說最主要的是多階段學(xué)說和癌基因?qū)W說。1、化學(xué)致癌的多階段學(xué)說 包括引發(fā)、促長和進(jìn)展三個(gè)階段。（1）引發(fā)階段：化學(xué)致癌的第一階段，是化學(xué)致癌物本身或其活性代謝物

26、作用于DNA，誘發(fā)體細(xì)胞突變的過程，可能涉及原癌基因的活化和腫瘤抑制基因的失活。 具有引發(fā)作用的化學(xué)物稱為引發(fā)劑。引發(fā)劑本身有致癌性，大多數(shù)是致突變物，沒有可檢測的閾劑量，引發(fā)作用是不可逆的并且是累積性的。但并非所有的引發(fā)細(xì)胞都將構(gòu)成腫瘤，因其中大多數(shù)將經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡(凋亡)。引發(fā)細(xì)胞不具有生長自主性，因此不是腫瘤細(xì)胞。（2）促長階段：促長階段是引發(fā)細(xì)胞增殖成為癌前病變或良性腫瘤的過程。促長劑單獨(dú)使用不具致癌性，必須在引發(fā)劑后使用才發(fā)揮促長作用。促長劑通常是非致突變物，影響引發(fā)細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致局部增殖并引起良性局灶性病理損害如乳頭瘤、結(jié)節(jié)或息肉。這些病損很多會(huì)消退，僅少數(shù)細(xì)胞發(fā)生進(jìn)一步突變

27、引成惡性腫瘤。 特點(diǎn)： 歷時(shí)較長，早期有可逆性，晚期為不可逆的 對(duì)生理因素調(diào)節(jié)的敏感性，衰老、飲食和激素可影響促長作用。（3）進(jìn)展階段：進(jìn)展階段是從引發(fā)細(xì)胞群(癌前病變、良性腫瘤)轉(zhuǎn)變成惡性腫瘤的過程。在進(jìn)展期腫瘤獲得生長加快、侵襲、轉(zhuǎn)移和抗藥性等特征。這些特征是由于在進(jìn)展階段的核型不穩(wěn)定性。腫瘤的染色體發(fā)生斷裂、斷片易位和非整倍體。 使細(xì)胞由促長階段進(jìn)入進(jìn)展階段的化學(xué)物稱為進(jìn)展劑(progressor)。進(jìn)展劑可引起染色體畸變，但不一定具有引發(fā)活性。引發(fā)、促長及進(jìn)展都可自發(fā)發(fā)生。有些化學(xué)致癌物可同時(shí)具引發(fā)、促長及進(jìn)展都可自發(fā)發(fā)生。有些化學(xué)致癌物可同時(shí)具有引發(fā)、促長及進(jìn)展的作用，稱為有引發(fā)、促

28、長及進(jìn)展的作用，稱為完全致癌物完全致癌物。 化學(xué)致癌是長期的、復(fù)雜的多階段過程，至少涉及引發(fā)、促長和進(jìn)展三個(gè)階段。在引發(fā)階段主要是細(xì)胞原癌基因和腫瘤抑制基因的突變?cè)诖匍L階段主要是遺傳外機(jī)制在進(jìn)展階段主要是核型不穩(wěn)定性正常細(xì)胞經(jīng)過遺傳學(xué)改變的積累才能轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞。2、化學(xué)致癌的癌基因?qū)W說 調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的基因發(fā)生異常，可導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)增殖，不能及時(shí)分化和凋亡，形成腫瘤。與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因主要有癌基因和腫瘤抑制基因。癌基因：能引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及癌變的基因。通常以原癌基因的形式存在正常動(dòng)物細(xì)胞的基因組中。原癌基因：最早在1968年Duesberg發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒致癌是由于攜帶能致癌的基因

29、片段，稱為病毒癌基因（Vonc），后來發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞中也存在與病毒癌基因高度相似的DNA序列，稱為原癌基因（C-onc）。正常細(xì)胞中的原癌基因表達(dá)并不引起惡性病變，其表達(dá)受到嚴(yán)格控制，通常與機(jī)體的生長和發(fā)育有關(guān)。原癌基因必須經(jīng)過激活才能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。原癌基因是一種顯性基因，當(dāng)其兩個(gè)等位基因之一發(fā)生突變，即可被激活。 腫瘤抑制基因：即抗癌基因?？拱┗蚩赡苁蔷幋a抑制生殖、促進(jìn)分化的基因，也可能是某些基因的負(fù)控制調(diào)節(jié)基因，并是維持基因組織定性的某些基因?？拱┗蚩梢种颇[瘤細(xì)胞的腫瘤性狀的表達(dá)，只有當(dāng)自己不能表達(dá)或其基因產(chǎn)物去活化才容許腫瘤性狀的表達(dá)。染色體缺失而誘發(fā)腫瘤的基因都可能是腫瘤抑制

30、基因。屬隱形基因，必須一對(duì)等位基因丟失或突變后失活，才能對(duì)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化起作用。（二）化學(xué)致癌的非遺傳機(jī)制學(xué)說 一部分致癌物用目前的致突變?cè)囼?yàn)不能檢出其致突變性。這些非遺傳毒性致癌物促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖的機(jī)制多種多樣： 具有細(xì)胞毒性的致癌劑可引起細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞釋放出的物質(zhì)具有刺激細(xì)胞分裂增殖的作用 激素失調(diào)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，與通過細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的受體刺激細(xì)胞分裂有關(guān) 免疫抑制劑可降低機(jī)體對(duì)癌前細(xì)胞的監(jiān)視和清除能力三、環(huán)境化學(xué)致癌物的分類三、環(huán)境化學(xué)致癌物的分類（一）按致癌作用機(jī)制分類 可分為遺傳毒性致癌物和非遺傳毒性致癌物兩類。1、遺傳毒性致癌物（1）直接致癌物：不需代謝活化直接與親核分子共價(jià)結(jié)合形成

31、加合物。這類化合物為親電子劑，大多數(shù)為合成有機(jī)物。 （2）間接致癌物： 多數(shù)有機(jī)致癌物需代謝活化才具有致癌活性，稱為間接致癌物。間接致癌物的原型稱為前致癌物。前致癌物經(jīng)代謝活化形成的之間代謝產(chǎn)物近致癌物（半致癌物），有一定致癌作用但必須再一次激活終致癌物（前致癌物經(jīng)代謝活動(dòng)形成的具有致癌作用的代謝物和不需代謝活化的致癌物）。（3）無機(jī)致癌物 放射性元素和重金屬。有些可能是親電子劑，但有些是通過選擇性改變DNA復(fù)制保真性，導(dǎo)致DNA的改變，如金屬鎳、鉻。2. 非遺傳毒性致癌物(non-genotoxic carcinogens) 非遺傳毒性致癌物不與DNA反應(yīng)，可能間接地影響DNA并改變基因組導(dǎo)

32、致細(xì)胞癌變，或者通過促長作用、增強(qiáng)作用導(dǎo)致癌的發(fā)展。 （1）促長劑：本身無致癌性，在給以遺傳毒性致癌物之后再給以促長劑可增強(qiáng)遺傳毒性致癌物的致癌作用，也可促進(jìn)“自發(fā)性”轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)展成癌。 （2）激素調(diào)控劑：主要改變內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡及細(xì)胞正常分化，常起促長劑作用。 （3）細(xì)胞毒劑：可能引起細(xì)胞死亡，導(dǎo)致細(xì)胞增殖活躍及癌發(fā)展。 （4）過氧化物酶體增殖劑：過氧化物酶體增殖可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧自由基過量生成。 （5） 免疫抑制劑：主要對(duì)病毒誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化起增強(qiáng)作用。 （6） 固態(tài)物質(zhì)：物理狀態(tài)是關(guān)鍵性因素，可能涉及細(xì)胞毒性。如塑料、石棉等。 （7）助癌物：本身無致癌性，在致癌物之前或同時(shí)應(yīng)用助癌物可顯著增加癌

33、癥的發(fā)生。 助癌作用的機(jī)制可涉及增加致癌物的吸收、增加活化的致癌物的比例、耗盡內(nèi)源性結(jié)合反應(yīng)底物、抑制DNA修復(fù)、促進(jìn)DNA損傷固定為突變等。四、環(huán)境化學(xué)物致癌物的評(píng)價(jià)四、環(huán)境化學(xué)物致癌物的評(píng)價(jià)(一) 哺乳動(dòng)物致癌試驗(yàn) 哺乳動(dòng)物致癌試驗(yàn)是鑒定化學(xué)致癌物的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)試驗(yàn)。哺乳動(dòng)物致癌試驗(yàn)用來確定受試物對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的致癌性、劑量反應(yīng)關(guān)系及誘發(fā)腫瘤的靶器官。1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種和品系：要求用兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，常規(guī)選用大鼠和小鼠，也可用倉鼠。在選擇品系時(shí)應(yīng)選擇較敏感、自發(fā)腫瘤率低、生活力強(qiáng)及壽命較長的品系。性別：應(yīng)使用同等數(shù)量的雌雄兩種性別的動(dòng)物。年齡：使用剛離乳的動(dòng)物，以保證有足夠長的染毒和發(fā)生癌癥的時(shí)間，而且

34、幼年動(dòng)物解毒酶及免疫系統(tǒng)尚未完善，對(duì)致癌作用比較敏感。2、劑量設(shè)置 致癌試驗(yàn)一般設(shè)三個(gè)試驗(yàn)組。高劑量組：最大耐受劑量(MTD)是由90天毒性試驗(yàn)來確定的，此劑量應(yīng)使動(dòng)物體重減輕不超過對(duì)照組的10，并且不引起死亡及導(dǎo)致縮短壽命的中毒癥狀或病理損傷。低劑量組：一般不低于高劑量的10。應(yīng)不影響動(dòng)物的正常生長、發(fā)育和壽命，即不產(chǎn)生任何毒性效應(yīng)。中劑量組：介于高、低劑量之間，如有可能按受試物的毒物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)來確定。 對(duì)照組除不給受試物外，其他條件均與試驗(yàn)組相同。 同時(shí)應(yīng)設(shè)陰性(溶劑或賦形劑)對(duì)照組。必要時(shí)可設(shè)陽性對(duì)照組，陽性致癌物最好與受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相近。3、染毒途徑 盡可能模擬人體可能的暴露途徑，主

35、要途徑有經(jīng)口、經(jīng)皮和吸入三種，應(yīng)根據(jù)受試物的理化性質(zhì)和接觸方式選擇確定。4、試驗(yàn)期限 一般情況下，試驗(yàn)期限小鼠和倉鼠應(yīng)為18個(gè)月，大鼠為24個(gè)月；然而對(duì)于某些生命期較長或自發(fā)腫瘤率低的動(dòng)物品系，小鼠和倉鼠可持續(xù)24個(gè)月，大鼠可持續(xù)30個(gè)月。5、觀察指標(biāo)（1）一般觀察：每天觀察受試動(dòng)物一次，主要觀察其外表、活動(dòng)、攝食情況等。在實(shí)驗(yàn)最初三個(gè)月每周稱體重一次，以后每兩周稱體重一次。經(jīng)飼料或飲水給以受試物時(shí)，應(yīng)記錄食物消耗量或飲水量，以計(jì)算受試物的攝人量。觀察時(shí)要注意有無腫瘤出現(xiàn)、腫瘤出現(xiàn)時(shí)間及死亡時(shí)間。（2）腫瘤發(fā)生情況：記錄肉眼可見或可觸及腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間、部位、大小、外形、發(fā)展?fàn)顩r并記錄動(dòng)物死亡時(shí)

36、間。（3）病理檢查：動(dòng)物自然死亡或處死后必須及時(shí)進(jìn)行病理檢查，包括肉眼和組織切片檢查。6、結(jié)果分析主要分析指標(biāo)有腫瘤發(fā)生率、腫瘤潛伏期及腫瘤多發(fā)性。腫瘤發(fā)生率()=(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)患腫瘤動(dòng)物總數(shù)有效動(dòng)物總數(shù))100式中，有效動(dòng)物總數(shù)指最早發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)存活動(dòng)物總數(shù)。腫瘤潛伏期即從攝入受試物起到發(fā)現(xiàn)腫瘤的時(shí)間，因?yàn)閮?nèi)臟腫瘤不易覺察，通常將腫瘤引起該動(dòng)物死亡的時(shí)間定為發(fā)生腫瘤的時(shí)間。腫瘤多發(fā)性指一個(gè)動(dòng)物出現(xiàn)多個(gè)器官的腫瘤或一個(gè)器官出現(xiàn)多個(gè)腫瘤。 致癌試驗(yàn)陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)為WHO提出的標(biāo)準(zhǔn)。WHO(1969)提出機(jī)體可以對(duì)致癌物有下列一種或多種反應(yīng)： (1) 對(duì)于對(duì)照組也出現(xiàn)的一種或數(shù)種腫瘤，試驗(yàn)組腫瘤發(fā)生率

37、增加； (2) 試驗(yàn)組發(fā)生對(duì)照組沒有的腫瘤類型； (3) 試驗(yàn)組腫瘤發(fā)生早于對(duì)照組； (4) 與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組每個(gè)動(dòng)物的平均腫瘤數(shù)增加。 在進(jìn)行試驗(yàn)的兩個(gè)物種兩種性別動(dòng)物中，有一種結(jié)果為陽性，即認(rèn)為該受試物有致癌性。兩個(gè)物種兩種性別動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果均為陰性時(shí)，方能認(rèn)為未觀察到致癌作用。 （二）致突變?cè)囼?yàn)用于致癌物篩選 預(yù)測致癌性的理想致突變?cè)囼?yàn)應(yīng)能靈敏地預(yù)測出受試物的致癌性，也能特異地預(yù)測出受試物的非致癌性，即要有高的靈敏性和特異性。 靈敏性指受試物在致突變?cè)囼?yàn)中的陽性比例。 特異性指受試物在致突變?cè)囼?yàn)中的陰性比例。用于致癌物篩選的短期試驗(yàn)如下：基因突變?cè)囼?yàn)：鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ame

38、s試驗(yàn))，培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞TK或HPRT正向突變?cè)囼?yàn)；染色體畸變?cè)囼?yàn)：體外細(xì)胞系細(xì)胞遺傳學(xué)分析，小鼠骨髓微核試驗(yàn)，大鼠骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)；原發(fā)性DNA損傷：DNA加合物，鏈斷裂，DNA修復(fù)誘導(dǎo)(細(xì)菌SOS反應(yīng)，大鼠肝UDS誘導(dǎo))，SCE試驗(yàn)；體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化：敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞，Balbc 3T3細(xì)胞。（三）細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 是短期試驗(yàn)中的一類重要方法。將受試物在體外與動(dòng)物細(xì)胞株接觸，若受試物具有致癌作用，則正常細(xì)胞的形態(tài)、功能發(fā)生變化與癌細(xì)胞類似，此種現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)化或惡性轉(zhuǎn)化。通過增殖，這些表型變異細(xì)胞形成與正常細(xì)胞不同的集落，即轉(zhuǎn)化集落。利用這些集落的存在、形成率以及將轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種于裸鼠中發(fā)生腫

39、瘤的情況來評(píng)價(jià)化學(xué)物的致癌活性。 該方法操作快速，理論上可靠。試驗(yàn)證明，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化與Ames試驗(yàn)配套使用，可檢出9899的致癌物。而且試驗(yàn)周期短，簡便經(jīng)濟(jì)，易于觀察，靈敏度高，受試物直接作用于靶細(xì)胞，便于劑量控制，免受整體動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)和生物轉(zhuǎn)化、生物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。 但惡性轉(zhuǎn)化大多數(shù)屬形態(tài)轉(zhuǎn)化或惡性前期轉(zhuǎn)化，這種轉(zhuǎn)化可發(fā)展為真正的惡性病變，也可能到此為止，并一定形成腫瘤。因此陽性結(jié)果只提示受試物具有致癌的可能性。 （四）哺乳動(dòng)物短期致癌試驗(yàn) 哺乳動(dòng)物短期致癌試驗(yàn)又稱為有限體內(nèi)試驗(yàn)，指時(shí)間有限(數(shù)月)，靶器官有限。較受重視的短期致癌試驗(yàn)有下列四種：小鼠皮膚腫瘤誘發(fā)試驗(yàn)、小鼠肺瘤誘發(fā)試驗(yàn)、大鼠肝

40、轉(zhuǎn)化灶誘發(fā)試驗(yàn)、雌性大鼠乳腺癌誘發(fā)試驗(yàn)。 （五）人群流行病學(xué)研究 流行病學(xué)調(diào)查是獲得環(huán)境化學(xué)物對(duì)人類致癌性的最可靠證據(jù)的主要手段，經(jīng)驗(yàn)證明大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)的致癌物是依據(jù)職業(yè)性接觸人群的流行病學(xué)調(diào)查而肯定的。 調(diào)查應(yīng)該包括前瞻性和回顧性調(diào)查。重點(diǎn)調(diào)查各種腫瘤發(fā)生率、死亡率、潛伏期、劑量效應(yīng)關(guān)系以及接觸劑量與腫瘤發(fā)病率和死亡率的關(guān)系。（六）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物致癌檢測模型動(dòng)物致癌試驗(yàn)耗時(shí)長，耗費(fèi)人力物力大，使用的染毒劑量大。轉(zhuǎn)基因底物為快速檢測致癌物和促癌物提供了新的重要途徑。轉(zhuǎn)基因小鼠可用于研究在致癌過程中特定基因的作用，可用于分析化學(xué)物-基因的相互作用。2、腫瘤抑制基因敲除小鼠 將一段DNA整合到腫瘤抑制

41、基因中，使該基因不能表達(dá)具有正常功能的蛋白質(zhì)。過量表達(dá)癌基因的轉(zhuǎn)基因小鼠 這類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是研究化學(xué)物致癌作用的敏感體系。攜帶癌基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于致癌試驗(yàn)，試驗(yàn)周期僅3個(gè)月左右，有希望發(fā)展成代替長期動(dòng)物致癌試驗(yàn)的試驗(yàn)系統(tǒng)。 （七）結(jié)構(gòu)與生物活性關(guān)系分析典型的例子是根據(jù)分子軌道法提出的多環(huán)芳烴致癌的K區(qū)理論和灣區(qū)理論的等。如果在定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)化學(xué)物具有某些可引起腫瘤的特殊結(jié)構(gòu)，應(yīng)考慮進(jìn)一步的相關(guān)試驗(yàn)，或不將其應(yīng)用于藥品及工業(yè)生產(chǎn)中。第三節(jié)第三節(jié) 環(huán)境化學(xué)物的生殖發(fā)育毒性環(huán)境化學(xué)物的生殖發(fā)育毒性 及其評(píng)價(jià)及其評(píng)價(jià) 生殖發(fā)育過程即繁殖過程，包括：生殖細(xì)胞發(fā)生 卵細(xì)胞受精 著床 胚胎形

42、成 胚胎發(fā)育 器官發(fā)生 胎仔發(fā)育 分娩和哺乳 生殖毒性：對(duì)生殖細(xì)胞、卵細(xì)胞受精、胚胎形成、妊娠、生殖毒性：對(duì)生殖細(xì)胞、卵細(xì)胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳的損害作用。分娩和哺乳的損害作用。發(fā)育毒性：對(duì)胚胎發(fā)育、胎仔發(fā)育及出生幼子發(fā)育的損害發(fā)育毒性：對(duì)胚胎發(fā)育、胎仔發(fā)育及出生幼子發(fā)育的損害作用。作用。一、生殖毒性及評(píng)價(jià)（一）對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的毒害作用 包括對(duì)睪丸生精細(xì)胞的影響、對(duì)內(nèi)分泌功能的影響、對(duì)性功能和生殖功能的影響。 精子的生成有賴于下丘腦-垂體-睪丸軸的調(diào)節(jié)功能。（二）對(duì)雌性生殖系統(tǒng)的損害作用 包括對(duì)卵細(xì)胞和內(nèi)分泌功能的影響。下丘腦LH-RH垂體前葉FSHLH卵泡初期成長卵泡成熟排卵黃體

43、形成雌二醇孕 酮 （） （） （） （）（三）生殖毒性及其評(píng)定 外來化合物對(duì)生殖過程作用的評(píng)定主要通過生殖毒性試驗(yàn)來進(jìn)行。可全面反映外來化合物對(duì)性腺功能、發(fā)育周期、交配行為、受孕、妊娠、分娩、授乳及幼子斷奶后生長發(fā)育可能產(chǎn)生的影響。1、試驗(yàn)方法原則 材料：性成熟大鼠，或小鼠、家兔 劑量：三組 最高：出現(xiàn)輕度中毒，不死亡或死亡率小于10 等比級(jí)數(shù) 中：極輕微中毒 低：無中毒癥狀 染毒方式：口服飼喂法、灌胃法 數(shù)量：雌雄各1620只，或雌1620只，雄810只（2）試驗(yàn)方案a、三代兩窩試驗(yàn) 近年來許多國家與機(jī)構(gòu)多規(guī)定采用兩代一窩或一代一窩試驗(yàn)法，兩代一窩生殖試驗(yàn)法基本程序與三代兩窩試驗(yàn)法相同，但只

44、進(jìn)行到第二代F2，每代只生育一窩。 （3）觀察指標(biāo) 在上述各種生殖毒性試驗(yàn)中，根據(jù)哺乳動(dòng)物全部生育繁殖過程，可觀察下列4個(gè)指標(biāo)：受孕率：反映雌性動(dòng)物生育能力正常分娩率：反映雌性動(dòng)物妊娠過程是否受影響幼仔出生存活率：反映雌性動(dòng)物分娩是否正常幼仔哺育成活率：反映雌性動(dòng)物授乳哺育幼仔的能力二、發(fā)育毒性及評(píng)價(jià) 胚胎毒性發(fā)育毒理學(xué)范疇，母體毒性生殖毒理學(xué)范疇。都是化學(xué)物對(duì)生殖繁殖過程的影響，是在不同階段和不同靶部位的具體體現(xiàn)。（一）胚胎毒性指外來化學(xué)物對(duì)母體子宮內(nèi)胚胎或胎兒產(chǎn)生的毒作用。具體表現(xiàn)：1、胚胎死亡2、生長遲緩：平均體重低于正常值兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。3、功能發(fā)育不全：包括代謝、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)方面的缺陷

45、。4、畸形：包括外觀、內(nèi)臟、骨骼畸形，指的是器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常，與發(fā)育缺陷不同，它指的是出生后個(gè)體發(fā)育紊亂引起的結(jié)構(gòu)、功能、代謝、精神、行為和遺傳等異常。 畸形指的是器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常，與發(fā)育缺陷不同，后者指的是出生后個(gè)體發(fā)育紊亂引起的結(jié)構(gòu)、功能、代謝、精神、行為和遺傳等異常。 與變異區(qū)別：兩者有時(shí)難以區(qū)分，一般變異不存在生命危險(xiǎn)，甚至不影響正常生理功能，而且難以明確變異與接觸某種外源化學(xué)物的因果關(guān)系。常見的變異有內(nèi)臟左右易位、手指、足趾數(shù)目不同。 （二）母體毒性 指外來化合物在一定劑量下，對(duì)受孕母體產(chǎn)生的損害作用。具體表現(xiàn)包括體重減輕、出現(xiàn)某些臨床癥伏、直至死亡。 常見有以下情況：（1）具有

46、胚胎毒性，但無母體毒性出現(xiàn)。（2）出現(xiàn)胚胎毒性的同時(shí)也表現(xiàn)母體毒性。（3）不具有特定致畸作用機(jī)理，但可破壞母體正常生理穩(wěn)態(tài)，以致對(duì)胚胎具有非特異性的影響，并造成畸形。（4）僅具有母體毒性，但不具有致畸作用。（5）在一定劑量下，既不呈現(xiàn)母體毒性，也未見致畸作用。此種情況并不能確定受試物確實(shí)不具致畸作用?？赡苁莿?dòng)物接觸的劑量未達(dá)到致畸作用的最小有作用劑量，并非真正不具有致畸作用。（三）發(fā)育毒性及評(píng)定1、致畸試驗(yàn) 檢查受試物能否通過妊娠母體引起胚胎畸形的動(dòng)物試驗(yàn)，可確定受試物是否有致畸作用，誘發(fā)何種畸形及出現(xiàn)畸形的主要器官，最大無作用劑量和最小有作用劑量。 （1）動(dòng)物選擇 食性和對(duì)受試物代謝過程與人

47、類接近，體型小，馴服，容易飼養(yǎng)和繁殖及價(jià)廉，還應(yīng)特別注意妊娠過程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多和胎盤構(gòu)造及厚度與人類接近等特點(diǎn)。 可選用二種哺乳動(dòng)物，一般首先考慮大鼠，此外可采用小鼠或家兔。大鼠受孕率高，易于得到足夠標(biāo)本數(shù)；胎仔大小適中；大鼠對(duì)大多數(shù)外來化合物代謝過程基本與人類近似。（2）劑量分組預(yù)試驗(yàn)：用孕鼠810只，在妊娠1516天內(nèi)給予受試物，如果出現(xiàn)嚴(yán)重的母體中毒、流產(chǎn)或胚胎大量死亡，將劑量減小，直到找出母體輕度中毒的劑量。最少設(shè)3個(gè)劑量組，成等比級(jí)數(shù)關(guān)系。另設(shè)對(duì)照組，陽性對(duì)照、陰性對(duì)照最高劑量組可以引起母體輕度中毒，即進(jìn)食量減少、體重減輕、死亡不超過10%中間劑量組母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀最

48、低劑量組不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀（3）交配處理 每日將已確定受孕雌鼠隨機(jī)分入各劑量組和對(duì)照組。 接觸受試物的方式與途徑應(yīng)與人體實(shí)際接觸情況一致，一般多經(jīng)口給予。也可采用灌胃方式、腹腔注射法。 大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天開始給予受試物，每日一次，持續(xù)到第15天。試驗(yàn)期間每23天稱取母鼠體重。一方面可根據(jù)體重增長，隨時(shí)調(diào)整給予受試物的劑量，同時(shí)也可觀察受孕動(dòng)物的妊娠情況和胚胎發(fā)育情況。（4）胎仔檢查 自然分娩前12日將受孕動(dòng)物處死，剖腹取出子宮及活產(chǎn)胎仔，并另行記錄死胎及吸收胎。 活產(chǎn)胎仔取出后，先檢查性別，逐只稱重，并按窩計(jì)算平均體重，然后由下列幾方面進(jìn)行畸形檢查：外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；

49、肉眼檢查內(nèi)臟及軟組織畸形，例如腭裂；骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等?；螜z查只限活產(chǎn)胎仔。（5）結(jié)果評(píng)定主要計(jì)算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)。計(jì)算時(shí)還要對(duì)劑量效應(yīng)（反應(yīng)）關(guān)系加以分析。常用評(píng)價(jià)指標(biāo)：活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)率、畸胎出現(xiàn)率、母體畸胎出現(xiàn)率2、致畸物體內(nèi)篩檢試驗(yàn)法（C/K法） 對(duì)象：受孕小鼠或大鼠 劑量：至少兩個(gè)劑量組對(duì)照組。高劑量組：最小有作用劑量，允許產(chǎn)生明顯母體毒性。 妊娠615天內(nèi)每天接觸受試物，記錄體重，自然分娩，肉眼查看畸胎，計(jì)算出現(xiàn)死胎母鼠百分率、出現(xiàn)吸收胎母鼠百分率和出生第三日存活幼子百分率。此外，還應(yīng)計(jì)算幼子平均體重和出生三日增長的體重，判斷是否生長遲緩，若有培養(yǎng)至斷奶，觀察是否可逆