顯微鏡基礎知識

1、目 錄1. 顯微鏡基礎知識11.1 顯微鏡成像原理11.21.31.41.51.6顯微鏡總放大率1顯微鏡的有效放大率1顯微鏡鑒別率1顯微鏡的景深2光學系統(tǒng)的成象缺陷(象差)2zzzzzzz球差2彗差3象散3場曲4畸變4位置色差4放大色差52. 顯微鏡主要部件52.1 物鏡52.2 目鏡92.3 雙目(或叁)目鏡筒102.4 支架組112.5 粗微調焦裝置122.6 機械工作臺122.7 照明系統(tǒng)123. 顯微鏡的使用143.1 對工作環(huán)境的要求143.2 操作步驟143.3 光學系統(tǒng)的清潔153.4 圖像欠佳分析17幾種特殊的觀察法184.暗場觀察法18相襯觀察法20偏光觀察法23微分相襯觀察

2、法27熒光觀察法28調制對比觀察法34介紹36BME36DME39DMLS434.14.24.34.44.54.65.5.15.25.32顯微鏡基礎知識顯微鏡成像原理顯微鏡的光學成象系統(tǒng)由兩部分組成,靠近物體部分的透鏡組稱為物鏡;靠近眼睛的透鏡組稱為目鏡。物鏡組把物體成象在目鏡前焦面上,形成一個放大倒立的實象,它稱之為中間象,然后由目鏡組再次放大供目視觀察。圖中：1. 物體4. 目鏡2. 物鏡5. 眼睛3. 中間像顯微鏡總放大率：M=×式中：M：顯微鏡總放大率：物鏡放大率：目鏡放大率即,顯微鏡總放大率=物鏡放大率×目鏡放大率顯微鏡鑒別率顯微鏡鑒別率是指剛能=0.61/A式中

3、：物平面兩點的最小距離,則： 光波波長 （通常=0.00055mm）A ：物鏡數值孔徑 NA可見 ,鑒別率取決于物鏡的數值孔徑。顯微鏡的有效放大率M 有效500AM 有效1000A滿足此式的放大率就稱有效放大率。若總放大率 M<500A,說明顯微鏡的鑒別率沒有充分利用。物鏡雖能分辨物體的細節(jié),但人眼仍無法看清.反之,M>1000A,說明無效放大,原來看不清的細節(jié),過分放大后。還是看不清。1物鏡4/0.1010/0.2540/0.65100/1.25鑒別率3.361.340.520.27顯微鏡的景深 DF景深表示,象平面上清晰的象所對應物平面的前后空間的深度。DF1/7AM +/2A

4、2式中：DF ：景深A : 數值孔徑 NA M ：總放大率:光波波長,:mm例: 用 10×目鏡觀察:mm光學系統(tǒng)的成象缺陷(象差)1. 球差位于正透鏡的光軸上一點發(fā)出一根與光軸成最大角度 Um 的光線,經正透鏡匯聚后與光軸交于 M 點,仍由此點發(fā)出一根與光軸無限接近的光線,經正透鏡匯聚后與光軸并不交于 M 點,而交于 O 點。O 點到 M 點的距離 LAm 稱為邊光球差。仍由同一點發(fā)出一根于光軸成 Uz 角的光線,經正透鏡匯聚后交于 Z 點,O 點到 Z 點的距離LAz 稱為帶光球差。由計算知,單個正透鏡產生的球差恒為正,即 LA>0。反之單個負透鏡產生的球差恒為負。所以,單

5、獨一個透鏡不可能校正球差,至少由正,負透鏡組合起來才有校正球差的可能性。若在 O 點處置一屏,則在屏上得到一個彌散斑,當屏沿著光軸移動在 M,Z 之間,將得到最小彌散斑,但始終不能成為一個幾何象點。因此,象平面上的圖形是由無數個彌散斑組成,象就變得模糊不清,故任何光學系統(tǒng)必須要校正好球差。2物鏡4x/0.110x/0.2540x/0.65100x/1.25景深 DF0.0630.01010.00120.000292. 彗差位于光軸外一點發(fā)出三條光線,最邊緣的兩根光線的交點,并不位于中心光線上。使光束失去對稱性。從光能傳輸的觀點來說,中間中心光線處的能量最集中,亮度最亮。邊緣光線處 能量擴散,相

6、對地較暗,形成彗星狀的彌散斑,使物體細節(jié)不能看清,破壞了軸外視場清晰度。3. 象散若只考慮中心光線附近的無限細光束,這樣彗差就不存在了。但是,如此細的光束還存在另 外兩種象差:象散和場曲。當軸外點中心光線經有象散的光學系統(tǒng)時,在象空間用一屏沿著光軸移動,在位置 1,成象光束截面為上下扁的橢圓；移到位置 2 時,為一水平短線；在位置 3 時,又成為上下扁的橢圓；在位置 4 時,形成一個園斑；在位置 5 時,形成左右扁的橢圓；在位置 6 時,形成一垂直的短線；在位置 7 時,又擴散成左右扁的橢圓.這就是象散現象.位置 2 到位置 6 的距離為象散值。假想物體圖案為十字線,則在位置 2 和位置 6

7、的圖像如下：位置 2位置 6位置 2 時,垂直線模糊；位置 6 時,水平線模糊。3象散將一個物體形成二個象面,在各個象面上不同方向的線條清晰度不同。象散嚴重時,軸外點得不到清晰的象。4. 場曲軸外物點成象存在象散。這個數值隨著軸外點遠離光軸,象散值也隨著增加,而軸上點無象散。所以一個平面物體必然形成二個象面,而且二個象面是曲面同時相切于軸上點,這就是場曲現象。光學系統(tǒng)存在著嚴重場曲面時,就不能使一個較大的平面物體上各點同時清晰成象。當把中心調焦清晰,邊緣四周就變得模糊； 反之,邊緣四周調焦清晰,則中心變模糊。5. 畸變軸外點寬光束存在彗差,細光束存在象散和場曲,但即使只有一根中心光線,由于各個

8、軸外點的放大倍數均不相同,于是產生了畸變,畸變不會影響成象的清晰度,但使象變形。如一個網格板,經有畸變的光學系統(tǒng)成象后,將得到枕形或桶形畸形。6. 位置色差顯微鏡往往使用白光觀察,而白光是由不同波長的色光組成,光學玻璃對不同波長的色光折射率也不同,波長越短折射率越高。因此,不同色光有不同的焦距和像距。藍光(F)折射率最高,透鏡會聚能力越強,所以像距最短,反之對紅光(C)透鏡會聚能力最弱,像距最長。藍光象距與紅光象距之差稱為位置色差。由于位置色差使軸上物點不能成為一白光點而4成為彩色的彌散斑,使象模糊。當光學系統(tǒng)校正了二種色光,如 F, C的色差,即兩象點相重合時稱為消色差光學統(tǒng)。但白光由許多的

9、色光組成,僅校正二種色光后,第三種色光如黃綠光 e 的象點與 F,C象點仍有位置差異,這種差異稱為二級光譜。若光學系統(tǒng)對三種色光的象點校正在一起,這種系統(tǒng)稱為復消色差系統(tǒng)。此時,其余波長的色差將會降低到無害的程度。7. 放大色差與位置色差同樣原因。對于軸外點,由于多色光的放大率不等,不同色光的象有不同的高度。這種現象稱為放大色差。如左圖,象的最高點會呈現藍色鑲邊。放大色差嚴重時, 物體的象有彩色邊緣,破壞軸外點的清晰度。F：藍色光e ：黃綠色光C: 紅色光顯 微 鏡 主 要 部 件l 物鏡按象差校正程度分類： 1消色差物鏡它校正了球差,彗差和二種色光的位置色差。此類物鏡存在嚴重的軸外象差,特別

10、是場曲。對18mm 中間象而言(以下同),成象的清晰范圍約 50%,即視場中心調節(jié)清晰后,邊緣象模糊不清,反之,邊緣象調節(jié)清晰后,視場中心象模糊不清。物鏡外殼無特殊標記。徠卡的 BME 及 DME顯微鏡的物鏡就屬此種類型中間清晰,邊緣模糊2平視場消色差物鏡中間模糊,邊緣清晰5它在消色差物鏡基礎上,還校正了象散和場曲,象面平坦。清晰范圍不低于 90%。物鏡外殼刻有 PL 或 PLAN 字樣。的目錄中,N PLAN 物鏡就屬于此類物鏡。3平視場復消色差物鏡它在平視場消色差物鏡的基礎上,還對第三種色光校正了位置色差,這種物鏡成象質量最佳,其數值孔徑也較同倍率物鏡大。因此,鑒別率也最高。物鏡外殼刻有

11、Planapo 字樣,錄中 PLAPO 就是此類物鏡。目4半平視場消色差物鏡這類物鏡的清晰范圍介于消色差物鏡與平視場消色差物鏡之間,但明顯優(yōu)于消色差物鏡。接近平視場消色差物鏡。其外殼?？逃?SP(Semi.plan)字樣。高倍物鏡屬于此類。的目錄中 C PLAN 的中,6目前的趨勢似乎很多廠商不認可這種分類。把他們并入消色差物鏡中,作為新穎的或優(yōu)化的消色差物鏡如：CME 中, AchroE2 就是此類物鏡。5.平視場半復消色差物鏡色差的校正程度介于平視場消色差物鏡與平視場復消色差物鏡之間。但較近于平視場復消色差物鏡。目錄中的 PL Fluotar 就是這類物鏡。按筒長分類1筒長有限遠物鏡的共軛

12、距離(物到象的距離)為 195mm,物鏡的機械筒長(物鏡螺紋端面到目鏡支承面)為160mm。中 BME,CME 采用此類物鏡。2筒長無限遠7物鏡把物體成象于無限遠, 因此, 必須要有鏡筒透鏡將無限遠的光線聚焦到目鏡焦面上才能觀察。中 DME,DMLS,DMLB 等均采用此類物鏡。此類物鏡的突出優(yōu)點是,在物鏡與鏡筒透鏡之間可方便地置的變化。各種附件,而引起成象位物鏡外殼的標記40/0.65160/0.1740： 有限遠物鏡,放大率為 40 倍0.65：數值孔徑 NA160： 機械筒長 160mm0.17：蓋厚度N PLAN 40x/0.65/0.17N PLAN：平視場消色差40x：0.65:

13、0.17:無限遠物鏡,放大率為 40 倍數值孔徑 NA筒長無限遠豎厚度C PLAN 63x/0.75/0.17C PLAN: 半平視場消色差物鏡63 x:無限遠物鏡,放大率為 63 倍N PLAN5x/0.12/N PLAN: 平視場消色差物鏡5 x:0.12:無限遠物鏡,放大率為 5 倍數值孔徑 NA對有無蓋玻片無要求PLAPO/0100x/0.95PLAPO: 100x:0.95:O:平視場復消色差物鏡無限遠物鏡,放大率為 100 倍數值孔徑 NA無蓋蓋厚度對成象質量的影響8放大率1 1.251.622.5 3.24 56.3810 12.51620253240506380100,125,

14、160顏色黑灰棕紅橙黃淡綠深綠淡藍深藍白當物鏡的數值孔徑大于 0.65 時,蓋厚度誤差對于物鏡的成象質量影響十分明顯。設計時,蓋厚度采用標準值 0.17mm。用高倍率物鏡觀察時,蓋片厚度誤差最好在+/-0.01mm 之內。下圖為普通帶有片的物鏡在兩種情況下觀察的結果有蓋玻片時的圖像無蓋玻片時的圖像l 目鏡按放大色差校正狀況可分為消放大色差目鏡和補償目鏡。補償目鏡放大色差為 11.5%。以補償物鏡殘留的放大色差。通常,補償目鏡的視場光闌四周帶特有的黃色。對于筒長有限遠的物鏡,常與補償目鏡配合使用，如：BME 等。對于筒長無限遠的物鏡,若鏡筒透鏡具有補償放大色差功能的,則與普通目鏡配合使用，如：

15、DMLS,DMLB。若鏡筒透鏡無補償色差功能的。則必須與補償目鏡配合使用，如：DME。按目鏡視場數可分為：非廣角目鏡, 廣角目鏡,超廣角目鏡等。對于 10 X 目鏡而言,視場數<18，常稱為非廣角目鏡。視場數18,常稱為廣角目鏡。 視場數>20, 常稱為超廣角目鏡。目鏡外殼標記10X/2010： 放大率20: 視場數9各類目鏡l 雙目(或叁)目鏡筒按機械結構可分為滑板式雙目鏡筒和鉸鏈式雙目鏡筒。1 滑板式雙目鏡筒優(yōu)點: 用偏光觀察時,改變瞳距暗的變化。產生光線或明或缺點: 改變瞳距時,左,右目鏡管的刻度值必須與瞳距值相等,否則會破壞顯微鏡的齊焦。采用此類鏡筒。的 BME,CME10

16、鉸鏈式雙目鏡筒優(yōu)點: 改變瞳距時,顯微鏡的齊焦性能不變缺點: 若用于偏光觀察,分光膜必須具有消偏振性能。按目鏡的傾斜角可分為 30°,45°及符合人機工程學傾斜角可變的雙目鏡筒。傾角 30°的雙目鏡筒DME,DMLS,DMLB 等采用此類鏡筒。無論哪一種雙目鏡筒都必須滿足下列要求 由兩個目鏡射出的光軸必須平行。通常認為,發(fā)散度<60會聚度<30上下差<20傾角 0°35°可變的雙目鏡筒但的遠遠小于上述數值。明顯的顏色差。 明顯的亮度差。明顯的象偏轉。左右視場不左右視場不左右視場不左右兩系統(tǒng)放大率差2%。叁目鏡筒僅僅用轉向分光鏡

17、代替轉向棱鏡,以便引出一條光路連接照相及 CCD 等附件11z支架組支架組由支架,粗微調焦,機械工作臺,轉換器及照明系統(tǒng),見下圖：支架是整個顯微鏡的基座,所有組件都要安裝其中,它必須有足夠的剛性,不致因組件定量的扭力矩象。,出現時松時緊不良現過多而引起變形。支架精度必須嚴格保證,確保各組件間相互關系滿足預定的要求。的所有顯微鏡,無論低檔,中檔還是l 照明系統(tǒng)位于工作臺下方的透鏡組稱為聚光鏡,位于燈泡附近的透鏡組稱為集光鏡。由聚光鏡,高檔顯微鏡,支架是其與眾不同的特點,體現了先進的設計思想和高精度的機械完美結合。反光鏡及集光鏡等1聚光鏡:了顯微鏡照明系統(tǒng)。聚光鏡的作用是將光源發(fā)出的光線形成一束與

18、物鏡數值孔徑相適應的光束,均勻地照明標本片。由于各個物鏡的數值孔徑不同,要求照明光束的孔徑角也相應的變化,因此,聚光鏡中必定有一個能連續(xù)改變照明孔徑角的可變光闌,此光闌稱為可變孔徑光闌。可變孔徑光闌的功能及正確使用：可變孔徑光闌的大小除了會改變圖像的亮度外,還直接影響到圖像的鑒別率,對比度和景深.其結果為下圖所示.l 粗微調焦裝置粗微調采用行星式結構,再配上硬度,光潔度出眾的三角等軌和滑板,使調焦具有較高的靈敏度且有永不下滑的自鎖功能。l 機械工作臺工作臺臺面平面性好,利用同軸手輪可作X,Y 向移動,傳動平穩(wěn)舒適。手輪的長短充分考慮的人機工程的需要。凡是傳動手輪應有12孔徑光闌完全打開圖像整個

19、對比度降低2/33/4圖像對比度增加,鑒別率充分展現1/3景深增加,但由于衍射致使圖像鑒別率受到影響如何正確調節(jié)孔徑光闌大小?把標本像調節(jié)清晰后, 把可變孔徑光闌關小,取出目鏡,肉眼距目鏡筒口約 100mm 處直接從目鏡筒中觀察物鏡末端的通光孔,邊觀察邊打開孔徑光闌,直至孔徑光闌象(多邊形)為物鏡通光孔的 2/33/4, 見圖示:聚光鏡分為干,濕兩種。所謂“ 濕”即使用時需滴上浸液.這類聚光鏡 NA,自 1.21.4?！案伞笔褂脮r不需滴浸液,NA 常為 0.9。還備有干,濕兩用的聚光鏡，NA 0.9/NA 1.25。數值孔徑為 0.9 的聚光鏡與孔徑為 1.25的 100 倍油漆配合使用,其鑒

20、別率會否降低？12由上所述,1.25*3/4=0.94,NA0.9 干聚光鏡正好與之相適應,也免去操作者滴油及清潔的麻煩。對于特別追求鑒別率的場合,則應采用濕聚光鏡,使用時,應在載玻片與聚光鏡上表面滴上相應的浸液。臨界照明是指燈絲成象在標本面上或其附近。這樣，光能得以充分的利用。即使小功率的光源，也能給出足夠的亮度。但其照明均勻性欠佳必須通過在照明光路中，才能滿足使用的要求。磨砂庫勒照明是一種較為完善的照明方式，嚴格的庫勒照明必須符合下面三個條件： 照明均勻，燈絲像常在聚光鏡的前焦面上，通過聚光鏡以平行光束照明標本。 孔徑光闌大小可任意改變，以適應不同倍率物鏡的需要。 具有可變的視場光闌，以適

21、應不同倍率物鏡的不同照明范圍需要。視場光闌的功能及其正確使用：視場光闌常位于支架底座上，其光闌大小能連續(xù)改變，它通過聚光鏡能清晰地成象在 標本面上。所以在目鏡中看清標本的同時也 能看到視場光闌多邊形圖像?？勺円晥龉怅@ 的像應外切于目鏡中的視場光闌,使光線只能照明需觀察的標本，盡可能減少標本四周的散射光。的 BME 采用臨界照明。DME 采用臨界照明也可采用庫勒照明。DMLS，DMLB 采用庫勒照明。2集光鏡集光鏡的作用是把光源射向四周的光線聚焦，把燈絲象成到聚光鏡中，使聚光鏡能起到改變燈絲大小的作用。照明方式常見的照明方式，有臨界照明和庫勒照明兩種.顯微鏡的 使 用對工作環(huán)境的要求： 室溫：5

22、°30由于浸液的折射率會隨著溫度的變化而發(fā)生改變，使用油鏡時，為了得到理想的象操作步驟：1. 接通電源，放置好標本。2. 先用 10×物鏡，將標本象調焦清晰。3若目鏡筒觀察：質，室溫最好在 22251）滑板式雙目鏡筒 濕度：相對濕度 4585 振動小。顯微鏡最好能安放在防震的工作臺上，否則，用油鏡觀察時，圖像常處于抖動狀態(tài)。 環(huán)境清潔。a.推動連接目鏡筒的滑板，調節(jié)雙目鏡筒瞳距，使左右視場的圖像和而為一，并且取瞳距值。14b.轉動左（或右）目鏡筒視度圈，使其指示值與瞳距值相等。用此目鏡筒觀察，精確調焦使圖像清晰。用另一眼睛及另一目鏡筒觀 察，轉動此目鏡筒視度圈使此眼也能同時

23、看清圖。（注意：不能使用調焦機構調焦。）光鏡調中螺釘，使可變視場光闌居 中，打開可變視場光闌，使其外切于目鏡視場光闌。C.拔出目鏡，用肉眼直接觀察物鏡后焦 面，調節(jié)可變孔徑光闌，使可變孔徑 光闌的大小為物鏡通光孔的 2/33/4,目鏡觀察。注：轉動轉換器改變物鏡倍率后，還應拔出目鏡，調節(jié)可變孔徑光闌大小。c.d.注：若瞳距值與某一目鏡筒指示值不等，則會影響顯微鏡齊焦性能。若被觀察的標本，本身對比度很低， 即使按上述步驟操作后，圖像對比度仍很低。此時,可關小可變孔徑光闌,用犧牲鑒別率來提高圖像對比度。反之,被觀察的標本對比度很高,為追求鑒別率,可適當開大可變孔徑光闌(改為物鏡通光孔的 90100

24、)。2） 鉸鏈式雙目鏡筒a. 用固定目鏡筒觀察，調焦，使圖像清晰。b. 扳動鉸鏈，使左，右視場的圖像合二為一。c. 轉動另一目鏡筒視度圈，使另一眼睛同時能看到清晰的圖像。4. 若用庫勒照明：a. 關小可變視場光闌b. 上下調節(jié)聚光鏡，使可變視場光闌的多邊形圖像在目鏡中?？梢?，調節(jié)聚光學系統(tǒng)的清潔清潔劑用 7080%乙醚+3020% 清潔工具配成混合劑吹氣球柳條棒,牙簽或棒脫脂棉花,紗布或擦鏡紙放大鏡(用目鏡倒置也可)目鏡上的灰塵用吹氣球吹手指印,唾沫,油脂,用清潔劑擦拭。對小面積的光學元件,用牙簽卷紙棉花,由中心向外,按螺旋形運動方向輕輕擦拭,見圖:15對大面積的光學元件用脫脂紗布或擦鏡紙滴上

25、清潔劑,由中心向外,按螺旋形運動方向輕輕擦拭。清潔完畢用放大鏡檢查:油浸物鏡的清潔浸液物鏡用畢后,必須及時清潔,否則,浸油在物鏡表面會凝結成硬膜,使物鏡失去而無法使用。由于浸液物鏡最前端通光極小(<2)必須用牙簽卷上脫脂棉蘸上混合劑多次擦拭.用放大鏡仔細檢查,通光孔四周是否殘留的浸液否則會減小物鏡的數值孔徑,影響物鏡的正常功能。16DME 及 DMLS 等顯微鏡配用的浸液物鏡。由于孔大, 深度淺,只需用擦鏡紙蘸上清潔劑,用手指輕輕擦拭就能除去浸液.DME,DMLS 浸液物鏡前端示意圖圖像欠佳分析17現象措施用 40×物鏡成象模糊經常與 100 倍油鏡同時使用,物鏡前端不沾上浸油

26、用棉花簽,清潔劑,清除浸油物鏡前端有指印或其它臟東西用棉花簽,清潔劑清除標本上無蓋玻片或蓋玻片太厚改用 0.17 厚度的蓋玻片聚光鏡可變孔徑開得太大將可變孔徑光闌大小打開為物鏡的2/33/4長期未使用,儲存又不當, 物鏡內鏡片發(fā)霧,生霉送工廠修理物鏡前透鏡沾有腐蝕性液體,未及時清除,使鏡片失去送工廠修理物鏡內部滲入浸油送工廠清除浸油物鏡不跌落,各透鏡中心走動送工廠清除浸油用 100×物鏡成象模糊沒有使用浸油滴上浸油沒有使用規(guī)定的浸油用規(guī)定浸油浸油中氣泡未排除在物鏡工作位置上,利用轉換器多次正反向轉動,排除氣泡室溫與浸油標準溫度(23 左右)相差太多,以致油折射率發(fā)生變化調節(jié)室溫放置顯

27、微鏡,工作臺或工作環(huán)境振動太大,以致圖像抖動不停減少振動,或遠離振動源標本切片太厚標本厚度 23u 為佳物鏡前端鏡片殘留的的浸油用棉花簽,清潔劑反復清除幾種特殊的觀察方法暗視場觀察法暗視場觀察法可以通常的動植物組織切片、血液圖片、硅藻片,但在觀察透明的活體標本方面如含有細菌的液體更顯出其優(yōu)越性。值得指出的是,它還能觀察到小于物鏡分辨率本領的微粒。這些微粒在的背景中以亮點形式出現，使觀察者能觀察到它們的存在和移動。有人稱此為超顯微術。要實現暗場效應,最簡單的方法是在普通的阿貝聚光鏡下方小孔徑角大于物鏡數值孔徑即可。左圖為暗場觀察法的光學原理圖。圖中：1. 環(huán)形光闌2. 阿貝聚光鏡3. 物鏡一塊環(huán)

28、形光闌,使照明的最集光鏡射出的光束,經暗場環(huán)形光闌后以環(huán)狀光束射向阿貝聚光鏡,然后以環(huán)狀的光錐照明標本,光錐最小角度即照明孔徑角，它必須大于物鏡的數值孔徑。如果標本片內無任何東西,那么,照明光線不可能進入物鏡,視場內漆黑一片。反之,標本片內存在某些東西如細菌等微粒，那么由于光的衍射與散射作用，這些光線就進入物鏡并成象， 視場內將看到漆黑的背景中存在許多明亮的標本象。用插片方式實現簡易暗場,價格低廉,但只能與放大率40x 的物鏡配合使用。由于阿貝聚光鏡內的雜散光及色差等因素視場背景難達到完全漆黑的程度。18顯微鏡總放大率過大,成無效放大總放大率在 1000NA 內物鏡內部滲油送工廠清除內部浸油操

29、作不當,變換倍率時物鏡前組碰歪送工廠修理要達到理想的暗場效果,最好采用的暗場聚光鏡。這種聚光鏡有干燥型,浸液型之分。干燥型暗場聚光鏡有幾種形式,它們的共同點是在一個透鏡上有多個球面,其中兩個是反射面,其余面是折射面,光束經過它們后,最小照明孔徑約在 0.750.78 之間。因此,與倍率40倍物鏡匹配可以獲得很好的效果。下圖為二種干燥型暗場聚光鏡：浸液型暗場聚光鏡由兩個相同材料的透鏡膠合而成。加上浸油后,最小照明孔徑約 1.22。適合與 100 倍油浸物鏡配合使用,注意:物鏡中必須帶有可變孔徑光闌,能減少物鏡的數值孔徑。否則,部分照明光束將直接進入物鏡而破壞暗場效果。其光學原理如下圖：注意: 浸

30、液型暗場聚光鏡使用時必須在載玻片與聚光鏡間滴上浸油。 這種聚光鏡還能與干燥型物鏡配合使用。特別是高倍率的干燥型物鏡,能取得很好的效率。其缺點是照明范圍較小,因此與低倍率物鏡,特別是 4 倍物鏡,只能在視場中心部分可以進行暗19場觀察，而四周無光線照明,呈現一片。暗場效果的好壞與使用時聚光鏡的調節(jié)有很大關系。舉簡單暗場調節(jié)實例：標本上放置一半透明紙。打開可變孔徑光闌,升降帶有暗場插片的聚光鏡,使半透明的紙上呈現明亮圓形的光斑。調整聚光鏡對中螺釘,使照明光軸與物鏡光軸重合,此時視場背景應均勻。常見故障20現象糾正措施視場中一片漆黑可變孔徑光闌未打開浸油暗場聚光鏡未滴油照明光斑呈環(huán)形,中心載玻片太厚

31、打開孔徑光闌在載玻片與浸油暗場聚光鏡之間滴上浸油上下調節(jié)聚光鏡使光斑呈圓形對于暗場聚光鏡,由于工作距離較短,載玻片厚度嚴格在 11.1mm 之間背景中出現許多點狀亮點或劃痕載玻片及蓋玻片上灰塵， 麻點，劃痕成象載玻片兩面不有劃痕, 麻點,灰塵(包括蓋玻片表面)必須保持清潔透明視場背景很亮100 倍油鏡物鏡中無特殊的可變孔徑光闌100 倍物鏡中孔徑光闌未關閉至 NA=1 附近100 倍物鏡使用了干燥型， 暗場聚光鏡聚光鏡光軸與物鏡光軸不重合選用帶有可變孔徑的100 倍油浸物鏡關小可變孔徑光闌改用浸液型暗場聚光鏡調節(jié)聚光鏡對中螺釘視場背景暗度不均勻暗場環(huán)形光闌中心與聚光鏡光軸不同軸,使照明光斑非圓

32、形聚光鏡光軸與物鏡光軸微量編差送工廠校正調節(jié)聚光鏡對中螺釘用低倍物鏡(如 4 倍)時,視場中心有圖像,但四周使用浸油暗場聚光鏡改用干燥型暗場聚光鏡相襯觀察法相襯觀察法用來觀察無色透明或不染色的標本。因為人眼只對亮暗,顏色有識別能力。而這些無色透明的,除了折射率與周圍介質不同而引起位相的不同外,其亮度與周圍介質的亮度完全一樣。所以用普通的明場觀察無法察覺到這些透明體的存在。如下左圖表示光線透過上述的標本。光與電磁波一樣也是以波動的形式存在。我們用一正弦波來描述。波峰值稱為振幅,它的平方值即代表亮度(能量)。下圖中的 1 表示,透過周圍介質的正弦波。3 表示光線透過標本時產生的衍射光，它的能量很弱

33、(圖中已夸大了)。2 是曲線 1 與曲線 3 迭加的波形。因此,曲線 1 表示觀察背景光的亮度,曲線 2 表示標本成象的亮度?？梢娗€ 1 與曲線 2 波形相同,僅僅位相不同而已,這就是明場觀察所得的效果。成象光與背景光同樣亮度。人眼無法察覺透明體的存在。我們設法將直射光 1 的位相改變 90°(超前或滯后).如下圖,直射光 1 與衍射光 3 位相差180°.那么,波形 2 與波形 1 相比振幅略有改變,但還不足以達到滿意的程度.21如果,我們設法將直射光 1 的能量衰減 75%。如下圖,那么波形 2 將與橫坐標重合(為了識別,圖中故意夸大),與波形 1 有明顯的差別。觀察

34、的效果是,在較暗的背景下,看到黑色的透明體， 這就是相襯觀察法。因為相襯板的膜層厚度根據綠光(e 光)鍍制的,使用時應用綠色濾光照明。左圖為實現相襯觀察法的光學原理圖。圖中：1. 環(huán)形光闌2. 聚光鏡3. 物鏡4. 相襯板通過環(huán)形光闌的光束稱為直射光。環(huán)形光闌常位于聚光鏡的焦面上,光束經聚光鏡后以傾斜的平行光束照明標本。再經物鏡后,使環(huán)形光闌的象成在相襯板上。相襯板上鍍有改變位相及減弱光能的膜層,它也是環(huán)狀的,但其比環(huán)形光闌的象稍大。相襯板的環(huán)形必須完環(huán)形光闌的象(偏心),見圖示,換句話說,也就是通過環(huán)形光闌的直射光,只能從環(huán)狀相襯板中通過。不從環(huán)狀相襯板外通過。公司有簡易相襯裝置與標準相襯裝

35、置之分。所謂簡易相襯裝置由普通聚光度環(huán)形光闌插板,相襯物鏡及綠色慮光片組成。不同倍率的相襯物鏡必須與不同的環(huán)形光闌配合使用。未對中對中良好22相襯物鏡倍率10 倍及 20 倍40 倍100 倍環(huán)形光闌插板代號Ph1Ph2Ph3由于離開公司前,環(huán)形光闌的中心與相襯環(huán)中心已校正好,因此,不再配對中望遠鏡。標準相襯裝置由轉盤聚光鏡,相襯物鏡,綠色濾光片,對中望遠鏡及二個六角螺釘扳手組成。轉盤聚光鏡帶有五個園孔,內置 ph1,ph2,ph3 三種環(huán)形光闌,一個暗場環(huán)形光闌 DF 和一個用于明場物鏡觀察的通孔。通過二個六角螺釘扳手可以對四個環(huán)形光闌進行調中。對中望遠鏡目鏡管可以觀察到環(huán)形光闌圖像與環(huán)形相

36、襯板對中狀況。轉盤聚光鏡我們上面所介紹相襯圖像比背景光暗,稱為正相襯,反之,圖像比背景明亮稱為負相襯。 需要指出,相襯物鏡可以作為普通的明場物鏡使用,只是由于能量分布的改變,以及雜散光的增加,圖像對比度稍遜一些。相襯圖片偏光觀察法偏光觀察法主要用來研究各向異性材料的一些特性。偏光顯微鏡與生物顯微鏡的主要區(qū)別在于具有偏振元件、波片、補償器及勃氏鏡等特殊組件。偏振元件：自然光通過某個光學元件后轉換成某種形式的偏振光，這種元件稱為偏振元件。更確切的說，應稱為起偏振器。常用的起偏振器可用來使自然光轉換成直線偏振光。它們是利用反射與折射，雙折射和二向色性（或稱選擇吸收）的原理制成的。23利用反射與折射產

37、生偏振光的元件由片堆組成；利折射產生偏光的元件由兩塊晶軸方向不同的晶體棱鏡膠合而成。這兩種方造成本比較高。最常用的則是利用二向色性材料產生偏振光。例如：把一片清潔的聚乙烯醇薄膜浸在碘溶液里，在較高的溫度下拉伸，取出后烘干制成偏振薄膜，把其膠合在兩塊平行度都較好的薄玻璃中，就成為了一塊偏振片。下圖形象地表示了自然光轉換成直線偏振光的示意圖：同樣的偏振片所處的位置不同名稱也不同，如處于聚光鏡前面的稱為起偏振片，用來產生偏振光。位于物鏡和目鏡之間的稱為驗偏振片，用于分析偏振光。雙折射各向異性材料，如：晶體，它們都具有雙折射性能。光線射入的晶體，除了同晶體的晶軸（常稱為光軸）同方向的光線不發(fā)生雙折射外

38、，其余方向的光線均產生雙折射現象。如左圖：一根光線垂直射向晶體表面進入晶體后分成兩根光線其中一根光線方向不變，垂直晶體另一表面射 出，稱 O 光；另一根光線在晶體第一表面就發(fā)生折射，然后仍垂直晶體另一表面射出，稱為 e 光。這就是雙折射。同樣，入射光線傾斜入射晶體，也會產生雙折射。 常常將 O 光，e 光的折射率差（n0-ne）作為雙折射的光量量度。若晶體厚度為 d， 則（n0-ne）d，稱為光程差。左圖為偏光顯微鏡的原理圖：圖中：1起偏振片2. 聚光鏡3. 標本244物鏡5. 驗偏振片6. 目鏡自然光經起偏振片后以直線偏振光射向聚光鏡并照明標本。若此標本是各向異性的物體，那么每根偏振光經過標

39、本后就會產生雙折射而變成兩根光線，它們再經物鏡及驗偏振片后不是單一的各向異性物體，那么標本各部位具有不同的光程差，于是涉色。成像。如果這個標本像各處呈現不同的干由色可推知光程差，若晶體厚度已知的話，則進一步推算出雙折射（n0-ne），于是可以確定標本是什么材料。起偏振片與驗偏振片的透射軸常?；?90º放置（正交），如果標本是各向同性材料，則視場中漆黑一片。如果標本是各向異性材料，那么視場將會變亮，轉動其中一個偏振片，使之再次變暗，從轉動角度可以推知標本屬于何種旋光特性材料。波片：波片是使光波經過它們后能對兩個相互垂直方向的振動增加一個固定的位相差。位相差為1/4稱為 1/4 波片，

40、位相差為 1/2稱為 1/2 波片，位相差為稱為全波片。這些組件中常常標志出快軸的方向。所謂快軸是指光波沿著快軸射率最低。與快軸互為垂直的是慢軸，該方向的折射率最高。得快，因此該方向的折1.1/4 波片1/4 波片常把直線偏振光轉換成圓偏振光。當入射的直線偏振光振動的方向與波片的快軸成45 度時，轉換成圓偏振光。其余角度為橢圓偏振光。見下圖，252.1/2 波片1/2 波片是使直線偏振光的振動方向改變。例如，當直線偏振光的振動方向與 1/2 波片的快軸為 90 度時，則位相差改變?yōu)?180 度，振動方向轉動了 90 度。見下圖：3.全波片在生物標本中，有時雙折射很弱，色常處于黑與灰黑之間，不足

41、以區(qū)分。實驗證明，當光程差在 0.50.6 微米之間，色變化最靈敏，這種場合下，可全波片，讓其附加 0.56 微米的光程差。使色艷麗地呈現出來。26補償器：補償器與波片的區(qū)別是前者相位差能連續(xù)可變，后者則是固定不變。補償器可用兩個光軸平 行的石英楔和一個與石英楔光軸垂直的石英平板組成。利用測微鼓輪可以移動一個石英楔，由此改變位相差。勃氏鏡：勃氏鏡是將物鏡的后焦面成像在目鏡的焦平面上，供目視觀察物鏡后焦面的設計成根據需要可以方便地移入光路中或移出光路。圖樣。它偏光顯微鏡除了具備上述特殊組件外，對生物顯微鏡中原有的光學組件還有特殊要求。物鏡：物鏡是由許多各向同性的光學組成。如果這些存在內應力，或者

42、有外界施加的機械力（如包邊，膠合等），就會產生雙折射，（應力）。破壞了正交的偏振狀態(tài)，所以，物鏡必須消除應力，物鏡外轂上刻有 Pol 標記以示區(qū)別。聚光鏡：與物鏡一樣，必須消除應力。工作臺：使用時，由于物體常需繞物鏡光軸旋轉，因此采用圓工作臺，其四周帶有 360 度等分的精確刻度，格值為 1 度，還帶有游標讀數，以提高讀數的精度。旋轉時，物體必須仍在目視視野中，工作臺的旋轉中心跳動量必須在 35 微米內。有時為了精確計算出光程差，物體的移動量必須高精度地度須有定量指示。因此，對 X.Y 向移動的精轉換器：物體應位于物鏡的光軸上，這樣才能保證物體移動時必須可調，越出視場。因此轉換器孔的中心雙目鏡

43、筒：對于鉸鏈式雙目鏡筒其分光膜必須具有消偏振特性，這樣才能保證改變瞳距時，左右鏡筒中的圖像的顏色和亮度不變。目鏡管帶有連構及限位裝置，改變瞳距時確保目鏡分劃板的水平線位置不變。目鏡：帶有十字分劃板，視度可調。帶有固定十字分劃板水平線的限位機構。27微分微分相襯觀察法相襯觀察法適合于觀察物體表面存在微觀高低差(1/10 波長到 1 個波長的梯度差)的位相物體?？梢园烟荻炔钚蜗蟮剞D換成浮雕形式和具有彩色對比色.且根據需要可以改變對比色。左圖為微分圖中：1起偏振片相襯法的光學原理圖2.4.6.8.屋拉斯頓棱鏡位相物體諾馬斯基棱鏡鏡筒透鏡3.5.7.9.聚光鏡物鏡驗偏振片中間象面自然光經過振動方向為

44、45°起偏振片后成為線偏振光射向屋拉斯頓棱鏡。此棱鏡由二個光軸正交且平行于入射面。出射面的雙折射晶體膠合而成。通常由石英晶體或方介石晶體制 成。一根入射線偏振光在棱鏡的膠合斜面上分離成二個振動方 向互相垂直的尋常光(O)和非常光(e),由于棱鏡位于聚光鏡的焦面上,經聚光鏡后 O 光和 e 光平行地剪切位相物體。然后經物鏡后聚焦在物鏡的后焦面上。所謂諾馬斯基棱鏡與屋拉斯頓棱鏡相仿,其差別僅僅其中一個棱鏡的光軸與出射面成一定的角度.目的使 O,e 光的交點移出,棱鏡膠合面使它與物鏡后焦面重合.這樣,O,e 光經此棱鏡后,O 光變 e 光,e 光變 O 光,但又合二為一.但振動方向不在同一

45、平面上,因此無法.為此在其后方向安置一塊振動方向為 45°的驗偏振片,使 O,e 光在同一振動面內.相干成象于顯微鏡的中間象面。綜上所述,聚光鏡,物鏡必須消除應力。實際情況是無數對 O,e 光在物鏡后焦面一個傾斜的平面,因此棱鏡 6 也傾斜一定的角度。橫向移動棱鏡 6 可以改變光程差,來改變對比色。下列圖片是用微分相襯的標本圖像:28熒光觀察法熒光觀察法在醫(yī)學領域有著廣泛的用途，如免疫學研究的對象是抗原和抗體的反應問題，由 于抗體反應的高度特異性，所以當抗原體發(fā)生反應時，只要知道其中一個因子，也就可以知道 另一個因子。但是這個過程必須通過染色，熒光染色劑就應運而生。由于熒光染色的色素

46、只需極稀的濃度便能使激發(fā)出明亮的熒光。因而，染色后 體（或抗原）原有的特異活性。其光學原理示意圖如下，以藍光激發(fā)為例：破壞抗殘余藍光紫外光紫光 藍光 綠光 黃光 紅光紅外光藍光黃光黃光激發(fā)濾光片熒光標本截止濾光片光源發(fā)出多種波長的光線，經激發(fā)濾光片后只能通過某種單色的激發(fā)光，熒光標本在激發(fā)光作用下，激發(fā)出某種特定的顏色光（熒光）。由于被激發(fā)的熒光能量很弱，只能在景才易于觀察到，所以增加了抑制濾光片使殘余的激發(fā)光不能通過。的背早期的熒光觀察采用透射照明，它有很大的缺陷，當激發(fā)光透過標本組織時，很大部分的 光線被衰減掉，到達我們需觀察的標本上表面時，只能激發(fā)出微弱的熒光。近代的熒光觀察采用落射照明

47、，如下圖所示：29圖中 ：1光源2. 激發(fā)濾光片3. 物鏡4. 標本5. 二向性分光鏡6. 抑制濾光片光源7. 目鏡根據不同的激發(fā)光需要，可以選用三種光源，鹵素燈，高壓燈和氙燈。下圖列出菲利浦公司高壓燈和氙燈的光譜特性曲線。高壓 燈光譜特性氙燈光譜特性由圖知，高壓 燈是線狀光譜，對于某些波長光線有很高的強度，它適用很多染色法。30氙燈在 300800nm 波長內幾乎可以看作連續(xù)光譜，雖然是某些波長的強度不如 燈，但它適用于所有熒光染色法。鹵素燈也是連續(xù)光譜，它在藍光，綠光處也有較高的強度（但遠低于 燈，氙燈）因此，對于只用藍光，綠光激發(fā)的簡易熒光顯微鏡可以選用鹵素燈。通常采用 50W燈，100

48、W燈 75W 氙燈及 100W 鹵素燈作熒光光源。圖中物鏡既起成象作用，又起聚光鏡作用。為了獲得很好的觀察效果，在熒光很微弱的場合如細菌發(fā)出的熒光。建議采用大數值孔徑物鏡，如的熒石物鏡，平場復消色差物鏡。正因為物鏡又兼聚光鏡作用，所以物鏡中材料，透鏡間膠合劑，以及浸油必須確保在激發(fā)光下自發(fā)熒光。為了使用方便，常將激發(fā)濾光片，二向性分光鏡及抑制濾光片組一個模塊。對于不同的熒光染色法，必須選用合適的模塊才能得到滿意的結果。所謂二向性分光鏡對激發(fā)光具有高 反射率，而對激發(fā)出的熒光具有高透過率。常用模塊至少四種：zzzz近紫外光激發(fā)模塊紫光激發(fā)模塊藍光激發(fā)模塊綠光激發(fā)模塊UV V BG這些模塊對應著不

49、同染色法，如 B 模塊常用 FITC 染色法，G 模塊常用羅達明 B200 染色法。必須特別指出，激發(fā)光的波段曲線絕對不能與抑制光的波段曲線部分重迭，否則，視場中的背景光全部是激發(fā)光的顏色,而微弱的熒光完全被掩蓋住,正如白天天空中無法看到星光一 樣。1激發(fā)光2抑制光1激發(fā)光2抑制光31藍光激發(fā)如用 FITC 染色法,它的激發(fā)波段為 480490nm,被激發(fā)的熒光波長為 510nm。由圖知,無論激發(fā)光或抑制光在 500 nm 處均截止,無相交重迭，所以殘留的激發(fā)光無法通過截止濾光片,視場背景是的,而熒光則可順利地透過截止濾光片，形成熒光圖像。公司設置了許多模塊,供不同的染色法選用。注意:許多熒光

50、標本無法長期保存,特別在激發(fā)光照射下,熒光很快消失,所以在停止觀察時,應該將激發(fā)光擋住,但是 燈開啟到熄滅后,第二次再啟動時,必須待燈源冷卻后才能進行。為此,須在模塊前設置一擋板,可隨時關閉,開啟。32濾光片模塊代號激發(fā)光范圍激發(fā)濾光片二向性分光鏡截止濾光片A D E4 H3 I3 K3 L4 M2N2.1 TXG/R B/G/R紫外光紫外光+紫光藍光藍光藍光藍光藍光綠光綠光綠光藍光/綠光紫外光/藍光/綠光BP340-380 BP355-425 BP436/7 BP420-490 BP450-490 BP470-490 BP450-490 BP546/14 BP515-560 BP530-59

51、5 BP490/20 BP575/30 BP400/20 BP495/15 BP570/30RKP400 RKP455 RKP455 RKP510 RKP510 RKP510 RKP510 RKP580 RKP580 RKP600 RKP505 RKP600 RKP415 RKP510 RKP590LP425 LP470 LP470 LP515 LP515 LP515 BP515-560 LP590 LP590 LP615 BP525/20 BP635/40 BP530/30 BP640/40 BP610/75熒光顯微鏡標本圖像(藍光激發(fā))標本圖像(綠光激發(fā))33熒光模塊標本圖像(紫外光激發(fā))標本圖像(藍光+紫外光激發(fā))調 制 對 比 觀 察 法調制對比觀察法適合于觀察表面具有微觀高低差的物體。它與微分相襯情況類似，也能把物體以立體的浮雕象呈現出來。但成像原理完全不同。它是把物體中存在的幾何梯度差，所導致光學梯度差產生的光強，人為地調制成比背景亮，而另一側調制成