雙光子熒光概述.課件

1、Has not been difficult, then does not have attains 雙光子熒光雙光子熒光（Two-photon fluorescence） 組員：樊艷萍 孟 箏 賈曉波 白秋紅 2015.10.22Has not been difficult, then does not have attains 目目 錄錄1.1.研究背景研究背景2.2.基本原理基本原理 3.3.特點及優(yōu)點特點及優(yōu)點4.4.應(yīng)應(yīng) 用用Has not been difficult, then does not have attains 1 雙光子熒光背景介紹 雙光子吸收是指在強光激發(fā)下,介質(zhì)分

2、子同時吸收兩個光子,從基態(tài)躍遷到兩倍光子能量的激發(fā)態(tài)的過程。 早在1931年, Gppert Mayer 就在理論上預(yù)言了雙光子吸收的存在。 直到上世紀(jì)60年代初激光器出現(xiàn)后,才由Kaiser等首先從實驗上證實了雙光子吸收過程。然而,由于一般材料的雙光子吸收截面很小,雙光子吸收的實際應(yīng)用受到限制,使雙光子吸收研究一直停留在基礎(chǔ)研究水平。Has not been difficult, then does not have attains 1990年,美國康奈爾大學(xué)Denk等提出將雙光子激發(fā)現(xiàn)象應(yīng)用到共焦激光掃描顯微鏡中,開辟了雙光子熒光顯微和成像這個嶄新的領(lǐng)域。 Has not been dif

3、ficult, then does not have attains 近年來,有機雙光子吸收材料在諸多領(lǐng)域,尤其是雙光子熒光顯微和成像中的應(yīng)用得到了廣泛的關(guān)注。設(shè)計和合成雙光子吸收截面大和上轉(zhuǎn)換熒光強的有機分子能大大促進雙光子熒光顯微成像在生物系統(tǒng)中的應(yīng)用,包括單分子檢測、免疫測定、DNA片斷測定、化學(xué)和生物傳感器、生物微芯片、毛細管分離檢測等。 在大量的實驗和理論研究基礎(chǔ)上,人們總結(jié)出有機雙光子吸收材料的一些結(jié)構(gòu)-性能關(guān)系,提出了許多行之有效的設(shè)計及合成策略,大大推動了雙光子吸收應(yīng)用的發(fā)展。Has not been difficult, then does not have attains

4、2 2 雙光子熒光基本原理雙光子熒光基本原理2.1 2.1 單、雙光子熒光的介紹單、雙光子熒光的介紹 在一般的熒光現(xiàn)象中，由于激發(fā)光的光子密度低，一個熒光分子只能同時吸收一個光子，再通過輻射躍遷發(fā)射一個熒光光子 ，就是單光子熒光。Has not been difficult, then does not have attains 與單光子相比，雙光子激發(fā)過程就是基態(tài)熒光分子或原子同時吸收兩個光子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，通過弛豫過程，輻射出頻率略小于兩倍入射光頻率的熒光光子。比如對NADH酶，在單光子激發(fā)情形下，需在350 nm的光激發(fā)下產(chǎn)生450nm 的熒光。而在雙光子激發(fā)情形下，可采用光損傷較小的紅外

5、或近紅外光，如700nm 的激光來激發(fā)得到的450 nm熒光。Has not been difficult, then does not have attains 2.2 雙光子吸收的示雙光子吸收的示意圖意圖 圖(a)為單光子激發(fā)過程。在激光照射下，基態(tài)分子或原子吸收一個光子后成為激發(fā)態(tài) ，隨后又弛豫到某一基態(tài)，同時以光子形式釋放能量而發(fā)出熒光。這一過程就是單光子激發(fā)。 當(dāng)使用光波長為圖(a)中激發(fā)光波長兩倍的光，對相同物質(zhì)進行激發(fā)時，由于所使用光波的光子能量僅為原來的一半，無法通過單光子過程使基態(tài)電子激發(fā)到激發(fā)態(tài)。只有在光子密度極高的情況下，基態(tài)的電子可以同時吸收兩個光子，使處于基態(tài)的電子躍

6、遷至激發(fā)態(tài)，這種現(xiàn)象如圖 (b)所示。 Has not been difficult, then does not have attains 圖2a 雙光子吸收 圖2b 單光子吸收 S 單重態(tài)能級 T 三重態(tài)能級V 虛擬中間態(tài) hv 吸收光能量Fl 熒光 Ph 磷光 系間竄越熒光物質(zhì)在吸收了與其能級結(jié)構(gòu)匹配的能量后，電子由基態(tài)S0被激發(fā)至激發(fā)態(tài)S1，經(jīng)過輻射躍遷后電子又回到基態(tài)S0，這一過程中發(fā)射出熒光。與單光子熒光不同，雙光子吸收過程中，基態(tài)與激發(fā)態(tài)之間存在一個虛能態(tài)虛能態(tài), 通過兩個光子的能量進行疊加而使處于基態(tài)的電子達到激發(fā)態(tài)。 Has not been difficult, then

7、does not have attains 雙光子熒光產(chǎn)生原理雙光子熒光產(chǎn)生原理：熒光分子吸收第一個光子后，躍遷到虛能級上，該能級僅能存在幾飛秒，便自動返回基態(tài)，第二個光子必須在這幾飛秒內(nèi)與虛能級上的分子作用，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，能量較大的激發(fā)態(tài)分子,通過內(nèi)轉(zhuǎn)換使自己回到最低電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級。處于此能級的分子不是通過內(nèi)轉(zhuǎn)換的方式來消耗能量，回到基態(tài)，而是通過發(fā)射出相應(yīng)的光量子來釋放能量，回到基態(tài)的各個不同的振動能級時，就發(fā)射熒光。Has not been difficult, then does not have attains 3 3 雙光子熒光的特點及優(yōu)點雙光子熒光的特點及優(yōu)點 3

8、.1 特點：(1)雙光子吸收的輻射光源一般在可見-近紅外區(qū)(800nm)；(2)雙光子吸收的強度與激發(fā)光強的平方成正比，是一種非線性吸收，熒光強度比單光子吸收強；Has not been difficult, then does not have attains 3.2 優(yōu)點(1)由于激發(fā)光源波長較長，受光散射影響較小，使得入射光的損耗較小，在介質(zhì)中的穿透性較好；Has not been difficult, then does not have attains 3.2 優(yōu)點 (2)雙光子熒光使用紅外激光作為激發(fā)光源，能大大地降低生物組織對激發(fā)光的吸收，可獲得較強的樣品熒光；Has not b

9、een difficult, then does not have attains 3.2 優(yōu)點 (3)長波長光源作為雙光子熒光的激發(fā)光源，可以避免樣品中激發(fā)波長較低的自發(fā)熒光物質(zhì)的干擾；Has not been difficult, then does not have attains 3.2 優(yōu)點 (4)雙光子熒光可以避免普通熒光成像中的熒光漂白問題和對生物細胞的光致毒問題；Has not been difficult, then does not have attains 3.2 優(yōu)點 (5)雙光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性，有利于對生物組織中一些特殊物質(zhì)進行成像研究，廣泛應(yīng)用于生物活體檢

10、測中。Has not been difficult, then does not have attains 4 雙光子熒光應(yīng)用雙光子熒光探針雙光子熒光顯微成像Has not been difficult, then does not have attains 雙光子熒光探針設(shè)計原理探針分子組成：一是熒光團；二是離子團或稱作受體作用機制： 1、一是分子內(nèi)電荷遷移機理（ICT） 2、二是光誘導(dǎo)電子遷移過程（PET） 3、共振能量遷移(RET) 4、集團轉(zhuǎn)換（GC）Has not been difficult, then does not have attains 雙光子熒光探針的種類陽離子探針 鎂

11、離子探針，由pond等在2004年合成，這些探針對離子的選擇性差，在水中不能絡(luò)合鎂離子 鈣離子探針，由Kim等在2004年合成,是ICT探針，在水中不能絡(luò)合鈣離子，不能用于熒光顯微鏡 基于ICT鉛離子探針，由Ahn在2005年合成，鋅離子有干擾作用，不能在水中應(yīng)用 基于RET鉛離子探針，探針絡(luò)合了鉛離子后，熒光增強5倍，探針的選擇性比較好，唯一的干擾是鋁離子。但由于水溶性差，不能在水中絡(luò)合鉛離子。Has not been difficult, then does not have attains 雙光子熒光探針的種類陰離子探針陰離子探針 氟離子探針，Liu等報道了3個類似的探針分子。此類探針尚

12、不能在水中識別氟離子但為雙光子陰離子探針的設(shè)計提供了一個范例。雙光子雙光子pHpH探針探針 werts等合成了雙光子pH探針，是唯一成功用于雙光子顯微鏡的雙光子探針。Has not been difficult, then does not have attains 雙光子熒光探針的研究領(lǐng)域雙光子葡萄糖示蹤器 具有良好的光穩(wěn)定性，能夠持續(xù)監(jiān)控正常細胞與結(jié)腸癌細胞攝入葡萄糖的過程，能夠成像觀察癌細胞與結(jié)腸癌深處抗癌劑的能力，為癌癥的早期診斷提供幫助雙光子巰基探針 根據(jù)探針與巰基反應(yīng)后熒光增強，可用雙光子顯微鏡探測活體細胞與組織90-180m深處的巰基成像情況雙光子半胱氨酸探針 根據(jù)醛基（sp2）

13、與半胱氨酸反應(yīng)后轉(zhuǎn)變?yōu)槭寮谆?sp3)而喪失吸電子效應(yīng)這一原理實現(xiàn)雙光子生物標(biāo)記探針 可用于生物免疫熒光標(biāo)記，具有很好的靈敏性Has not been difficult, then does not have attains 雙光子熒光探針的研究領(lǐng)域可研究離子的含量及其對生理的影響離子參與的生理活動機制離子與分子的作用特定分子的分布及其相互作用等這對生命奧秘的揭示、臨床診斷以及藥物篩選等領(lǐng)域的發(fā)展具有重要的意義Has not been difficult, then does not have attains 雙光子誘導(dǎo)發(fā)射熒光 (TPF)探針線粒體成像3-（1-羥乙基羥乙基-4-烯基吡啶碘

14、鹽）烯基吡啶碘鹽） -N-正丁基咔唑（正丁基咔唑（ 9B-HVC ）水溶液中本質(zhì)上）水溶液中本質(zhì)上是非熒光的，僅僅在線粒體環(huán)境中積累就會發(fā)出熒光。是非熒光的，僅僅在線粒體環(huán)境中積累就會發(fā)出熒光。 9B-HVC是一種潛在的是一種潛在的線粒體雙光子熒光探針。線粒體雙光子熒光探針。9B-HVCMTO合并合并Has not been difficult, then does not have attains 雙光子熒光顯微成像雙光子熒光顯微鏡：雙光子熒光顯微鏡通過對樣品在雙光子激發(fā)后發(fā)出的熒光進行探測，實現(xiàn)樣品的三維成像?？梢詫ι飿悠穼崟r在體監(jiān)測，已成為研究細胞結(jié)構(gòu)和功能檢測的重要工具。Has no

15、t been difficult, then does not have attains 雙光子共焦激光掃描熒光顯微鏡是以光學(xué)系統(tǒng)的共焦成像為基礎(chǔ),利用光掃描技術(shù)和樣品掃描技術(shù)對樣品進行三維動態(tài)測量的裝置.共焦小孔的存在,探測器只接收來自物鏡焦點處的信息,焦點以外的光將全被共焦小孔屏蔽Has not been difficult, then does not have attains 雙光子共焦激光掃描熒光顯微鏡的應(yīng)用三維高密度存儲及微細加工-由于雙光子激發(fā)具有有效作用體積小的特點,避免了層與層間的相互干擾,極大地提高了數(shù)據(jù)存儲密度.鈣離子通道的觀察-貝爾實驗室研究了活體大腦皮層神經(jīng)元細胞內(nèi)的

16、鈣離子動力學(xué)情形. 對活老鼠大腦作標(biāo)記后,撥弄老鼠的胡須以產(chǎn)生刺激,觀察到發(fā)生在大腦細胞神經(jīng)元間突觸的活動,成像深度可深達大腦240m。applicationHas not been difficult, then does not have attains 雙光子共焦激光掃描熒光顯微鏡的應(yīng)用利用雙光子微細加工方法得到的三維微細結(jié)構(gòu)圖Has not been difficult, then does not have attains 雙光子熒光顯微圖像通過雙光子顯微鏡拍攝的真皮圖像 綠色：膠原蛋白 紅色：彈性蛋白Has not been difficult, then does not have attains 雙光子近紅外熒光成像圖Has not been difficult, then does not have attains 雙光子吸收在微納米加工中的應(yīng)用世界上最小的動物模型：納米牛Has not been difficult, then does not have attains 世界上最小的微納機械A(chǔ)ppl Phys Lett, 2001, 78(2): 249251雙光子吸收在微納米加工中的應(yīng)用Has not bee