液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的原理及在藥學(xué)研究中的應(yīng)用1

1、液質(zhì)聯(lián)用的原理及在藥學(xué)研究中的應(yīng)用張明 Ph.D 2016.08北京潤德康醫(yī)藥技術(shù)有限公司目錄一、液質(zhì)聯(lián)用的原理二、液質(zhì)聯(lián)用的應(yīng)用 LC: 液湘色譜儀 一種能夠把液體混合物中的不同組分根據(jù)在色譜柱中保留時(shí)間不同進(jìn)行分離,檢測(cè)及收集的儀器 MS: Mass Spectrometer 質(zhì)譜儀 一種能夠把分子轉(zhuǎn)化生成帶電離子,并在氣態(tài)中根據(jù)質(zhì)荷比(m/z : m質(zhì)量 z分子所帶電荷數(shù) )的不同把離子進(jìn)行分離并進(jìn)行檢測(cè)的儀器.一、液質(zhì)聯(lián)用的原理液質(zhì)聯(lián)用的原理液質(zhì)聯(lián)用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)：不揮發(fā)性化合物分析測(cè)定，極性化合物的分析測(cè)定，熱不穩(wěn)定化合物的分析測(cè)定，大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）

2、的分析測(cè)定用液相或注射泵將樣品注 入質(zhì)譜.1. 樣品注入樣品注入樣品在離子源內(nèi)電離,帶電離子在接口內(nèi)進(jìn)行去溶劑,聚集,冷卻進(jìn)入質(zhì)量分析器2. 離子化離子化四極桿用于傳輸離子或選擇母離子和子離子,.離子通過聚焦和傳輸進(jìn)入下一組四極桿3. 質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器四極桿四極桿檢測(cè)器記錄離子的信號(hào). 然后將信號(hào)傳輸?shù)诫娔X繪制成色譜圖. 4. 離子檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析離子檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析Q0Q1Q3DFCEMORSKEXIT Q2 (LINAC)5.真空系統(tǒng)真空系統(tǒng) 連續(xù)注射連續(xù)注射 樣品放在注射器中或靜態(tài)的針內(nèi) 用注射泵或電場引力, 樣品流連續(xù)并恒定地流入離子源噴口通常用于安裝時(shí)調(diào)諧通常用于安裝時(shí)調(diào)諧, 質(zhì)量校

3、正質(zhì)量校正 和標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)譜方法的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)譜方法的優(yōu)化 流動(dòng)注射分析流動(dòng)注射分析 用手動(dòng)進(jìn)樣器和液相泵,注入樣品,由流動(dòng)相帶入離子源噴口通常安裝通常安裝5ul的定量環(huán)的定量環(huán) 液質(zhì)聯(lián)用液質(zhì)聯(lián)用 用液相的泵,流速從 nL/min 到 mL/min 樣品可能是純品或者是混合物 流動(dòng)相帶著樣品經(jīng)過色譜柱分離后進(jìn)入質(zhì)譜的離子源1、樣品注入2、離子源 大氣壓電離（API）（包括大氣壓電噴霧電離ESI、大氣壓化學(xué)電離APCI、大氣壓光電離APPI）ESI 為電噴霧，即樣品先帶電再噴霧，帶電液滴在去溶劑化過程中形成樣品離子，從而被檢測(cè)，對(duì)于極性大的樣品效果好一些；APCI 為大氣壓力化學(xué)電離源，樣品先

4、形成霧，然后電暈放電針對(duì)其放電，在高壓電弧中，樣品被電離，然后去溶劑化形成離子，最后檢測(cè)，對(duì)極性小的樣品效果較好。APPI：大氣壓光電離源，適用于弱極性的化合物，如多環(huán)芳烴等2.1 ESI離子源 ESI 為電噴霧，即樣品先帶電再噴霧，帶電液滴在去溶劑化過程中形成樣品離子，從而被檢測(cè)，對(duì)于極性大的樣品效果好一些； 電噴霧電離源是一種軟電離方式，即便是分子量大，穩(wěn)定性差的化合物，也不會(huì)在電離過程中發(fā)生分解，它適合于分析極性強(qiáng)的大分子有機(jī)化合物，如蛋白質(zhì)、肽、糖等。電噴霧電離源的最大特點(diǎn)是容易形成多電荷離子。目前采用電噴霧電離，可以測(cè)量分子量在300000Da以上的蛋白質(zhì) APCI 為大氣壓力化學(xué)電

5、離源，樣品先形成霧，然后電暈放電針對(duì)其放電，在高壓電弧中，樣品被電離，然后去溶劑化形成離子，最后檢測(cè)，對(duì)極性小的樣品效果較好。 有些分析物由于結(jié)構(gòu)和極性方面的原因，用ESI不能產(chǎn)生足夠強(qiáng)的離子，可以采用APCI方式增加離子產(chǎn)率，可以認(rèn)為APCI是ESI的補(bǔ)充。APCI主要產(chǎn)生的是單電荷離子，所以分析的化合物分子量一般小于1000Da。用這種電離源得到的質(zhì)譜很少有碎片離子，主要是準(zhǔn)分子離子。2.2 APCI離子源 API-MS的特點(diǎn)是可以和液相色譜、毛細(xì)管電泳等分離手段聯(lián)用，擴(kuò)展了應(yīng)用范圍，包括藥物代謝、臨床和法醫(yī)學(xué)、環(huán)境分析、食品檢驗(yàn)、組合化學(xué)、有機(jī)化學(xué)的應(yīng)用等；大氣壓電噴霧質(zhì)譜應(yīng)用范圍大氣壓

6、電噴霧質(zhì)譜應(yīng)用范圍大氣壓電噴霧源大氣壓電噴霧源大氣壓化學(xué)源大氣壓化學(xué)源分子量分子量化合物極性化合物極性1000100,00010,000非極性非極性極性化合物極性化合物氣相色譜氣相色譜/質(zhì)譜質(zhì)譜3、 質(zhì)量分析器-四級(jí)桿（ quadrupole mass spectrometer）不穩(wěn)定的離子不穩(wěn)定的離子穩(wěn)定的離子穩(wěn)定的離子離子源離子源檢測(cè)器檢測(cè)器直流和交流控制電信號(hào)直流和交流控制電信號(hào)ABBA To Detector去檢測(cè)器去檢測(cè)器AABBRF only-A rods & B rodsare 180 out of phase只加交流信號(hào)只加交流信號(hào)-A桿與桿與B桿上桿上加的電壓強(qiáng)度相同

7、加的電壓強(qiáng)度相同,相位差相位差180度度離子在四極桿中的穩(wěn)定性4、 離子檢測(cè) MS/MS 必須通過連續(xù)放置多個(gè)分析器來實(shí) 現(xiàn)空間串聯(lián)的多級(jí)質(zhì)譜分析。 對(duì)于QQQ，每個(gè)分析器有以下單獨(dú)的作用： 第一個(gè)四極桿(Q1)根據(jù)設(shè)定的質(zhì)荷比范圍掃描和選擇所需的離 子。 第二個(gè)四極桿(Q2) ，也稱碰撞池，用于聚集和傳送離子。在所選擇離子的飛行途中，引入碰撞氣體，例如氮?dú)獾取?第三個(gè)四極桿(Q3)用于分析在碰撞池中產(chǎn)生的碎片離子。三重四極桿基本功能Q1 可以篩選母離子 mz1Q2 通過碰撞碎裂打碎離子，形成碎片離子峰Q3 篩選子離子，定量子離子碎片強(qiáng)度 mz2三重四極桿工作模式模式Q1 掃描Q1掃描離子Q2

8、不打碎，傳輸Q3無分辨，傳輸用途和特點(diǎn)了解樣品基本信息子離子掃描固定過濾母離子打碎母離子掃描子離子研究母離子的結(jié)構(gòu)特征母離子掃描掃描母離子打碎母離子固定過濾子離子篩選具有特征子離子（結(jié)構(gòu)）的分子中性丟失單離子監(jiān)視 SIM多反應(yīng)檢測(cè)MRM掃描母離子按表過濾離子按表過濾母離子打碎離子不打碎，傳輸打碎母離子掃描子離子，與母離子有特征差異無分辨，傳輸按表過濾子離子篩選具有特征結(jié)構(gòu)的分子，此結(jié)構(gòu)不易形成子離子定量定量，假陽性低QQQ多級(jí)質(zhì)譜：子離子掃描 Q1選擇了某一特定質(zhì)量的母離子，Q2碰撞池產(chǎn)生碎片離子，然后在Q3中分析。此過程產(chǎn)生典型的質(zhì)譜質(zhì)譜碎片譜圖。第一個(gè)四極桿在選擇性離子監(jiān)測(cè)模式，第二個(gè)在全

9、掃描監(jiān)測(cè)模式QQQ多級(jí)質(zhì)譜：母離子掃描 在母離子掃描中，Q1測(cè)定母離子，Q3測(cè)定某個(gè)特定的碎片離子，因此可在非常復(fù)雜的混合物中監(jiān)測(cè)某種特定的分子。 在下面的例子中，睪丸激素在母碎片（m/z 367）中碎片m/z 97得到選擇性監(jiān)測(cè)，具有極高的靈敏度和精確的定量分析。QQQ多級(jí)質(zhì)譜：中性丟失掃描l 在QQQ中進(jìn)行中性丟失掃描，Q1和Q3分析器的結(jié)合使靈敏度 和選擇性得到最大化。Q1/Q3中性丟失掃描可監(jiān)測(cè)母離子特定的中性丟失，例如縮氨酸磷酸鹽中一個(gè)磷酸根的丟失。在這個(gè)例子中，Q1和Q3的掃描得到母離子的譜圖，這張譜圖是母離子為了磷酸化，丟失了碎片98而得到的QQQ多級(jí)質(zhì)譜：單個(gè)反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)

10、l 選擇某一質(zhì)量的母離子，Q2碰撞單元產(chǎn)生碎片離子。Q3只分析一個(gè)碎片離子。此過程產(chǎn)生一個(gè)簡單的單個(gè)離子碎片譜圖QQQ多級(jí)質(zhì)譜：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)l Q1選擇某一質(zhì)量的母離子，碰撞單元產(chǎn)生碎片離子。Q3用于搜尋多個(gè)選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)，這就是多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。MRM 假陽性率較低的原因利用母離子和子離子的共同特征，定量選擇性提高例如：如果樣品 A 母離子 697 和樣品 B542 在打碎后都具有子離子 245如果直接以特征離子 245 定量 A697 ，那么樣品 B 就會(huì)對(duì)樣品 A 的定量造成干擾而利用離子對(duì) 697-245 定量， B542 在 A697 通過 Q1 時(shí)無法通過 Q1 ，這樣就排除了B

11、542 的干擾697EI245542三重四極桿與其他液相/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的比較質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的比較 在質(zhì)譜應(yīng)用領(lǐng)域里三重四極桿是最靈敏和定量重現(xiàn)性最好 的儀器。 在質(zhì)譜應(yīng)用領(lǐng)域里三重四極桿在執(zhí)行中性丟失掃描和母子掃描模 式具有最好的靈敏性和準(zhǔn)確性。 三重四極桿不是最好的獲取質(zhì)譜圖的儀器，平行測(cè)量的質(zhì)譜系統(tǒng) 會(huì)更好些： 三重四極桿質(zhì)譜/質(zhì)譜不如離子阱質(zhì)譜儀（ TRAPS ）靈敏（定性） 三重四極桿質(zhì)譜不如飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（TOF）所獲取的質(zhì)譜圖那么 有說服力（定性）二、LC-MS/MS應(yīng)用 高效液相色譜分離化合物范圍廣泛，準(zhǔn)確度高，對(duì)化合物破壞性小。 質(zhì)譜靈敏度高，對(duì)未知化合物的結(jié)果分析定性準(zhǔn)確，對(duì)被

12、測(cè)定化合物和形影標(biāo)準(zhǔn)樣品的了解要求較低。 將HPLC的高效分離能力與MS高專屬性高靈敏度檢測(cè)功能結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定性和定量分析。優(yōu)點(diǎn)： 測(cè)定準(zhǔn)確分子量，其他技術(shù)無法比。 靈敏度高，常規(guī)10-710-8g，單離子檢測(cè)可達(dá)10-12g 分析速度快 便于分離、分析混合物其他技術(shù)無法勝任 廣泛適用于各類化合物局限性： 異構(gòu)體、立體化學(xué)區(qū)分能力差 重復(fù)性差，需專人操作 離子源產(chǎn)生記憶效應(yīng)、污染等。 價(jià)格貴，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求高。 醫(yī)藥學(xué)：藥物代謝、藥動(dòng)學(xué)、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析 生物化學(xué)：多肽、蛋白質(zhì)、核酸、糖 環(huán)境化學(xué)：農(nóng)藥、農(nóng)殘分析、有機(jī)物污染、土壤/食品/水分析 臨床醫(yī)學(xué)：新

13、生兒檢查、糖化血紅蛋白、血紅蛋白變異、膽酸 食品科學(xué)：香料、添加劑、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物 法醫(yī)學(xué)：濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測(cè) 化學(xué)：合成、表面活性劑、染料在藥品研發(fā)中的應(yīng)用 藥物研發(fā)、生產(chǎn)過程中，微量雜質(zhì)和副產(chǎn)物的定性鑒定。 潛在基因毒雜質(zhì)的定量分析。 LC-MS分析條件的選擇考慮兩個(gè)因素： 1、使分析樣品得到最佳分離條件 2、得到最佳電離條件以獲得更好的靈敏度 當(dāng)進(jìn)行單離子檢測(cè)時(shí)，如果沒有介質(zhì)效應(yīng)，不用將物質(zhì)完全分開便可以檢測(cè)，這樣既減少了分析時(shí)間，也可以降低分析難度，尤其是在進(jìn)行大量體內(nèi)藥物分析時(shí)可以考慮。影響LC/MS測(cè)定的因素pH影響 檢測(cè)正離子，酸化樣品 檢測(cè)負(fù)離子，堿化樣品常用

14、的pH調(diào)節(jié)溶劑 乙酸 pH 34 甲酸 pH 23 三氟乙酸 pH 12 氨水溶液 甲酸銨 乙酸銨溶液和緩沖劑的組成ESI離子源APCI源以上均可用不適合：不揮發(fā)性鹽：磷酸及鹽、硼酸及鹽、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉、強(qiáng)離子對(duì)試劑等常用常用可用可用不適合不適合甲醇丙醇苯乙腈丁醇甲苯異丙醇二氯甲烷烷烴丙酮三氯甲烷環(huán)烷烴乙醇水四氯化碳樣品濃度的影響樣品濃度過低：檢測(cè)不出樣品濃度過高： 污染離子源、儀器管路（特別是表明活性劑） 產(chǎn)生簇離子或多聚體-譜圖復(fù)雜化 產(chǎn)生空間電荷效應(yīng)-譜圖歧變2、基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect）是由于樣品中存在干擾物質(zhì)，對(duì)響應(yīng)造成直接或間接的影響。LC-MS分析時(shí)

15、，內(nèi)源性物質(zhì)使待測(cè)物的離子化效率降低或者增強(qiáng)。 產(chǎn)生原因：待測(cè)組分與樣品中基質(zhì)成分在霧滴表面離子化過程的競爭。結(jié)果顯著的降低或增強(qiáng)目標(biāo)離子的生成效率及離子強(qiáng)度，進(jìn)而影響測(cè)定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。使得信號(hào)的響應(yīng)值產(chǎn)生較大變異。 LC-MS分析時(shí)基質(zhì)效應(yīng)客觀存在，并隨樣品不同而不同。影響基質(zhì)效應(yīng)的因素很多，如樣品、基質(zhì)、樣品前處理過程、色譜條件、色譜分離效果、流動(dòng)相、離子化等。 優(yōu)化色譜條件 改進(jìn)前處理方法純化樣品 改變離子化方式 內(nèi)標(biāo)定量法樣品前處理 過濾 （0.45um濾膜）、超濾（3K、10K、30K等） 溶劑萃?。ㄈコs質(zhì)Na+、K+等） 高速離心（去除不溶物） 透析（常用于蛋白純化、除鹽

16、） 固相萃?。ǔs質(zhì)、鹽、濃縮樣品、更換溶劑等） 分子篩（常用于蛋白純化） 色譜分離（正相、反相、親和）聯(lián)用時(shí)的主要問題 難揮發(fā)和/或不穩(wěn)定樣品的離子化 流速不兼容 流動(dòng)相不兼容：不揮發(fā)緩沖鹽、添加劑等APCI-LC/MS氨基甲酸鹽類化合物的分析氨基甲酸鹽類化合物的分析mAUmin51015202520406080UV 254 nmTomato extract spiked with 11 carbamatesNorm.4000080000120000EIC m/z 222MS TICcarbofuran 藥物中的雜質(zhì)含量低、來源廣、結(jié)構(gòu)多與主成分類似，必須選擇合適的分析技術(shù)進(jìn)行研究。 LC-MS 聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高選擇性、