綜合性實驗植物DNA的提取及電泳

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上本科學生綜合性實驗報告學號： 姓 名： 劉云謠 學院： 生命科學學院 專業(yè)、班級： 12生物技術 實驗課程名稱：植物DNA提取質量檢測及特定基因片段操作 教 師： 郝大海 開 課 學 期： 2014 至 2015 學年 上 學期 云南師范大學教務處編印實驗序號一實驗名稱植物DNA提取質量檢測及特定基因片段操作實驗時間第十五周實驗室睿智3-428一、 實驗目的1、了解植物DNA提取方法，熟悉操作步驟2、掌握植物大分子操作注意事項及試劑用具準備方法3、掌握DNA質量紫外分光光度計檢測方法4、了解PCR原理，熟悉操作步驟5、掌握核酸的瓊脂糖電泳檢測方法 二、實驗原理1、DN

2、A提取的原則：（1）保證DNA一級結構的完整性（2）排除其它分子的污染RNA、蛋白質、多糖等2、在濃氯化鈉溶液(12mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化鈉溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來.3、分離得到核蛋白后,需進一步將蛋白等雜質除去,常采用的去除蛋白的方法有3種:（1）、用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液,使其乳化,然后離心除去變性蛋白質,此時蛋白質凝膠停留在水相和氯仿相中間,而DNA溶于上層水相.用兩倍體積95%乙醇溶

3、液將DNA鈉鹽沉淀出來.如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀,得到的是游離的DNA.（2）、用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質變性,與核酸分離,從而從材料中直接提取出DNA.（3）、用苯酚處理,然后離心分層,DNA或溶于上層水相,或存在于中間殘留物中,蛋白變性后則停留在酚層內.吸出上面水層,將其注入兩倍體積的95%乙醇溶液中,得到白色纖維狀DNA沉淀4、DNA提取方法：（1）CTAB法原理：CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。在高鹽溶液中（>0.7mol/L NaCl），該復合物可溶。之后用有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質，最后

4、在上清液中加入乙醇沉淀DNA。注意CTAB溶液在低于15 時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于15。（2）SDS法SDS 陰離子去垢劑在高溫（5565）下裂解細胞，蛋白變性，染色體離析，在高鹽(KAc或NH4Ac) 或降低溫度（冰?。┦沟鞍踪|及多糖雜質沉淀，之后上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，最后乙醇沉淀水相中的DNA。5、DNA質量檢測：紫外分光光度計檢測法，嘌呤和嘧啶的母環(huán)含有共軛雙鍵，因此也有紫外吸收現象，且在260nm和280nm處也存在吸收峰。蛋白質中含苯環(huán)的氨基酸在這兩個波長下也會發(fā)生光吸收。因此，通過260nm和280nm下樣品的吸收值

5、比率可判斷核酸純度。6、瓊脂糖電泳：瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。7、PCR實驗原理聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。在待擴增的DNA片斷兩側

6、和與其兩側互補的兩個寡核苷酸引物，經變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增2n倍。PCR 反應的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應延伸三個步驟完成的。圖中設定的反應參數是94變性1min， 60 退火1min， 72 延伸1.5min。如此周而復始，重復進行，直至擴增產物的數量滿足實驗需求為止。三、實驗設備及材料（一）、儀器設備1.5ml離心管；5ml離心管；研磨棒；5ml吸頭；1000ul吸頭（盒）；200ul吸頭（盒）；10ul吸頭（盒）；5ml移液器；1000ul移液器；200ul移液器；30ul移液器；2ul移液器；試劑瓶；量筒、恒溫水浴鍋；高速離心機；紫外分光光度計

7、；電泳儀；電泳槽；酸度計；電子天平；PCR儀（二）、試劑CTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；瓊脂糖；EB；引物；dNTP；Taq酶；EB（三）、材料：馬鈴薯葉四、實驗方法步驟（一）、DNA的提?。?、取100mg新鮮葉片，置于預冷1.5ml離心管中，加入液氮，研為細粉。加入350l新鮮2×CTAB緩沖液，再仔細研磨。（CTAB用于抽提DNA）2、350l新鮮2×CTAB緩沖液，沖洗研磨棒，加入2l巰基乙醇，混勻。65水浴45分鐘，每15分鐘搖動一次。冷卻至室溫，靜置2分鐘。3、每支離心管加入700l氯仿：異戊醇（24：1）（672氯

8、仿:28異戊醇）混合液。輕柔短暫地混和，避免DNA斷裂。顛倒幾次。（氯仿、異戊醇、苯酚都用于沉淀蛋白質）4、在微型離心機中，以14，000rpm離心5分鐘。移取上層水層，置于新的、標識好的1.5ml離心管中。注意避免取到中層物質。將氯仿：異戊醇廢液倒入廢液缸。5、加入50l 10CTAB（溶于0.7M NaCl），輕柔混和，并保證混和完全。6、重復第3、第4步。7、每支離心管中加入等體積異丙醇（400500l）。上下顛倒幾次，4靜置20分鐘（或20，15分鐘）。（異丙醇用于沉淀DNA）8、14，000rpm離心20分鐘。小心倒出上清夜，避免DNA顆粒丟失。倒置離心管，空氣干燥（12分鐘）。9、

9、用1ml70乙醇清洗DNA（3分鐘），14,000rpm離心30分鐘。小心倒出70%乙醇，用1ml 90乙醇清洗DNA，14,000rpm離心30分鐘，小心地倒去乙醇。倒置離心管，空氣中干燥，或用真空泵干燥15分鐘。（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸）10、以150l T10E1或蒸餾水溶解DNA，加入12l不含DNA酶的RNA酶A（10mg/ml）。37反應1小時。11、4保存（20長期保存）。（二）、瓊脂糖凝膠電泳1、取5×TBE緩沖液20mL加水至100mL，配制成1×TBE稀釋緩沖液，待用。 2、膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中，加入5

10、0mL 1×TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為1瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。3、膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。 向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5g /mL。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內加入1×TB

11、E稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。4、加樣：取10L DNA樣品與2L 6×上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。 5、電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳。6、染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5g/mL的EB溶液中，室溫下染色20-25min。 7、觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外

12、燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。 五、實驗注意事項1、EB是強誘變劑并有中等毒性，配制和使用時都應戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經專門處理后才能清洗。沾染了EB的垃圾要專門處理后才可丟棄。2、當EB太多, 膠染色過深，DNA帶看不清時，可將膠放入蒸餾水沖泡，30min后再觀察。 3、制備凝膠時，倒膠的溫度不可太低，否則凝固不均勻：速度也不可太快，否則容易出現氣泡。4、CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子

13、強度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸.通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。5、注：CTAB溶液在低于15 時會形成沉淀析出，因此，在將其加入冰冷的植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于15。6、 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖；7、 蛋白質的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性(SDS、異硫氰酸胍等)高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離，純化；8、多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉

14、淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分離，純化；9、 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結合的試劑：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結合；10、鹽離子的去除：70%的乙醇洗滌核酸吸附,沉淀和溶解使用

15、合適的吸附材料吸附核酸，其它的雜質均被洗掉，達到純化DNA的目的另一種方式加入1/10體積的NaAc(pH5.2,3M)，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后應用70%的乙醇洗滌，以除去鹽離子等若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解。七、實驗結果及分析（一）、實驗結果純的DNA樣品OD260/OD280應為1.8，OD260mOD230應大于2.0。1、 OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。2、小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質或酚污染；3、OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質，如核苷酸、氨基酸、酚等。注： 可能出現既含蛋白質又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。只有當DNA的OD260/OD280接近于1.8時才值得去電泳。本次實驗的結果為：OD260：2.6OD280：1.2OD260/OD280=2.6/1.2=2.1電泳結果如下：條帶最多的是DNAmark樣本，它的范圍在200-4000之間，其他的為實驗中提取的DNA經過