第8章 電泳法

1、電泳技術(shù)電泳技術(shù) n帶電顆粒帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電在電場作用下向著與其電性相反的電極極移動移動，稱為，稱為電泳電泳( (electrophoresiselectrophoresis，EPEP) )。利用利用電泳電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進行分離分析的現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進行分離分析的方法和技術(shù)叫方法和技術(shù)叫電泳法電泳法或或電泳技術(shù)電泳技術(shù)。正極正極負(fù)極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶負(fù)電粒子帶正電粒子帶正電粒子 電泳技術(shù)概述電泳技術(shù)概述n1937年瑞典科學(xué)家年瑞典科學(xué)家Tiselius建立了建立了“移界電泳法移界電泳法(moving boundary EP)”，成功地將血清蛋白質(zhì)分成成

2、功地將血清蛋白質(zhì)分成清蛋白、清蛋白、1-、2-、-和和-球蛋白球蛋白5個主要成分。他個主要成分。他于于1948年榮獲年榮獲諾貝爾獎諾貝爾獎。n2020世紀(jì)世紀(jì)5050年代，許多科學(xué)家著手改進電泳儀，尋找年代，許多科學(xué)家著手改進電泳儀，尋找合適的電泳支持介質(zhì)，先后找到合適的電泳支持介質(zhì)，先后找到濾紙、醋酸纖維素濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉及瓊脂薄膜、淀粉及瓊脂作為支持物。作為支持物。n6060年代，年代，DavisDavis等科學(xué)家利用聚丙烯酰胺凝膠作為電泳等科學(xué)家利用聚丙烯酰胺凝膠作為電泳支持物，在此基礎(chǔ)上發(fā)展了支持物，在此基礎(chǔ)上發(fā)展了SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電

3、聚焦電泳、雙向電泳等電聚焦電泳、雙向電泳和和印跡轉(zhuǎn)移電泳印跡轉(zhuǎn)移電泳等技術(shù)。這等技術(shù)。這些技術(shù)具有設(shè)備簡單，操作方便，分辨率高等優(yōu)點。些技術(shù)具有設(shè)備簡單，操作方便，分辨率高等優(yōu)點。n目前，電泳技術(shù)已成為目前，電泳技術(shù)已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)以及與以及與其密切相關(guān)的醫(yī)學(xué)、農(nóng)、林、牧、漁、制藥及某些工其密切相關(guān)的醫(yī)學(xué)、農(nóng)、林、牧、漁、制藥及某些工業(yè)分析中業(yè)分析中必不可少的手段必不可少的手段。電泳的分類電泳的分類Tise-leas式微量電泳式微量電泳顯微電泳顯微電泳等電聚焦電泳等電聚焦電泳等速電泳等速電泳密度梯度電泳密度梯度電泳電泳 自由電泳自由電泳（無支持體）（無支持體） 區(qū)

4、帶電泳區(qū)帶電泳（有支持體）（有支持體）濾紙電泳濾紙電泳（常壓及高壓）薄層電泳薄層電泳（薄膜及薄板）凝膠電泳凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）n自由界面電泳自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在又稱移動界面電泳，是指在沒沒有有支持介質(zhì)的溶液支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。其裝置復(fù)雜，中進行的電泳。其裝置復(fù)雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應(yīng)用。價格昂貴，費時費力，不便于推廣應(yīng)用。n區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳：是指有是指有支持介質(zhì)支持介質(zhì)的電泳，待分離物的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以作用主要是

5、防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。又可分為不同的類型。缺點缺點：存在對流。：存在對流。成分相互重疊。成分相互重疊。定義定義: 在一根在一根U型管里的型管里的溶液溶液中，各物質(zhì)據(jù)中，各物質(zhì)據(jù)泳動速率泳動速率的不同，達(dá)到分離。的不同，達(dá)到分離。移界電泳移界電泳定義定義:在電泳過程中，應(yīng)用各種不同的在電泳過程中，應(yīng)用各種不同的惰性支持介質(zhì)惰性支持介質(zhì)(醋酸纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖等醋酸纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖等)使

6、具有使具有不同泳動速率不同泳動速率的各組分形成的各組分形成各自各自的區(qū)帶。的區(qū)帶。區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳AB+B A B AABB AABCC B A移界移界區(qū)帶區(qū)帶A B C等速等速等電聚焦等電聚焦pH9 8 7 6混合混合分立分立穩(wěn)態(tài)穩(wěn)態(tài)時毗鄰時毗鄰穩(wěn)態(tài)穩(wěn)態(tài)時分立靜時分立靜止止 不同型號的不同型號的毛細(xì)管電泳儀毛細(xì)管電泳儀及其工作原理及其工作原理 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳1981年，年，Jorgenson和和Luckas，用用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進行電泳內(nèi)徑石英毛細(xì)管進行電泳分析，柱效高達(dá)分析，柱效高達(dá)40萬萬/m，促進，促進電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與發(fā)展成

7、為可與GC、HPLC相媲美相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)的嶄新的分離分析技術(shù)高效高效毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳。電泳儀電泳儀DYY-11DYY-12C電泳槽電泳槽迷你雙垂直電泳槽迷你雙垂直電泳槽水平電泳槽水平電泳槽等電聚焦多用電泳槽等電聚焦多用電泳槽臥式電泳槽臥式電泳槽紫外透射儀紫外透射儀手提式手提式暗箱式暗箱式第一節(jié)第一節(jié) 電泳的基本原理電泳的基本原理一、泳動度一、泳動度n帶電顆粒帶電顆粒在單位電場中在單位電場中泳動的速度泳動的速度稱稱遷移率遷移率或或泳動度泳動度( (mobility)mobility)，可用下式表示：可用下式表示： d/t dl d/t dl U = = = U = = = E V

8、/l vt E V/l vtn式中式中U(U(也可以用也可以用m m表示表示) )：泳動度：泳動度 cmcm2 2(V(Vs)s)；：顆粒泳動速顆粒泳動速度度( (cmcms)s)；E E：電場強度電場強度( (V Vcm)cm)；l l：支持物的有效長度支持物的有效長度( (cm)cm)；V V：實際電壓實際電壓( (V)V)；d d：顆粒泳動的距離顆粒泳動的距離；t t：通電時間通電時間( (s s或或min)min)。電泳后通過測量電泳后通過測量v v、t t、d d、l l，即可計算出被分離物質(zhì)的泳動度。即可計算出被分離物質(zhì)的泳動度。泳動度泳動度與帶電顆粒所帶與帶電顆粒所帶凈電荷的數(shù)量

9、凈電荷的數(shù)量、顆粒大小顆粒大小和和形狀形狀有關(guān)。一般說，凈電荷數(shù)量愈多，顆粒愈有關(guān)。一般說，凈電荷數(shù)量愈多，顆粒愈小，愈接近球形，泳動度愈大。被分離的球形分小，愈接近球形，泳動度愈大。被分離的球形分子在電場中子在電場中所受的力所受的力( (F)F)為：為： F = E QF = E Qn式中式中 E E：電場強度電場強度，即每厘米支持物的電位降；，即每厘米支持物的電位降；Q Q為被分離物所帶為被分離物所帶凈電荷凈電荷。一、泳動度一、泳動度二、影響泳動度的因素二、影響泳動度的因素 n1 1電場強度電場強度 是指每厘米的電位降，也稱是指每厘米的電位降，也稱電位梯度電位梯度( (電電勢梯度勢梯度)

10、)。電場強度越高，則帶電顆粒泳動越快電場強度越高，則帶電顆粒泳動越快。根據(jù)電。根據(jù)電場強度的不同，電泳可分為兩種。場強度的不同，電泳可分為兩種。n(1)(1)常壓常壓(100(100500 500 V)V)電泳電泳 其電場強度為其電場強度為2 210 10 V Vcmcm。分離分離時間較長時間較長，從數(shù)小時到數(shù)十小時，適合于分離蛋白質(zhì)，從數(shù)小時到數(shù)十小時，適合于分離蛋白質(zhì)等等大分子大分子物質(zhì)。物質(zhì)。n(2)(2)高壓高壓(2000(200010000 10000 V)V)電泳電泳 其電場強度為其電場強度為5050200200V Vcmcm，電泳電泳時間很短時間很短，有時只需幾分鐘。多用于分離氨

11、基酸、，有時只需幾分鐘。多用于分離氨基酸、多肽、核苷酸、糖類等多肽、核苷酸、糖類等小分子小分子物質(zhì)。物質(zhì)。 二、影響泳動度的因素二、影響泳動度的因素n2 2溶液溶液pH pH 為使電泳時為使電泳時pHpH值恒定，必須采用緩沖液作值恒定，必須采用緩沖液作為電極液，溶液的為電極液，溶液的pHpH值決定帶電顆粒的解離程度，亦即值決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定其所帶電荷的多少決定其所帶電荷的多少。n對蛋白質(zhì)而言，溶液對蛋白質(zhì)而言，溶液pHpH值離等電點值離等電點( (pI)pI)越遠(yuǎn)，則顆粒所越遠(yuǎn)，則顆粒所帶的凈電荷越多，泳動速度也越快帶的凈電荷越多，泳動速度也越快；反之，則越慢。；反之，則越慢。n

12、因此分離某種蛋白質(zhì)混合液時，應(yīng)選擇一個合適因此分離某種蛋白質(zhì)混合液時，應(yīng)選擇一個合適pH,pH,使欲使欲分離的各種蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)量有較大的差異。分離的各種蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)量有較大的差異。 二、影響泳動度的因素二、影響泳動度的因素n3 3溶液的離子強度溶液的離子強度 緩沖液緩沖液離子強度越高，則顆粒的離子強度越高，則顆粒的電動電勢越小，泳動度也越小電動電勢越小，泳動度也越小。一般最適合的離子強度在。一般最適合的離子強度在O.02O.02O.2O.2之間。溶液離子強度之間。溶液離子強度( (ionic strength)ionic strength)的計算的計算公式如下：公式如下： I= 1

13、/2 I= 1/2 CZCZ2 2n式中式中 I I離子強度；離子強度；c c：離子的摩爾濃度離子的摩爾濃度( (molmolL)L)；z z：離子價數(shù)，價離子價數(shù)，價數(shù)越高，則離子強度越大。數(shù)越高，則離子強度越大。 如：求如：求O.15 mo/L NaO.15 mo/L Na2 2SOSO4 4離子的強度。離子的強度。n I=1/2I=1/2（0.150.152 21 12 2+0.15+0.152 22 2）=0.045 =0.045 二、影響泳動度的因素二、影響泳動度的因素n4 4電滲電滲 電泳緩沖液相對于固體支持物的移動稱電滲。電泳緩沖液相對于固體支持物的移動稱電滲。如紙電泳時，濾紙吸

14、附如紙電泳時，濾紙吸附OHOH- -帶負(fù)電荷，與紙接觸的緩沖液帶帶負(fù)電荷，與紙接觸的緩沖液帶正電荷向負(fù)極移動，會對顆粒的移動造成不良影響，故電正電荷向負(fù)極移動，會對顆粒的移動造成不良影響，故電泳時，電滲小些為好。泳時，電滲小些為好。二、影響泳動度的因素二、影響泳動度的因素n5 5溫度溫度 電泳時會產(chǎn)生焦耳熱，使介質(zhì)黏度下電泳時會產(chǎn)生焦耳熱，使介質(zhì)黏度下降，分子運動加快，遷移率增加，同時溫度過高降，分子運動加快，遷移率增加，同時溫度過高會使樣品中的生物大分子變性失活。會使樣品中的生物大分子變性失活。n因此電泳時，要控制因此電泳時，要控制電壓或電流電壓或電流，也可安裝冷卻，也可安裝冷卻散熱裝置。散

15、熱裝置。n6 6支持物支持物 要求是要求是均勻均勻，吸附力吸附力和和電滲小電滲小，機機械性能好械性能好，便于染色或紫外光下檢測，故最好，便于染色或紫外光下檢測，故最好透透明明，無紫外吸收無紫外吸收。n常用的支持物常用的支持物? ? 介質(zhì)介質(zhì) 原理原理 特點特點紙電泳紙電泳Paper electrophoresis 紙（纖維素）紙（纖維素） 質(zhì)荷比質(zhì)荷比分辨率低分辨率低醋酸纖維素薄醋酸纖維素薄膜電泳膜電泳醋酸纖維素醋酸纖維素質(zhì)荷比質(zhì)荷比在紙電泳基礎(chǔ)上的改進在紙電泳基礎(chǔ)上的改進PAGE電泳電泳聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠凝膠質(zhì)荷比質(zhì)荷比+分子篩分子篩凝膠不僅作為支持物，凝膠不僅作為支持物，且以分子篩主

16、動參與樣且以分子篩主動參與樣品的分離。品的分離。SDS-PAGE聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠凝膠分子篩分子篩用于測定蛋白質(zhì)亞基的用于測定蛋白質(zhì)亞基的分子量分子量瓊脂糖凝膠電瓊脂糖凝膠電泳泳 瓊脂糖瓊脂糖分子篩分子篩因孔徑大，用于核酸的因孔徑大，用于核酸的研究研究第二節(jié)第二節(jié) 醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳n醋酸纖維是纖維素的醋酸酯，由醋酸纖維是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙纖維素的羥基經(jīng)乙?；；?。而成。n醋酸纖維素薄膜與濾紙相比醋酸纖維素薄膜與濾紙相比較，有以下較，有以下優(yōu)點優(yōu)點。n分離效果好分離效果好。n快速省時快速省時。n靈敏度高，樣品用量少靈敏度高，樣品用量少。n應(yīng)用面廣應(yīng)用

17、面廣。n易保存，易定量易保存，易定量。醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳操作操作n1、配制緩沖液；、配制緩沖液；n2、薄膜的處理：裁剪浸泡、薄膜的處理：裁剪浸泡(注意防酶污染注意防酶污染)n3、點樣、點樣n4、安裝裝置、安裝裝置n5、電泳：電場強度為、電泳：電場強度為1025V/cm,0.52h.n6、顯色、顯色:染色、漂洗、檢測染色、漂洗、檢測醋酸纖維素薄膜電泳裝置醋酸纖維素薄膜電泳裝置醋酸纖維素薄膜電泳的應(yīng)用：醋酸纖維素薄膜電泳的應(yīng)用：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比

18、紙電泳分辨率高。分辨率高。 特點：由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效特點：由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。第三節(jié)第三節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 n 一、瓊脂糖凝膠的特點一、瓊脂糖凝膠的特點 天然瓊脂天然瓊脂( (agar)agar)是一種是一種多聚糖，主要由瓊脂糖多聚糖，主要由瓊脂糖( (agaroseagarose，約占約占8080) )及瓊及瓊脂膠脂膠( (agaropectin)agaropectin)組成。組成。瓊脂糖是由半乳糖及其瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶

19、電荷。n目前多用瓊脂糖凝膠為電泳支持物進行平板電泳。目前多用瓊脂糖凝膠為電泳支持物進行平板電泳。n應(yīng)用應(yīng)用: :分離蛋白質(zhì)和同工酶、分離蛋白質(zhì)和同工酶、鑒定核酸、鑒定核酸、DNADNA限制限制性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等。性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等。二、二、DNADNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳瓊脂凝膠電泳對核酸的分離作用主要依據(jù)它們的瓊脂凝膠電泳對核酸的分離作用主要依據(jù)它們的相相對分子質(zhì)量對分子質(zhì)量及及分子構(gòu)型分子構(gòu)型，同時與凝膠的，同時與凝膠的濃度濃度也有密也有密切關(guān)系。切關(guān)系。n1 1核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系n(1)(1)DNADNA分子的大小分子的大小

20、在凝膠中，在凝膠中，DNADNA片段遷移片段遷移距離距離( (遷移率遷移率) )與與堿基對堿基對的的對數(shù)成反比對數(shù)成反比，因此通過已知大，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離進行小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離進行比較，便可測出未知片段的大小。比較，便可測出未知片段的大小。二、二、DNADNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳n(2)(2)瓊脂糖的濃度瓊脂糖的濃度 不同大小的不同大小的DNADNA需要用不同濃度的瓊需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。脂糖凝膠進行電泳分離。二、二、DNADNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳n 2 2核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系

21、核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系n不同構(gòu)型不同構(gòu)型DNADNA的移動速度次序為：的移動速度次序為：共價閉共價閉環(huán)環(huán)DNADNA直線直線DNADNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNADNA。二、二、DNADNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳3 3電泳方法電泳方法 n(1)(1)凝膠類型凝膠類型 用于分離瓊脂糖凝膠電泳可分為用于分離瓊脂糖凝膠電泳可分為垂垂直型直型及及水平型水平型( (平板型平板型) )。3 3電泳方法電泳方法n(2)(2)緩沖液系統(tǒng)緩沖液系統(tǒng) 缺少離子時，電流太小，缺少離子時，電流太小，DNADNA遷遷移慢；相反，高離子型強度的緩沖液由于電流太移慢；相反，高離子型強度的緩沖液

22、由于電流太大會大量產(chǎn)熱，嚴(yán)重時，會造成膠熔化和大會大量產(chǎn)熱，嚴(yán)重時，會造成膠熔化和DNADNA的變的變性。性。n常用的電泳緩沖液有常用的電泳緩沖液有EDTA(pH8.0)EDTA(pH8.0)和和Tris-Tris-乙酸乙酸( (TAETAE) )，Tris-Tris-硼酸硼酸( (TBETBE) )或或Tris-Tris-磷酸磷酸( (TPETPE) )等，等，濃度約為濃度約為50 50 mmolmmolL(pH7.5L(pH7.57.8)7.8)。3 3電泳方法電泳方法n(3)(3)凝膠的制備凝膠的制備 以以稀釋的電極緩沖液稀釋的電極緩沖液為溶劑，用為溶劑，用沸水浴或微波爐沸水浴或微波爐配

23、制一定濃度的配制一定濃度的溶膠溶膠，灌入灌入水平水平膠框膠框或垂直膠膜，或垂直膠膜，插入梳子插入梳子，自然冷卻自然冷卻。n(4)(4)樣品配制與加樣樣品配制與加樣 DNADNA樣品用適量樣品用適量Tris-EDTATris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有O.25O.25溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)或其他或其他指示染料，含有指示染料，含有10101515蔗糖蔗糖或或5 51010甘甘油油，以增加其，以增加其比重比重，使樣品集中。，使樣品集中。上樣緩沖液上樣緩沖液nDNADNA加樣過程中須以一定的比例加入上樣液加樣過程中須以一定的比例加入上樣液( (通常加入樣品通常加入樣品體積體積的的1

24、 16 6或或1 11010) )，上樣液中各組分的作用分別如下。，上樣液中各組分的作用分別如下。n(1) 10 (1) 10 mmolmmolL L左右的左右的EDTAEDTA，作用是作用是螯合螯合MgMg2+2+，防止電泳防止電泳過程中過程中DNADNA被降解。被降解。n(2) 300 (2) 300 g gL L的的聚蔗糖聚蔗糖，或，或400400500 500 g gL L的的蔗糖、甘油蔗糖、甘油，目的在于使目的在于使樣品的密度增大樣品的密度增大，防止樣品在加樣孔中，防止樣品在加樣孔中擴散擴散；聚蔗糖還可減少聚蔗糖還可減少DNADNA條帶的彎曲與拖尾現(xiàn)象，這一點在大條帶的彎曲與拖尾現(xiàn)象

25、，這一點在大片段電泳或制備性電泳大量加樣時尤為重要。片段電泳或制備性電泳大量加樣時尤為重要。上樣緩沖液上樣緩沖液n(3) (3) 遷移指示劑遷移指示劑，即帶，即帶有負(fù)電荷的小分子有色有負(fù)電荷的小分子有色物質(zhì)，用于監(jiān)測電泳的物質(zhì)，用于監(jiān)測電泳的行進過程，可選用的有行進過程，可選用的有溴酚藍(lán)與二甲苯青溴酚藍(lán)與二甲苯青FFFF。3 3電泳方法電泳方法n (5)(5)電泳電泳 n在在低濃度低濃度、低電壓低電壓下，下，分離分離效果效果較好較好。n在在低電壓低電壓條件下，線性條件下，線性DNADNA分子的電泳分子的電泳遷移率遷移率與所用的與所用的電電壓呈正比壓呈正比。但是，在電場強度增加時，較大的。但是，

26、在電場強度增加時，較大的DNADNA片段遷片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離率反而下降，為了獲得電泳分離DNADNA片段的最大分辨率，片段的最大分辨率，電場強度電場強度不宜高于不宜高于5 5 V Vcmcm。3 3電泳方法電泳方法(6)(6)染色和拍照染色和拍照 常用熒光染料常用熒光染料溴乙錠溴乙錠( (EB)EB)染染色，在色，在紫外光下觀察紫外光下觀察DNADNA條帶條帶，用紫外分析，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。進行有關(guān)的

27、數(shù)據(jù)分析。第四節(jié)第四節(jié) 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 n 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。一、一、聚丙烯酰胺凝膠的特點聚丙烯酰胺凝膠的特點n聚丙烯酰胺凝膠是由聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺單體丙烯酰胺( (AcrAcr) )和和交聯(lián)劑交聯(lián)劑N N，N-N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺( (BisBis) )在在加加速劑速劑和和催化劑催化劑的作用下聚合，并聯(lián)結(jié)成的作用下聚合，并聯(lián)結(jié)成三三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝

28、膠，以此凝膠為支持物的的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE）。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺N, N-甲叉甲叉雙丙烯酰胺雙丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH( )n( )n( )m( )m聚丙烯酰胺凝膠的聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點優(yōu)點n在一定濃度時，在一定濃度時，凝膠透明

29、凝膠透明，有彈性，有彈性，機械性能機械性能好。好。n化學(xué)化學(xué)性能穩(wěn)定性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。n對對pHpH和溫度變化較和溫度變化較穩(wěn)定穩(wěn)定。n幾乎幾乎無電滲無電滲作用。作用。n樣品樣品不易擴散不易擴散，其，其靈敏度靈敏度可達(dá)可達(dá)1010-6-6g g。n凝膠凝膠孔徑孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)。n分辨率高分辨率高。nPAGEPAGE應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性分離、定性、定量定量及少量的及少量的制備制備，還可測定，還可測定相對分子質(zhì)量相對分子

30、質(zhì)量、等電點等電點等。等。 二、凝膠聚合的原理及有關(guān)特性二、凝膠聚合的原理及有關(guān)特性 n 1 1聚合反應(yīng)聚合反應(yīng) n凝膠的聚合常用凝膠的聚合常用過硫酸銨過硫酸銨( (APAP) )為為催化劑催化劑，四甲基乙二胺四甲基乙二胺( (TEMEDTEMED) )為為加速劑加速劑。nTEMEDTEMED的堿基可催化的堿基可催化APAP水溶液產(chǎn)生游離氧原子，激活水溶液產(chǎn)生游離氧原子，激活A(yù)crAcr單體，使其聚合成單體長鏈，在單體，使其聚合成單體長鏈，在BisBis作用下，聚合成網(wǎng)作用下，聚合成網(wǎng)狀凝膠。狀凝膠。n堿性條件堿性條件下凝膠下凝膠易聚合易聚合，室溫下，室溫下7.57.5的凝膠在的凝膠在pH8.

31、8pH8.8時時30 30 minmin聚合，在聚合，在pH4.3pH4.3時約需時約需90 90 minmin。2. 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（取決于凝膠總濃度（T T）和和AcrAcr與與BisBis兩者之比。凝膠總兩者之比。凝膠總濃度（濃度（T T）和交聯(lián)度（和交聯(lián)度（C C）的計算公式分別為：的計算公式分別為：Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%C =Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%T =凝膠孔徑大小，主要受凝

32、膠濃度的影響。凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越大，凝膠濃度越大，孔徑越小孔徑越小。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。當(dāng)凝膠濃度確定后，交當(dāng)凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為聯(lián)度為5%5%時，凝膠具有最小孔徑，時，凝膠具有最小孔徑，超過超過5%5%或低于或低于5%5%時凝膠時凝膠孔徑都要增大?？讖蕉家龃?。 在濃度為在濃度為7.5%7.5% 的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為7.5

33、%7.5% 凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。對于一個未知樣品，常用對于一個未知樣品，常用7.5%7.5%的標(biāo)準(zhǔn)膠或的標(biāo)準(zhǔn)膠或4%-10%4%-10% 的凝膠梯度來測試，而后選出適宜的凝膠濃度。的凝膠梯度來測試，而后選出適宜的凝膠濃度。用于研究大分子核酸的凝膠多為用于研究大分子核酸的凝膠多為2.4%2.4%的大孔凝膠，的大孔凝膠，此時凝膠太軟，不易操作，可加入此時凝膠太軟，不易操作，可加入0.5%0.5%瓊脂糖，瓊脂糖，或在或在3%3%凝膠中加入凝膠中加入20%20%蔗糖以增加機械強度而蔗糖以增加機械強度而又不影響凝膠孔徑大小。又不影響凝膠孔徑大小。3 3. .凝膠濃度與被分離物相對分子質(zhì)量的關(guān)系

34、凝膠濃度與被分離物相對分子質(zhì)量的關(guān)系三、三、PAGEPAGE凝膠電泳凝膠電泳操作操作n1、配制緩沖液；、配制緩沖液；n2、配制凝膠、配制凝膠n3、加樣、加樣n4、安裝裝置、安裝裝置n5、電泳：電場強度為、電泳：電場強度為1025V/cm, 0.52h.n6、顯色、顯色:染色、漂洗、檢測染色、漂洗、檢測PAGEPAGE電泳操作電泳操作 nPAGEPAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)連續(xù)系統(tǒng)與系統(tǒng)與不連續(xù)不連續(xù)系系統(tǒng)兩大類：統(tǒng)兩大類：n連續(xù)電泳體系只有一層凝膠，緩沖液連續(xù)電泳體系只有一層凝膠，緩沖液pHpH值值及凝及凝膠濃度膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠相同，帶電

35、顆粒在電場作用下，主要靠電荷電荷及及分子篩分子篩效應(yīng)；效應(yīng)；n不連續(xù)電泳體系采用二層或三層性質(zhì)不同的凝膠，由不連續(xù)電泳體系采用二層或三層性質(zhì)不同的凝膠，由于緩沖液于緩沖液離子成分離子成分、pHpH、凝凝膠濃度膠濃度及及電位梯度電位梯度的的不連不連續(xù)性續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷電荷效應(yīng)、效應(yīng)、分子分子篩篩效應(yīng)，還具有效應(yīng)，還具有濃縮濃縮效應(yīng)，故分離效應(yīng)，故分離效果更好效果更好。n不連續(xù)體系由電極緩沖不連續(xù)體系由電極緩沖液、液、樣品膠樣品膠、濃縮膠濃縮膠及及分分離膠離膠組成，兩層玻璃板中組成，兩層玻璃板中排列順序依次為上層樣品排列順序依次為上層樣品膠、中間濃縮

36、膠、下層分膠、中間濃縮膠、下層分離膠。離膠。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠垂直管型盤狀電泳垂直管型盤狀電泳夾心垂直電泳示意圖夾心垂直電泳示意圖凝膠膜示意圖凝膠膜示意圖聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳垂直板型電泳四、不連續(xù)凝膠電泳的特點四、不連續(xù)凝膠電泳的特點n在不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效在不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。 1 1樣品濃縮效應(yīng)樣品濃縮效應(yīng)n(1)(1)凝膠孔徑的不連續(xù)性凝膠孔徑的

37、不連續(xù)性 樣品膠樣品膠及及濃縮膠為大濃縮膠為大孔膠孔膠；分離膠為小孔膠分離膠為小孔膠。n在電場作用下，樣品顆粒在大孔膠中泳動的阻力在電場作用下，樣品顆粒在大孔膠中泳動的阻力小，移動速度快；當(dāng)進入小孔膠時，受到的阻力小，移動速度快；當(dāng)進入小孔膠時，受到的阻力大，移動速度減慢。大，移動速度減慢。n因而在兩層凝膠因而在兩層凝膠交界處交界處，樣品遷移受阻而壓縮成，樣品遷移受阻而壓縮成很窄很窄的的區(qū)帶區(qū)帶。 1 1樣品濃縮效應(yīng)樣品濃縮效應(yīng)n(2)(2)緩沖體系離子成分及緩沖體系離子成分及pHpH值的不連續(xù)性值的不連續(xù)性 在三層凝膠中均在三層凝膠中均有有三羥甲基氨基甲烷三羥甲基氨基甲烷( (簡稱簡稱Tri

38、s)Tris)及及HClHCl。TrisTris的作用是維持溶的作用是維持溶液的液的電中性電中性及及pHpH值值，是，是緩沖配對離子緩沖配對離子。HClHCl在任何在任何pHpH溶液中均溶液中均易解離出易解離出ClCl- -，在電場中在電場中遷移率快遷移率快，走在最前面稱為，走在最前面稱為快離子快離子。 n在電極緩沖液中，還有在電極緩沖液中，還有甘氨酸甘氨酸, ,其其pI=6.OpI=6.O，在在pH8.3pH8.3的電極緩的電極緩沖液中，易解離出沖液中，易解離出甘氨酸根甘氨酸根( (NHNH2 2CHCH2 2COOCOO- -) )，而在而在pH6.7pH6.7的凝膠的凝膠緩沖體系中，緩沖

39、體系中， GlyGly解離度僅有解離度僅有O.1O.11 1，因而在電場中遷因而在電場中遷移很慢，稱為移很慢，稱為慢離子慢離子。Tris-Gly pH=8.3Tris-Gly pH=8.3Tris-HCl pH=6.8T=3%Tris-HCl pH=8.9T=7.5%n血清血清中大多數(shù)蛋白質(zhì)中大多數(shù)蛋白質(zhì)pIpI在在5.5.O O左右，在左右，在pH6.7pH6.7或或8.38.3時均時均帶帶負(fù)電荷負(fù)電荷向正極移動，遷移率介于向正極移動，遷移率介于快離子與慢離子之快離子與慢離子之間間，于是蛋白質(zhì)就在快、慢離子形成的界面處，被，于是蛋白質(zhì)就在快、慢離子形成的界面處，被濃濃縮縮成為極成為極窄窄的的

40、區(qū)帶區(qū)帶。n當(dāng)進入當(dāng)進入pH8.9pH8.9的分離膠時，的分離膠時， GlyGly解離度增加解離度增加，其有效遷，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)；因此移率超過蛋白質(zhì)；因此ClCl- -及及NH2CH2COONH2CH2COO- -沿著離子界面沿著離子界面繼續(xù)前進。繼續(xù)前進。n蛋白質(zhì)分子由于相對分子質(zhì)量大，被留在后面，逐漸蛋白質(zhì)分子由于相對分子質(zhì)量大，被留在后面，逐漸分成多個區(qū)帶分成多個區(qū)帶。n(3)(3)電位梯度的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性 電泳開始后，電泳開始后，快離子的快速移動會在其后形成一個離快離子的快速移動會在其后形成一個離子強度很低的子強度很低的低電導(dǎo)區(qū)低電導(dǎo)區(qū)，使局部電位梯，使局部電位梯度

41、增高，將蛋白質(zhì)度增高，將蛋白質(zhì)濃縮濃縮成成狹窄狹窄的的區(qū)帶區(qū)帶。 2 2分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) n大小大小和和形狀形狀不同的蛋白質(zhì)通過不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑一定孔徑分離膠時，分離膠時，受阻受阻滯滯的程度的程度不同不同而表現(xiàn)出而表現(xiàn)出不同的遷移率不同的遷移率，這就是，這就是分子篩分子篩效效應(yīng)。應(yīng)。n蛋自質(zhì)進入蛋自質(zhì)進入pH8.9pH8.9的同一孔徑的分離膠后，的同一孔徑的分離膠后，分子小分子小且為且為球球狀狀的蛋白質(zhì)分子所受的蛋白質(zhì)分子所受阻力小阻力小，移動快移動快，走在前面；反之，走在前面；反之，則阻力大，移動慢，走在后面，從而通過凝膠的分子篩則阻力大，移動慢，走在后面，從而通過凝膠的分子篩作

42、用將各種蛋白質(zhì)分成各自的區(qū)帶。作用將各種蛋白質(zhì)分成各自的區(qū)帶。n這種分子篩效應(yīng)這種分子篩效應(yīng)不同于柱層析不同于柱層析中的中的分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)，后者是，后者是大分子先大分子先從凝膠顆粒間的縫隙從凝膠顆粒間的縫隙流出流出，小分子后流出小分子后流出。 3 3電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) n在在pH8.9pH8.9的的分離膠分離膠中，各種帶中，各種帶凈電荷不同凈電荷不同的蛋白的蛋白質(zhì)有不同的質(zhì)有不同的遷移率遷移率。凈電荷多，則遷移快；反。凈電荷多，則遷移快；反之，則慢。之，則慢。n因此，各種蛋白質(zhì)按因此，各種蛋白質(zhì)按電荷多少電荷多少、相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量及及形狀形狀，以一定，以一定順序排成順序排成一個個區(qū)

43、帶，因而稱一個個區(qū)帶，因而稱為為區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳。 四、四、SDS-PAGESDS-PAGE電泳電泳nSDSSDS即即十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉( (Sodium Dodecyl SulfateSodium Dodecyl Sulfate，簡稱簡稱SDSSDS) )是是陰離子表面活性劑陰離子表面活性劑，它能以一定的比例和蛋白質(zhì)，它能以一定的比例和蛋白質(zhì)結(jié)合，形成一種結(jié)合，形成一種SDSSDS一蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)復(fù)合物。復(fù)合物。n此復(fù)合物可用具有此復(fù)合物可用具有SDSSDS的聚丙烯酰胺凝膠的聚丙烯酰胺凝膠( (包括包括連續(xù)連續(xù)的和的和不連續(xù)不連續(xù)的系統(tǒng)的系統(tǒng)) )電泳進行分離，通常把這種電泳稱為電

44、泳進行分離，通常把這種電泳稱為SDSSDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳一聚丙烯酰胺凝膠電泳( (簡稱簡稱SDS-PAGESDS-PAGE) )。它的主要用途它的主要用途是是分離蛋白質(zhì)和測定其分子量。分離蛋白質(zhì)和測定其分子量。1.SDS-PAGE1.SDS-PAGE原理原理 n聚丙烯酰胺凝膠電泳能有效地把不同類型的蛋白質(zhì)分開的聚丙烯酰胺凝膠電泳能有效地把不同類型的蛋白質(zhì)分開的主要依據(jù)，是樣品中各種物質(zhì)的主要依據(jù)，是樣品中各種物質(zhì)的電荷和分子量電荷和分子量的差異性。的差異性。n而而SDSSDSPAGEPAGE的主要依據(jù)的主要依據(jù)，則是各種物質(zhì)，則是各種物質(zhì)分子量的差異分子量的差異性。性。n因為當(dāng)因為當(dāng)SD

45、SSDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量大量的的負(fù)電負(fù)電荷荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子問的問的電荷差別電荷差別就就降低降低乃至乃至消除消除了。了。n與此同時蛋白質(zhì)在與此同時蛋白質(zhì)在SDSSDS作用下結(jié)構(gòu)變得松散，作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀形狀趨向趨向一致一致，所以各種所以各種SDSSDS一蛋白質(zhì)復(fù)合物一蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時產(chǎn)生的在電泳時產(chǎn)生的泳動率差異泳動率差異，就反映了就反映了分子量的差異分子量的差異。 1.SDS-PAGE1.SDS-PAGE原理原理n當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在

46、17,000165,000之間時之間時，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系。一般用下式表示：關(guān)系。一般用下式表示： lgMr=lgK-bm=K1-bm n式中，式中，Mr代表蛋白質(zhì)分子量，代表蛋白質(zhì)分子量，K、K1代表常數(shù)，代表常數(shù)，b代表斜率，代表斜率，m代表遷移率。代表遷移率。將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在SDS -聚丙聚丙烯酰胺凝膠中的電泳烯酰胺凝膠中的電泳遷移率對分子量的對遷移率對分子量的對數(shù)作圖，即可得到一數(shù)作圖，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要測得未知分子量的只要測得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的蛋

47、白質(zhì)在相同條件下的電泳遷移率，就能根據(jù)電泳遷移率，就能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。紅細(xì)胞膜蛋白紅細(xì)胞膜蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分部聚丙烯酰胺凝膠電泳分部SDS一蛋白質(zhì)復(fù)合物一蛋白質(zhì)復(fù)合物在強在強還原劑還原劑(如巰基乙如巰基乙醇醇)存在下，蛋白質(zhì)分存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)子內(nèi)二硫鍵二硫鍵被打開，被打開，而不被氧化，這樣分而不被氧化，這樣分離出的譜帶即為離出的譜帶即為蛋白蛋白質(zhì)亞基質(zhì)亞基五、聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳五、聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳n用連續(xù)用連續(xù)SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量，由于測定蛋白質(zhì)分子量，由于SDS及巰基乙及巰基乙醇的作用，醇的作用，天然蛋白質(zhì)解離為亞基或肽

48、鏈天然蛋白質(zhì)解離為亞基或肽鏈，因此測得的分子，因此測得的分子量不是天然蛋白質(zhì)的分子量，要確定其真正的分子量還需配量不是天然蛋白質(zhì)的分子量，要確定其真正的分子量還需配合其他方法驗證。合其他方法驗證。n為彌補這一缺陷，為彌補這一缺陷，1968年以來，年以來，Margolis和和Slater等人以等人以聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺(polyacrylamid簡稱簡稱PAA)為支持物，制備成為支持物，制備成孔孔徑梯度徑梯度(pore gradient簡稱簡稱PG)或稱為梯度凝膠或稱為梯度凝膠，進行進行PAGE(簡稱簡稱PG-PAGE)分離和鑒定各種蛋白質(zhì)組分，并首分離和鑒定各種蛋白質(zhì)組分，并首次用來測定蛋白質(zhì)

49、分子量。次用來測定蛋白質(zhì)分子量。1、PG-PAGE操作操作n線性梯度凝膠制備，不同于均一濃度凝膠制備，應(yīng)預(yù)先配線性梯度凝膠制備，不同于均一濃度凝膠制備，應(yīng)預(yù)先配制低濃度膠制低濃度膠(2或或4)貯液置貯液瓶中；高濃度膠貯液置貯液瓶中；高濃度膠(16或或30)貯液置混合瓶中貯液置混合瓶中(兩者體積比為兩者體積比為11)，在梯度混，在梯度混合器及蠕動泵的協(xié)助下，從下至上灌膠，凝膠聚合后，合器及蠕動泵的協(xié)助下，從下至上灌膠，凝膠聚合后，則形成從下到上，則形成從下到上，從從濃至稀濃至稀依次依次排列的排列的線性線性梯度凝膠梯度凝膠n自上而下，自上而下，孔徑逐漸變小孔徑逐漸變小，形成，形成梯度梯度。n在在p

50、H大于蛋白質(zhì)大于蛋白質(zhì)pI的緩沖體系中電泳時，蛋的緩沖體系中電泳時，蛋白質(zhì)樣品從白質(zhì)樣品從負(fù)極向正極負(fù)極向正極移動，也就是說從上向移動，也就是說從上向下，向著凝膠濃度增加下，向著凝膠濃度增加(孔徑逐漸減小孔徑逐漸減小)的方向的方向移動，隨著電泳的繼續(xù)進行，蛋白質(zhì)顆粒的遷移動，隨著電泳的繼續(xù)進行，蛋白質(zhì)顆粒的遷移由于孔徑漸小，移由于孔徑漸小，阻力愈來愈大阻力愈來愈大。 n蛋白質(zhì)在凝膠中的蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移速度遷移速度主要受主要受2個個因素影響因素影響；n一是蛋白質(zhì)本身的一是蛋白質(zhì)本身的電荷密度電荷密度，電荷密度，電荷密度愈高愈高，遷移率愈，遷移率愈快快；n二是蛋白質(zhì)本身的二是蛋白質(zhì)本身的大小大

51、小，分子量，分子量愈大愈大，遷移速度愈，遷移速度愈慢慢。當(dāng)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移到所受阻力最大蛋白質(zhì)遷移到所受阻力最大時，則完全停止前進。此時，則完全停止前進。此時，時，低電荷密度的蛋白質(zhì)將低電荷密度的蛋白質(zhì)將“趕上趕上”與它大小相似，但具有較與它大小相似，但具有較高電荷密度的蛋白質(zhì)。高電荷密度的蛋白質(zhì)。n因此，在梯度凝膠電泳中，蛋白質(zhì)的最終因此，在梯度凝膠電泳中，蛋白質(zhì)的最終遷移位置遷移位置僅取決僅取決于其于其本身分子大小本身分子大小，而與蛋白質(zhì)本身的，而與蛋白質(zhì)本身的電荷密度無關(guān)電荷密度無關(guān)。 2、分子篩效應(yīng)、分子篩效應(yīng)n圖中圓球分別代表圖中圓球分別代表大、中、小大、中、小3種不同種不同分子量分子

52、量的蛋白質(zhì)。的蛋白質(zhì)。大、中、小分子分大、中、小分子分別滯留在與分子大別滯留在與分子大小相當(dāng)?shù)哪z孔徑小相當(dāng)?shù)哪z孔徑中，不再前進，因中，不再前進，因而而分離成分離成3個區(qū)帶個區(qū)帶。n在梯度凝膠電泳中，凝膠的在梯度凝膠電泳中，凝膠的分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)極為重要。極為重要。 3 3、PGPGPAGEPAGE的優(yōu)點的優(yōu)點 n(1)由于梯度凝膠由于梯度凝膠孔徑孔徑的的不連續(xù)性不連續(xù)性，可使樣品中各組分充分，可使樣品中各組分充分濃縮濃縮，即使樣品很稀，在電泳過程中，分二、三次加樣，即使樣品很稀，在電泳過程中，分二、三次加樣，也可由于分子量大小不同，最終均滯留于其相應(yīng)的凝膠孔也可由于分子量大小不同，最終

53、均滯留于其相應(yīng)的凝膠孔徑中而得到分離。徑中而得到分離。 n(2)可提供更清晰的蛋白質(zhì)區(qū)帶，用于蛋白質(zhì)可提供更清晰的蛋白質(zhì)區(qū)帶，用于蛋白質(zhì)純度的鑒定純度的鑒定。n(3)可在可在一個凝膠板一個凝膠板上，同時上，同時測定數(shù)個分子量相差很大測定數(shù)個分子量相差很大的蛋的蛋白質(zhì)。例如用白質(zhì)。例如用430PGPAGE可分辨分子量為可分辨分子量為500002 000 000之間的各種蛋白質(zhì)。之間的各種蛋白質(zhì)。n (4)可直接測定可直接測定天然狀態(tài)天然狀態(tài)蛋白質(zhì)分子量，不被解離為亞基。蛋白質(zhì)分子量，不被解離為亞基。因此，本法可作為因此，本法可作為SDSPAGE測定測定蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子量的補充分子量的補充。六、聚

54、丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳六、聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳n利用利用pI不同，以不同，以PAGE為電泳支持物，并在其中為電泳支持物，并在其中加入加入兩性電解質(zhì)載體兩性電解質(zhì)載體，在電場作用下，兩性電解在電場作用下，兩性電解質(zhì)載體在凝膠中移動，形成質(zhì)載體在凝膠中移動，形成pH梯度梯度.n蛋白質(zhì)在凝膠中遷移至其蛋白質(zhì)在凝膠中遷移至其pI的的pH處，即不再泳動處，即不再泳動而聚焦成帶，這種方法稱而聚焦成帶，這種方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電聚丙烯酰胺等電聚焦電泳泳(isoelectric focusing-PAGE，IEF-PAGE)。 1 1兩性電解質(zhì)載體兩性電解質(zhì)載體 n兩性電解質(zhì)載體是用兩性電解質(zhì)載體

55、是用多烯多胺和不飽和酸多烯多胺和不飽和酸合成的合成的脂肪族多脂肪族多氨基多羧基化合物氨基多羧基化合物的的混合物混合物，其中不同的分子因氨基和羧，其中不同的分子因氨基和羧基比例不同而具有不同的基比例不同而具有不同的pI。n目前，兩性電解質(zhì)載體由于生產(chǎn)廠家不同，合成方式各異目前，兩性電解質(zhì)載體由于生產(chǎn)廠家不同，合成方式各異而有不同的商品名稱，如而有不同的商品名稱，如Ampholine(LKB公司公司)、Servalyte(德國德國Serva公司公司)、Pharmalyte(Pharrnacia公司公司)。國。國內(nèi)生產(chǎn)的均稱為兩性電解質(zhì)載體，生產(chǎn)廠家有內(nèi)生產(chǎn)的均稱為兩性電解質(zhì)載體，生產(chǎn)廠家有上上海東

56、風(fēng)生化海東風(fēng)生化試劑廠、試劑廠、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院等。等。n一般溶液濃度為一般溶液濃度為40或或20，其，其pH范圍分別為：范圍分別為：2.55，46.5，58，6.59，810.5，310等。等。 CH2=CHCOOHCH2-CH2NHCH2-CH2NHCH2-CH2NHRNHR( )nCH2-CH2NHCH2-CH2NHCH2-CH2NRNHR( )nCH2CH2COOHCH2CH2COOH隨機加成隨機加成多胺同系物多胺同系物丙烯酸丙烯酸加成度不同的混加成度不同的混合物，分子量大合物，分子量大小不同，胺基和小不同，胺基和羧基的比例不同羧基的比例不同。兩性電解質(zhì)載體兩性電解

57、質(zhì)載體n兩性電解質(zhì)載體兩性電解質(zhì)載體是是IEF-PAGE中中最關(guān)鍵的試劑最關(guān)鍵的試劑，它直接影響它直接影響pH梯度的形成及蛋白質(zhì)的聚焦。梯度的形成及蛋白質(zhì)的聚焦。n因此，要選用優(yōu)質(zhì)兩性電解質(zhì)載體，在凝膠中，因此，要選用優(yōu)質(zhì)兩性電解質(zhì)載體，在凝膠中，其終濃度一般為其終濃度一般為12。npH梯度梯度的線性依賴于的線性依賴于兩性電解質(zhì)的性質(zhì)兩性電解質(zhì)的性質(zhì)，選擇，選擇哪種哪種pH梯度范圍的兩性電解質(zhì)載體，則與被分梯度范圍的兩性電解質(zhì)載體，則與被分離蛋白質(zhì)的離蛋白質(zhì)的pI有關(guān)。有關(guān)。2、pH梯度形成的機制梯度形成的機制n載體兩性電解質(zhì)既有酸性基團載體兩性電解質(zhì)既有酸性基團( (NHNH2 2) )，也

58、有堿性基團也有堿性基團( (COOCOO) )，既可接受質(zhì)子，也可釋放質(zhì)子。既可接受質(zhì)子，也可釋放質(zhì)子。在制備聚丙烯酰胺凝膠時，將其混溶其中。電泳時凝膠板正在制備聚丙烯酰胺凝膠時，將其混溶其中。電泳時凝膠板正極的電極液是磷酸，負(fù)極是氫氧化鈉。極的電極液是磷酸，負(fù)極是氫氧化鈉。 正極是酸性環(huán)境，載體兩性電解質(zhì)都帶正電荷，但由正極是酸性環(huán)境，載體兩性電解質(zhì)都帶正電荷，但由于于pI的不同，其所帶正電荷數(shù)量就有所差異，電泳時，向的不同，其所帶正電荷數(shù)量就有所差異，電泳時，向負(fù)極泳動的速度也就因此不同。負(fù)極泳動的速度也就因此不同。 負(fù)極是堿性環(huán)境，載體兩性電解質(zhì)帶有數(shù)量不等的負(fù)極是堿性環(huán)境，載體兩性電解

59、質(zhì)帶有數(shù)量不等的負(fù)電荷，以不同速度向正極泳動。負(fù)電荷，以不同速度向正極泳動。 在泳動過程中又不斷地與溶液交換質(zhì)子，改變了溶液在泳動過程中又不斷地與溶液交換質(zhì)子，改變了溶液的的pH。當(dāng)達(dá)到平衡時，不再出現(xiàn)質(zhì)子的交換時，載體兩性當(dāng)達(dá)到平衡時，不再出現(xiàn)質(zhì)子的交換時，載體兩性電解質(zhì)到達(dá)等電點并各處于自己的電解質(zhì)到達(dá)等電點并各處于自己的pI區(qū)域，區(qū)域，不在移動。不在移動。 所以，溶液也因此呈現(xiàn)不同的所以，溶液也因此呈現(xiàn)不同的pH，隨載體兩性電解隨載體兩性電解質(zhì)的質(zhì)的pI梯度而形成梯度而形成pH梯度。梯度。 3 3、IEF-PAGE測定測定pIn用用IEF-PAGE分離蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)并并測定測定pI時可

60、先選用時可先選用pI310的兩性電解質(zhì)載體及同一范圍的標(biāo)準(zhǔn)的兩性電解質(zhì)載體及同一范圍的標(biāo)準(zhǔn)pI蛋白，將其與未知樣品同時電泳，固定染色后，蛋白，將其與未知樣品同時電泳，固定染色后，以以pH值為縱軸，距陰極遷移距離值為縱軸，距陰極遷移距離(cm)為橫軸作為橫軸作出出pH梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖圖4-2)，根據(jù)染色后未知蛋，根據(jù)染色后未知蛋白質(zhì)遷移距離白質(zhì)遷移距離可推知其可推知其pI。 3 3電極溶液電極溶液 n應(yīng)選擇在電極應(yīng)選擇在電極上不產(chǎn)生易揮發(fā)物上不產(chǎn)生易揮發(fā)物的液體作為電極緩沖液，的液體作為電極緩沖液，陰、陽電極溶液的陰、陽電極溶液的作用作用是是避免樣品避免樣品及及兩性電解質(zhì)載體兩性電解