免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)——改

1、白細(xì)胞介素3535對肝癌小鼠T T淋巴細(xì)胞的影響第三組研究背景腫瘤已成為人類健康的頭號(hào)殺手，腫瘤的治療研究也是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一個(gè)炙手可熱的方向。腫瘤抗原被機(jī)體免疫系統(tǒng)所識(shí)別，并由此激發(fā)特異性免疫反應(yīng)，包括細(xì)胞免疫和體液免疫。適應(yīng)性免疫效應(yīng)細(xì)胞包括CD8+CTL、CD4+Th以及固有免疫細(xì)胞包括NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NKT細(xì)胞等參與了機(jī)體的抗腫瘤作用。腫瘤的體液免疫主要是抗腫瘤抗體對腫瘤細(xì)胞的破壞效應(yīng)。除此之外，免疫效應(yīng)分子還有干擾素、腫瘤壞死因子。研究現(xiàn)狀I(lǐng)L-35IL-35IL-35是一種由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tr)分泌具有免疫負(fù)調(diào)作用的新型細(xì)胞因子，由p35和EBI3亞基通過二硫鍵結(jié)合形成。作為IL

2、-12家族的一員，IL-35通過抑制IL-17等效應(yīng)分子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,研究表明,Tr、IL-35和Th17參與了自身免疫性疾病、炎癥與腫瘤的免疫調(diào)節(jié)。【1】研究現(xiàn)狀T淋巴細(xì)胞CD4表達(dá)于60%65%T細(xì)胞及部分NKT細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。CD4+Th細(xì)胞不僅在CD8+CTL激活中起重要輔助作用，本身也能產(chǎn)生細(xì)胞因子參與抗腫瘤，趨化因子能招募CTL和巨噬細(xì)胞等到腫瘤局部發(fā)揮效應(yīng)，IFN可激活巨噬細(xì)胞，增加其對腫瘤細(xì)胞的吞噬和殺傷作用，TNF誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。CD4+T細(xì)胞也可直接殺傷腫瘤細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞接受抗原提呈細(xì)胞的信號(hào)和CD4+Th細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子共同作用下分化為CTL。C

3、TL是抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)將通過觀察CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤情況,檢測血清IL-12、IL-2和IFN-濃度等指標(biāo)，探討IL-35對肝癌小鼠T淋巴細(xì)胞的影響。經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)得，若僅注射pxx-neo質(zhì)粒，腫瘤細(xì)胞周圍很少浸潤C(jī)D4+和CD8+淋巴細(xì)胞，所以本實(shí)驗(yàn)通過注射pxx-IL-12來使浸潤結(jié)果明顯。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室要求實(shí)驗(yàn)步驟觀察指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室要求實(shí)驗(yàn)室要求實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器小鼠IL-12、IL-2和IFN一Y檢測試劑盒(購自美國R&D公司)熒光顯微鏡注射器組織勻漿機(jī)恒溫水浴箱切片機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室要求實(shí)驗(yàn)室要求實(shí)驗(yàn)對象實(shí)驗(yàn)對象32

4、只8一12周齡雄性BALB/c小鼠（購自XX公司）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室要求實(shí)驗(yàn)室要求藥品試劑藥品試劑小鼠肝癌細(xì)胞1mg/ml膠原酶抗CD4、CD8抗體及其對照抗體pXX(質(zhì)粒)-IL-35 1g.pXX(質(zhì)粒)-IL-12 1g.pxx-neo 1g.10%馬血清0.1%DAPI實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟建立腫瘤模型建立腫瘤模型小鼠皮下接種體外傳代的BNL肝癌細(xì)胞待腫瘤長至1cm時(shí)將腫瘤取出、碾碎,溶于30mlIV膠原酶(1mg/ml)置37消化30min,平衡鹽溶液洗滌以無菌生理鹽水稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1106，制成腫瘤細(xì)胞懸液每只小鼠皮下接種1x106皮下傳代的BNL

5、細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟小鼠分組小鼠分組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)觀察腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤情況觀察腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤情況終止體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí),取皮下腫瘤行冰凍切片,將切片室溫下用10%馬血清封閉后,分別加入抗CD4、CD8抗體(l:50稀釋)室溫反應(yīng)lh,洗滌后加人熒光標(biāo)。記二抗室溫反應(yīng)lh,0.1%DAPI復(fù)染細(xì)胞核后,熒光顯微鏡觀察CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤情況,每個(gè)標(biāo)本觀察5個(gè)高倍視野。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟小鼠分組小鼠分組可行性分析本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案合理,分組、對照實(shí)驗(yàn)兼有。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)器材、試劑由實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)時(shí)間充裕，經(jīng)費(fèi)充裕。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)均是基于一定的文獻(xiàn)基礎(chǔ)，根據(jù)前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)流程和方法

6、是完全可行的。預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果在注射質(zhì)粒的數(shù)天后，各組小鼠的腫瘤大小有明顯的差異，大小為：組1組2組3對照組。腫瘤周圍淋巴細(xì)胞浸潤狀況不同，浸潤的淋巴細(xì)胞的密度：對照組組3組2組1.血清中INF-,IL-12的濃度：對照組組3組2組1.實(shí)驗(yàn)討論研究表明，分泌研究表明，分泌IL-35IL-35的的CD8CD8+ +CTLA4CTLA4+ +腫瘤抗原特異腫瘤抗原特異性性TregTreg，該細(xì)胞以，該細(xì)胞以IL-35IL-35依賴方式抑制依賴方式抑制CD4CD4+ +T T細(xì)胞細(xì)胞的增殖效應(yīng)，進(jìn)而抑制抗腫瘤的細(xì)胞免疫應(yīng)答。的增殖效應(yīng)，進(jìn)而抑制抗腫瘤的細(xì)胞免疫應(yīng)答?！? 2】荷瘤機(jī)體免疫機(jī)制的失能不是由于

7、缺乏腫瘤抗原，荷瘤機(jī)體免疫機(jī)制的失能不是由于缺乏腫瘤抗原，可能是由于腫瘤細(xì)胞表達(dá)可能是由于腫瘤細(xì)胞表達(dá)IL-35IL-35，抑制，抑制T T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖，而抑制了機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。增殖，而抑制了機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。參考文獻(xiàn)1岳朝艷，馬妍慧，沈立松.新型免疫抑制因子IL-35研究新進(jìn)展【J】.國際免疫學(xué)雜志，2012,35（1）：18-202陳爽，鞠曉紅，鄭文彧，趙良中.IL-35與人類疾病關(guān)系的研究進(jìn)展【J】.免疫學(xué)雜志，2014,30（7）：645-6493 Xiaojin Sha,Shu Meng,Xinyuan Li,Hang Xi;Interleukin-35 inhibits endothelial cell activation by suppressing MAPK -AP-1 pathway;June 22.20154Wang W