電鏡攝影技術(shù)和圖像處理-七年制

1、 生物電鏡技術(shù)生物電鏡技術(shù) * *理想的理想的TEM超薄切片：超薄切片：定位準(zhǔn)確定位準(zhǔn)確厚度要均勻厚度要均勻無刀痕、無顫痕無刀痕、無顫痕無皺褶無皺褶反差適當(dāng)反差適當(dāng)無電子染色污染無電子染色污染無漂移現(xiàn)象無漂移現(xiàn)象理想的理想的SEMSEM樣品：樣品：表面要清洗干凈表面要清洗干凈鍍膜要均勻鍍膜要均勻*2、TEM照相程序照相程序選擇視野、確定放大倍數(shù)（先低后高）。選擇視野、確定放大倍數(shù)（先低后高）。調(diào)整物鏡光闌。調(diào)整物鏡光闌。 要根據(jù)樣品的反差強(qiáng)弱來調(diào)整。要根據(jù)樣品的反差強(qiáng)弱來調(diào)整。聚焦：使用調(diào)焦熒光屏，調(diào)小電子束聚焦：使用調(diào)焦熒光屏，調(diào)小電子束 光斑。目的是使圖像結(jié)構(gòu)清晰。光斑。目的是使圖像結(jié)構(gòu)清

2、晰。 檢查電鏡圖像的穩(wěn)定性。檢查電鏡圖像的穩(wěn)定性。 * * 漂移：漂移：指樣品結(jié)構(gòu)呈持續(xù)、緩慢和單方指樣品結(jié)構(gòu)呈持續(xù)、緩慢和單方向的移動?？刹扇《c(diǎn)定結(jié)構(gòu)觀察向的移動。可采取定點(diǎn)定結(jié)構(gòu)觀察30秒秒,確定有無漂移現(xiàn)象。確定有無漂移現(xiàn)象。 漂移產(chǎn)生的原因漂移產(chǎn)生的原因:樣品臺有移動樣品臺有移動支持膜過厚或厚薄不均支持膜過厚或厚薄不均支持膜與載網(wǎng)脫離支持膜破裂支持膜與載網(wǎng)脫離支持膜破裂電子束打在樣品邊緣樣品污染嚴(yán)重電子束打在樣品邊緣樣品污染嚴(yán)重電子束電流過強(qiáng)電子束電流過強(qiáng).曝光曝光:調(diào)節(jié)光斑亮度達(dá)最佳曝光時間。調(diào)節(jié)光斑亮度達(dá)最佳曝光時間。保存圖片保存圖片,輸入組別輸入組別（如使用（如使用CCD相機(jī)，

3、調(diào)焦、曝光后，以不同圖片相機(jī)，調(diào)焦、曝光后，以不同圖片格式將其儲存于建立好的文件夾內(nèi)，刻好光盤后格式將其儲存于建立好的文件夾內(nèi)，刻好光盤后備用）備用）做好觀察記錄做好觀察記錄3、電鏡攝影的注意事項(xiàng)電鏡攝影的注意事項(xiàng)n 嚴(yán)格遵守操作程序。嚴(yán)格遵守操作程序。n 攝影中要避免外界光線的干擾。攝影中要避免外界光線的干擾。n 調(diào)焦時光斑亮度要由暗漸亮。調(diào)焦時光斑亮度要由暗漸亮。n 選擇圖像視野。選擇圖像視野。 一是按一是按先低倍、后高倍先低倍、后高倍的原則選擇視野。的原則選擇視野。 二是按學(xué)術(shù)性和藝術(shù)性相結(jié)合的原則，二是按學(xué)術(shù)性和藝術(shù)性相結(jié)合的原則， 布局合理布局合理、重點(diǎn)突出重點(diǎn)突出。n 照相時，要做

4、到照相時，要做到“抓拍抓拍”。要注意防震。要注意防震。n 照相時，照相時， 要做好每個組別和每張照片的記錄。要做好每個組別和每張照片的記錄。 二、電鏡圖片的處理和表示方法二、電鏡圖片的處理和表示方法 * * 1 1、電鏡照片上放大倍數(shù)的計算方法電鏡照片上放大倍數(shù)的計算方法 測量測量底片底片上某一結(jié)構(gòu)的尺寸，然后再測量上某一結(jié)構(gòu)的尺寸，然后再測量照照片片上相同結(jié)構(gòu)的尺寸，算出上相同結(jié)構(gòu)的尺寸，算出光學(xué)放大倍數(shù)光學(xué)放大倍數(shù)，再乘，再乘以以底片上放大倍數(shù)底片上放大倍數(shù)就等于照片的總放大倍數(shù)。就等于照片的總放大倍數(shù)。 例：底片的放大倍數(shù)為例：底片的放大倍數(shù)為7500，底片上某個顆粒直，底片上某個顆粒直

5、徑為徑為2mm，沖洗后照片上該顆粒直徑為，沖洗后照片上該顆粒直徑為2.5mm。 *光學(xué)放大倍數(shù)光學(xué)放大倍數(shù)= 2.5mm 2mm = 1.25倍。倍。 *總放大倍數(shù)總放大倍數(shù)=底片上放大倍數(shù)底片上放大倍數(shù)光學(xué)放大倍數(shù)光學(xué)放大倍數(shù) = 75001.25=9375倍倍9400倍倍 * * 2 2、電鏡照片上放大倍數(shù)的表示方法電鏡照片上放大倍數(shù)的表示方法n按倍數(shù)表示：直接用數(shù)字表示。按倍數(shù)表示：直接用數(shù)字表示。9400n按標(biāo)尺（按標(biāo)尺（bar）表示：標(biāo)尺的長度和標(biāo)尺單位）表示：標(biāo)尺的長度和標(biāo)尺單位可根據(jù)照片的放大倍數(shù)而定?？筛鶕?jù)照片的放大倍數(shù)而定。 標(biāo)尺長度標(biāo)尺長度=放大倍數(shù)放大倍數(shù)標(biāo)尺單位標(biāo)尺單位

6、 (設(shè)標(biāo)尺單位為設(shè)標(biāo)尺單位為1m,標(biāo)尺長度標(biāo)尺長度=94001m= 9400m=9.4mm) (設(shè)標(biāo)尺單位為設(shè)標(biāo)尺單位為2m,標(biāo)尺長度標(biāo)尺長度=94002m= 18800m=18.8mm) 放大倍數(shù)放大倍數(shù)=標(biāo)尺長度標(biāo)尺長度標(biāo)尺單位標(biāo)尺單位 (放大倍數(shù)放大倍數(shù)= 9.4mm1m = 9400m 1m = 94003 3、電鏡、電鏡底片掃描底片掃描為照片為照片n打開打開HPHP掃描文件。掃描文件。n點(diǎn)擊掃描，在下拉菜單中點(diǎn)擊掃描底片。點(diǎn)擊掃描，在下拉菜單中點(diǎn)擊掃描底片。n點(diǎn)擊工具，可以更改分辨率和尺寸，一般選擇分辨率點(diǎn)擊工具，可以更改分辨率和尺寸，一般選擇分辨率600600。n將底片放在將底片放

7、在掃描儀掃描儀平板上，將小的蓋板平板上，將小的蓋板蓋蓋在上面。在上面。n然后點(diǎn)擊開始新掃描即可。然后點(diǎn)擊開始新掃描即可。n選中選中掃描的掃描的圖片，將左面菜單第三項(xiàng)改為灰度。調(diào)整圖片，將左面菜單第三項(xiàng)改為灰度。調(diào)整曝光曝光和亮度至適宜為準(zhǔn)和亮度至適宜為準(zhǔn)。n點(diǎn)擊另存為，將掃描好的圖片存儲在文件夾中。點(diǎn)擊另存為，將掃描好的圖片存儲在文件夾中。一般一般選選JPGJPG或或TIFTIF格式。格式。 * * 4 4、發(fā)表文章時對電鏡照片的要求發(fā)表文章時對電鏡照片的要求 一是按上述方法標(biāo)明放大倍數(shù)一是按上述方法標(biāo)明放大倍數(shù)( (標(biāo)尺一般標(biāo)尺一般在右下腳在右下腳) )；二是用英文字母或箭頭表示某些結(jié)構(gòu)二是

8、用英文字母或箭頭表示某些結(jié)構(gòu) ( (照片下方要有文字說明照片下方要有文字說明) )；三是標(biāo)明照片的序號三是標(biāo)明照片的序號( (一般在左下腳一般在左下腳, ,要與要與照片下方的文字說明相一致照片下方的文字說明相一致) )。 為了為了符合發(fā)表文章的要求，需要對照片進(jìn)行一些處理。符合發(fā)表文章的要求，需要對照片進(jìn)行一些處理?？刹捎每刹捎肞HOTOSHOPPHOTOSHOP軟件或其他圖像編輯軟件進(jìn)行處理。軟件或其他圖像編輯軟件進(jìn)行處理。n將將掃描后的圖掃描后的圖片粘貼到幻燈片中。片粘貼到幻燈片中。n將圖片將圖片根據(jù)自己的需要根據(jù)自己的需要按比例放大（點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，按比例放大（點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，選擇設(shè)置對象格

9、式或直接雙擊圖片，選擇尺寸選擇設(shè)置對象格式或直接雙擊圖片，選擇尺寸20,1520,15，鎖定縱橫比，調(diào)整縮放比例）。鎖定縱橫比，調(diào)整縮放比例）。n根據(jù)根據(jù)底片上底片上標(biāo)尺的長短，利用自選圖形中的長方形制標(biāo)尺的長短，利用自選圖形中的長方形制作一個新標(biāo)尺作一個新標(biāo)尺( (下面方框。把標(biāo)尺大小設(shè)為下面方框。把標(biāo)尺大小設(shè)為0.31)0.31)粘貼粘貼在圖片的右下角在圖片的右下角。n將圖片進(jìn)行剪切（將圖片進(jìn)行剪切（用用工具欄內(nèi)的圖片剪切），雙擊圖工具欄內(nèi)的圖片剪切），雙擊圖片片- -大小大小- -旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)9090度。度。n將將圖圖片片進(jìn)行進(jìn)行編號（利用插入文本框進(jìn)行編輯）編號（利用插入文本框進(jìn)行編輯），

10、并，并放放在在圖片的圖片的左下角。左下角。n如果如果圖圖片中有需要特殊指示的結(jié)構(gòu)，可加入箭頭或其片中有需要特殊指示的結(jié)構(gòu)，可加入箭頭或其他標(biāo)志表示。他標(biāo)志表示。n將所有因素組合（按將所有因素組合（按CtrlCtrl選中所有標(biāo)識，右擊組合）。選中所有標(biāo)識，右擊組合）。n最最后將該幻燈片另存為后將該幻燈片另存為JPGEJPGE文件交換格式即可。文件交換格式即可。若要把圖片放入若要把圖片放入WordWord文檔文檔中進(jìn)行如下操作：中進(jìn)行如下操作：n1 1、復(fù)制圖片到、復(fù)制圖片到WordWord文檔中文檔中，A4A4紙每張紙每張6 6張圖片時，可張圖片時，可雙擊圖片大小變?yōu)殡p擊圖片大小變?yōu)?.69 6

11、.965.69 6.96（可根據(jù)自己的需要確（可根據(jù)自己的需要確定）定）。n2 2、在在圖片圖片下方下方進(jìn)行進(jìn)行文字文字說明說明，注意要與圖片中的指示，注意要與圖片中的指示結(jié)構(gòu)相符。結(jié)構(gòu)相符。圖9 AD模型組 神經(jīng)元呈固縮狀，細(xì)胞周圍間隙大；胞質(zhì)致密，可見脂褐素顆粒（ ）和線粒體腫脹、嵴斷裂（ ）bar=2m ；三、三、CCD簡介簡介 電荷耦合元件電荷耦合元件（Charge-coupled Device,CCD），）， 又稱又稱CCD圖像傳感器。圖像傳感器。 是一種半導(dǎo)體器件，能夠把光學(xué)影像轉(zhuǎn)化是一種半導(dǎo)體器件，能夠把光學(xué)影像轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，有感光和成像的作用。它具有靈為數(shù)字信號，有感光和成像

12、的作用。它具有靈敏度高、抗強(qiáng)光、畸變小、體積小、壽命長和敏度高、抗強(qiáng)光、畸變小、體積小、壽命長和抗震動等優(yōu)點(diǎn)?？拐饎拥葍?yōu)點(diǎn)。 CCD的像素（指的像素（指CCD上的感光元件的數(shù)上的感光元件的數(shù)量）和尺寸是其性能的重要指標(biāo)。量）和尺寸是其性能的重要指標(biāo)。 以美國以美國Gatan公司公司 83系列系列CCD相機(jī)為例相機(jī)為例CCD的安裝方式：的安裝方式： 1、側(cè)裝：在側(cè)裝：在35mm口處，從而可以得到大的視口處，從而可以得到大的視野范圍，比透射電鏡通常用的底片還要大野范圍，比透射電鏡通常用的底片還要大30%左右，非常適合生物醫(yī)學(xué)樣品觀察。左右，非常適合生物醫(yī)學(xué)樣品觀察。 2、底裝：得到的視野范圍較小，

13、僅有透射電鏡、底裝：得到的視野范圍較小，僅有透射電鏡用的底片面積視野范圍得用的底片面積視野范圍得10%左右，分辨率較左右，分辨率較高，適合材料科學(xué)使用。高，適合材料科學(xué)使用。Gatan型號型號832.10W CCDn*分辨率：分辨率：4k x 2.7k 即即1100萬像素萬像素n有效面積：有效面積：36mm x 24mmn*耦合方式：耦合方式：1：1光纖耦合，光纖耦合， 采用采用HCR（高襯度分辨率）技術(shù)（高襯度分辨率）技術(shù)n*安裝位置：側(cè)裝，大視野范圍安裝位置：側(cè)裝，大視野范圍n讀取速度：可達(dá)讀取速度：可達(dá)14幅幅/秒秒n動態(tài)范圍：動態(tài)范圍：14位位n制冷模式：半導(dǎo)體制冷制冷模式：半導(dǎo)體制冷

14、n機(jī)頭保護(hù)：機(jī)頭可伸縮式設(shè)計機(jī)頭保護(hù)：機(jī)頭可伸縮式設(shè)計n*基本操作軟件：基本操作軟件：DigitalMicrograph軟件可實(shí)現(xiàn)數(shù)軟件可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的采集、分析、處理等據(jù)的采集、分析、處理等n*圖像存儲模式：圖像存儲模式：*.dm3圖像存儲格式，并可與圖像存儲格式，并可與.tiff格式、格式、.jpg格式、格式、.emf格式、格式、.bmp格式、格式、.gif格式格式等自由轉(zhuǎn)換等自由轉(zhuǎn)換 Gatan型號型號830.10W CCD *1. 耦合方式：耦合方式：1:1光纖耦合，光纖耦合，HCR技術(shù)技術(shù)2. 安裝位置：側(cè)裝，大視野范圍安裝位置：側(cè)裝，大視野范圍*3. 感應(yīng)器：感應(yīng)器：2Kx2K，400

15、萬象素萬象素4. 抗炫功能：有，可直接拍攝電子衍射抗炫功能：有，可直接拍攝電子衍射5. 閃爍器：高靈敏度多晶磷閃爍器閃爍器：高靈敏度多晶磷閃爍器 6. 動態(tài)范圍：動態(tài)范圍：14位位*7. 讀取速度：讀取速度：30fps，可記錄原位動態(tài)實(shí)驗(yàn)，可記錄原位動態(tài)實(shí)驗(yàn)8. Low-dose低劑量測量低劑量測量9. 當(dāng)當(dāng)TEM破真空時，破真空時，CCD機(jī)頭氣動可伸縮機(jī)頭氣動可伸縮10. 冷卻方式：半導(dǎo)體制冷冷卻方式：半導(dǎo)體制冷+循環(huán)冷卻水循環(huán)冷卻水11. 軟件：除基本軟件：除基本*.jpg, .tiff等存儲格式外，還具等存儲格式外，還具有有.dm3專用存儲格式，專用存儲格式，DSV（Digital Vi

16、deo Streaming）數(shù)字流媒體軟件）數(shù)字流媒體軟件 CCD相機(jī)的耦合方式相機(jī)的耦合方式 包括光學(xué)透鏡耦合和光纖耦合，它是包括光學(xué)透鏡耦合和光纖耦合，它是CCD的的一個重要技術(shù)指標(biāo)。一個重要技術(shù)指標(biāo)。1、光學(xué)透鏡耦合：、光學(xué)透鏡耦合： 是透過兩組磁棱鏡進(jìn)行光子信號的傳播，其是透過兩組磁棱鏡進(jìn)行光子信號的傳播，其傳輸效率只有原有信號的傳輸效率只有原有信號的1%-10%，傳輸效，傳輸效率非常低，其反應(yīng)靈敏度差，信息容易丟失。率非常低，其反應(yīng)靈敏度差，信息容易丟失。 使用光學(xué)透鏡耦合的使用光學(xué)透鏡耦合的CCD相機(jī)獲得清晰的生相機(jī)獲得清晰的生物醫(yī)學(xué)樣品圖像時，需要加大電子束流，這樣物醫(yī)學(xué)樣品圖像

17、時，需要加大電子束流，這樣很容易損壞生物醫(yī)學(xué)樣品的原始形貌，破壞樣很容易損壞生物醫(yī)學(xué)樣品的原始形貌，破壞樣品內(nèi)部信息，所獲得的圖像反差較差，不能反品內(nèi)部信息，所獲得的圖像反差較差，不能反映樣品的真實(shí)情況。映樣品的真實(shí)情況。2、光纖耦合：、光纖耦合： 采用光纖進(jìn)行光子信號的傳送，傳輸效率達(dá)采用光纖進(jìn)行光子信號的傳送，傳輸效率達(dá)到原有信號的到原有信號的50%-60%，其傳輸效率高，其傳輸效率高，具有高感度，反差較好，能夠快速的捕獲樣品具有高感度，反差較好，能夠快速的捕獲樣品原始形貌信息，非常適合拍攝生物樣品。原始形貌信息，非常適合拍攝生物樣品。 CCD的特點(diǎn)的特點(diǎn)HCRTM技術(shù)技術(shù) 光子在傳播過程

18、中，由于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)光子在傳播過程中，由于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）的影響，光子信號會發(fā)生擴(kuò)散，所以）的影響，光子信號會發(fā)生擴(kuò)散，所以要保證像素的分辨率，必須保證光子信號的擴(kuò)要保證像素的分辨率，必須保證光子信號的擴(kuò)散面積和像素尺寸相匹配，才能達(dá)到真實(shí)的分散面積和像素尺寸相匹配，才能達(dá)到真實(shí)的分辨率。假如像素尺寸小于擴(kuò)散面積就會產(chǎn)生空辨率。假如像素尺寸小于擴(kuò)散面積就會產(chǎn)生空像素，從而分辨率大大減少。像素，從而分辨率大大減少。 HCRTM技術(shù)在保證技術(shù)在保證1:1單像素分辨率的同時，單像素分辨率的同時，將閃爍器、光纖及將閃爍器、光纖及CCD感應(yīng)器一體化感應(yīng)器一體化(熔接熔接)，從而最大程度上減小了點(diǎn)擴(kuò)散函

19、數(shù)過度效應(yīng)的從而最大程度上減小了點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)過度效應(yīng)的產(chǎn)生，減小擴(kuò)散面積（讀取噪音低）產(chǎn)生，減小擴(kuò)散面積（讀取噪音低） ，提高圖，提高圖像分辨率。像分辨率。Low-dose低計量電子束觀測低計量電子束觀測 生物樣品不能承受強(qiáng)電子束的照射，容易生物樣品不能承受強(qiáng)電子束的照射，容易發(fā)生相變或者損傷。因此，需要用低劑量的電發(fā)生相變或者損傷。因此，需要用低劑量的電子束觀察樣品時，熒光屏或者電腦屏幕較暗，子束觀察樣品時，熒光屏或者電腦屏幕較暗，甚至看不到樣品的信息。甚至看不到樣品的信息。 CCD相機(jī)相機(jī)具備具備Low-dose低劑量測量的低劑量測量的功能后，能夠在低劑量電子束照射時，在電腦功能后，能夠在低

20、劑量電子束照射時，在電腦屏幕上得到清晰且明亮的樣品圖像，從而減少屏幕上得到清晰且明亮的樣品圖像，從而減少了電子束對于樣品的損傷。了電子束對于樣品的損傷。 高的圖像動態(tài)范圍高的圖像動態(tài)范圍 圖像的動態(tài)范圍（圖像的動態(tài)范圍（Dynamic Range）決）決定色調(diào)真實(shí)及柔和。動態(tài)范圍的差異會在目視定色調(diào)真實(shí)及柔和。動態(tài)范圍的差異會在目視上造成很大的差別。例如，上造成很大的差別。例如，1-Bit就是圖像點(diǎn)不就是圖像點(diǎn)不是黑就是白，是黑就是白，Bit數(shù)越高灰階就越多，影像也會數(shù)越高灰階就越多，影像也會更好更細(xì)致。如更好更細(xì)致。如 CCD相機(jī)具有相機(jī)具有14-Bit的動態(tài)的動態(tài)范圍，從而保證能獲得高質(zhì)量的圖像。范圍，從而保證能獲得高質(zhì)量的圖像。 記錄原位動態(tài)記錄原位動態(tài)(in-situ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 CCD相機(jī)具有高的讀取速率（相機(jī)具有高的讀取速率（30幅幅/秒），秒），能夠記錄原位動態(tài)能夠記錄原位動態(tài)(in-situ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合數(shù)字化流動影像軟件（數(shù)字化流動影像軟件（ Digital Streaming Video，DSV ），能夠?qū)崟r記錄樣品變化情），能夠?qū)崟r記錄樣品變化情況，并制作多媒體文件，況，并制作多