免 疫 組 織 化 學(xué)

1、免免 疫疫 組組 織織 化化 學(xué)學(xué) ImmunohistochemistryImmunohistochemistry病理教研室病理教研室免疫組化是什么？免疫組化是什么？和醫(yī)生有什么關(guān)系？和醫(yī)生有什么關(guān)系？疑難病理診斷疑難病理診斷確定組織來源確定組織來源發(fā)現(xiàn)微小病灶發(fā)現(xiàn)微小病灶免疫組化免疫組化評價腫瘤細(xì)胞增殖程度評價腫瘤細(xì)胞增殖程度指導(dǎo)治療、評價預(yù)后指導(dǎo)治療、評價預(yù)后病原體與腫瘤的關(guān)系病原體與腫瘤的關(guān)系病病 理理 診診 斷斷 主主 要要 流流 程程手術(shù)及活檢標(biāo)本手術(shù)及活檢標(biāo)本常規(guī)切片常規(guī)切片閱片閱片初步或最后診斷初步或最后診斷HEHE染色染色免疫組化染色免疫組化染色最后診斷最后診斷特殊染色特殊染

2、色常規(guī)切片常規(guī)切片病 理 診 斷 主 要 流 程手術(shù)及活檢標(biāo)本手術(shù)及活檢標(biāo)本常規(guī)切片常規(guī)切片閱片閱片初步或最后診斷初步或最后診斷HEHE染色染色免疫組化染色免疫組化染色最后診斷最后診斷特殊染色特殊染色HE染色染色病 理 診 斷 主 要 流 程手術(shù)及活檢標(biāo)本手術(shù)及活檢標(biāo)本常規(guī)切片常規(guī)切片閱片閱片初步或最后診斷初步或最后診斷HEHE染色染色免疫組化染色免疫組化染色最后診斷最后診斷特殊染色特殊染色免疫組化免疫組化HPVHPV的診斷的診斷步驟步驟HEHEHPV疣？疣？免疫組織化學(xué)的基本概念免疫組織化學(xué)的基本概念 基本原理是利用抗原與抗體基本原理是利用抗原與抗體之間的結(jié)合有高度特異性的特點(diǎn)，之間的結(jié)合有

3、高度特異性的特點(diǎn)，將組織或細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)將組織或細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取提取出來，以此作為出來，以此作為抗原抗原, , 通過通過免疫免疫獲得獲得相應(yīng)的相應(yīng)的特異性抗體特異性抗體，再，再以此抗體以此抗體來來檢測檢測組織或細(xì)胞中的組織或細(xì)胞中的抗原抗原。一把鑰匙開一把鎖一把鑰匙開一把鎖 由于抗原與抗體結(jié)合后形成的免由于抗原與抗體結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的，因此首先應(yīng)在疫復(fù)合物是無色的，因此首先應(yīng)在己知抗體上己知抗體上標(biāo)記顯示劑標(biāo)記顯示劑(標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體)，通過組織化學(xué)顯色反應(yīng)而呈現(xiàn)一定通過組織化學(xué)顯色反應(yīng)而呈現(xiàn)一定的顏色，并借助顯微鏡觀察其顏色的顏色，并借助顯微鏡觀察其顏色變化，從而在

4、抗原抗體結(jié)合部位確變化，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定定有抗原存在有抗原存在。一把鎖有一個鑰匙一把鎖有一個鑰匙AbAbAbAbAgAgAgAgv提取抗原。提取抗原。 v免疫動物免疫動物(免疫血清免疫血清) 。v獲得相應(yīng)的特異性抗體。獲得相應(yīng)的特異性抗體。v用顯示劑標(biāo)記此抗體。用顯示劑標(biāo)記此抗體。v以此抗體來檢測抗原。以此抗體來檢測抗原。v通過化學(xué)顯色反應(yīng)，在顯微鏡下通過化學(xué)顯色反應(yīng)，在顯微鏡下可見有顏色變化的部位即抗原的可見有顏色變化的部位即抗原的位置。位置。 免疫組化技術(shù)的基本理論免疫組化技術(shù)的基本理論 免疫反應(yīng)中的一些基本名詞免疫反應(yīng)中的一些基本名詞 抗原抗原抗體抗體( (單克隆、多克隆單克隆

5、、多克隆) )抗原抗原- -抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物 為了使抗原抗體復(fù)合物在為了使抗原抗體復(fù)合物在鏡下成為可見，需進(jìn)行標(biāo)記。鏡下成為可見，需進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體: :熒光素抗體熒光素抗體 酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體 AgAgAgAgAbAbHRPHRP+H2O2H2O2+DABDAB 免免 疫疫 組組 化化 檢檢 測測 步步 驟驟抗抗 原原 (antigen,Ag)(antigen,Ag)v抗原抗原(antigen,Ag)是指能刺激免疫是指能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能與相應(yīng)抗原或致敏淋巴細(xì)胞特異能與相應(yīng)抗原或致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合，發(fā)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)。性結(jié)合

6、，發(fā)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)。v抗原的特異性是由抗原表面的特殊抗原的特異性是由抗原表面的特殊化學(xué)基團(tuán)化學(xué)基團(tuán)（抗原決定簇）（抗原決定簇）決定。決定。 特異性是指抗原只與相應(yīng)的抗體或特異性是指抗原只與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞結(jié)合。致敏淋巴細(xì)胞結(jié)合。 抗原的特異性是由抗原物質(zhì)表面的抗原的特異性是由抗原物質(zhì)表面的特殊化學(xué)基團(tuán)即抗原決定簇（特殊化學(xué)基團(tuán)即抗原決定簇（antigen diterminant)的性質(zhì)、數(shù)量和空間構(gòu)型的性質(zhì)、數(shù)量和空間構(gòu)型所決定。所決定。 不同抗原的抗原決定簇?cái)?shù)目不等。不同抗原的抗原決定簇?cái)?shù)目不等。v抗原分子表面常有許多相同或不同的抗抗原分子表面常有許多相同或不同的抗原決定簇。每一種

7、抗原決定簇都可以刺原決定簇。每一種抗原決定簇都可以刺激機(jī)體產(chǎn)生一種特異性抗體，因此某一激機(jī)體產(chǎn)生一種特異性抗體，因此某一抗原，可以產(chǎn)生一種或一種以上特異性抗原，可以產(chǎn)生一種或一種以上特異性抗體。不同的抗原，既可有各自獨(dú)有的抗體。不同的抗原，既可有各自獨(dú)有的抗原決定簇，即抗原決定簇，即特異性抗原，特異性抗原，又有相同又有相同或相似的抗原決定簇，即或相似的抗原決定簇，即共同抗原共同抗原，可，可以引起以引起交叉反應(yīng)交叉反應(yīng)。t抗體抗體( (antibody Abantibody Ab) )v抗體抗體(antibody Ab)(antibody Ab)是指機(jī)體受抗原是指機(jī)體受抗原刺激產(chǎn)生的并能與相應(yīng)抗

8、原特異性刺激產(chǎn)生的并能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的球蛋白，因它是免疫應(yīng)答的結(jié)合的球蛋白，因它是免疫應(yīng)答的產(chǎn)物，故又稱免疫球蛋白產(chǎn)物，故又稱免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)(immunoglobulin,Ig)。所有的抗體。所有的抗體都是免疫球蛋白（漿細(xì)胞產(chǎn)生）。都是免疫球蛋白（漿細(xì)胞產(chǎn)生）。v抗體分多克隆抗體、單克隆抗體和抗體分多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。基因工程抗體。tt多多 克克 隆隆 抗抗 體體v天然抗原由多種抗原決定簇組成，每種天然抗原由多種抗原決定簇組成，每種決定簇均可激活有相應(yīng)抗原受體的決定簇均可激活有相應(yīng)抗原受體的B B 淋淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生針對抗原決定簇的抗體。

9、巴細(xì)胞，產(chǎn)生針對抗原決定簇的抗體。因此用抗原免疫動物所產(chǎn)生的免疫血清，因此用抗原免疫動物所產(chǎn)生的免疫血清，是多個是多個B B 淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物，稱為多克隆抗體。合物，稱為多克隆抗體。提取抗原提取抗原免疫動物免疫動物 免疫血清免疫血清多克隆抗體多克隆抗體細(xì)胞細(xì)胞單單 克克 隆隆 抗抗 體體v機(jī)體淋巴組織內(nèi)存在千百種抗體形機(jī)體淋巴組織內(nèi)存在千百種抗體形成細(xì)胞（即成細(xì)胞（即B B組胞），每種抗體形成組胞），每種抗體形成細(xì)胞只識別其相應(yīng)抗原決定簇，當(dāng)細(xì)胞只識別其相應(yīng)抗原決定簇，當(dāng)受抗原刺激后可增殖分化為一種細(xì)受抗原刺激后可增殖分化為一種細(xì)胞群，這種由單一細(xì)胞增殖

10、形成的胞群，這種由單一細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群體稱為細(xì)胞克?。?xì)胞群體稱為細(xì)胞克隆（cloneclone）。）。同一克隆的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，稱單同一克隆的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，稱單克隆抗體。克隆抗體。抗原抗原多克隆抗體多克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù)免疫動物免疫動物抗原決定簇抗原決定簇多種多種B細(xì)胞細(xì)胞多克隆多克隆B細(xì)胞細(xì)胞多克隆抗體多克隆抗體單克隆單克隆B細(xì)胞細(xì)胞單克隆抗體單克隆抗體漿細(xì)胞漿細(xì)胞漿細(xì)胞漿細(xì)胞抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)v抗原抗體反應(yīng)的概念抗原抗體反應(yīng)的概念: : 抗原與抗體的反應(yīng)具有高度特異性。抗原與抗體的反應(yīng)具有高度特異性。 通常一種抗原

11、只能與其相應(yīng)的抗體結(jié)通常一種抗原只能與其相應(yīng)的抗體結(jié)合合, ,同一抗原可具有多種不同的抗原決同一抗原可具有多種不同的抗原決定簇定簇, ,若兩種不同的抗原分子具有一個若兩種不同的抗原分子具有一個或多個相同的抗原決定簇或多個相同的抗原決定簇, ,則與抗體反則與抗體反應(yīng)時可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。應(yīng)時可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。t免疫組織化學(xué)的基本技術(shù)免疫組織化學(xué)的基本技術(shù)1、石蠟切片脫蠟至水、石蠟切片脫蠟至水2、抗原修復(fù)、抗原修復(fù)3、3% H2O2 10min-PBS沖洗沖洗3min3次次4、加一抗、加一抗60min- PBS沖洗沖洗3min 3次次 5、加二抗、加二抗15min- PBS沖洗沖洗3min 3次次6、D

12、AB顯色顯色3-10min-自來水沖洗自來水沖洗7、蘇木素復(fù)染、脫水、干燥、封片、蘇木素復(fù)染、脫水、干燥、封片免疫組織化學(xué)的基本技術(shù)免疫組織化學(xué)的基本技術(shù) 免疫組織化學(xué)標(biāo)本的免疫組織化學(xué)標(biāo)本的 取材、固定、切片及注意事項(xiàng)取材、固定、切片及注意事項(xiàng)一、取材：一、取材：（一）組織標(biāo)本的取材一）組織標(biāo)本的取材 組織標(biāo)本包括活體組織檢查標(biāo)本、組織標(biāo)本包括活體組織檢查標(biāo)本、手術(shù)切除和尸體解剖標(biāo)本等。對于活體手術(shù)切除和尸體解剖標(biāo)本等。對于活體組織檢查標(biāo)本和手術(shù)切除標(biāo)本，取材應(yīng)組織檢查標(biāo)本和手術(shù)切除標(biāo)本，取材應(yīng)在在2小時內(nèi)進(jìn)行。小時內(nèi)進(jìn)行。1、活體組織標(biāo)本的取材：、活體組織標(biāo)本的取材： 常見標(biāo)本為口腔、喉、

13、鼻咽、皮膚、常見標(biāo)本為口腔、喉、鼻咽、皮膚、 宮腔和各種內(nèi)窺鏡鉗取的組織。宮腔和各種內(nèi)窺鏡鉗取的組織。2、手術(shù)切除標(biāo)本的取材、手術(shù)切除標(biāo)本的取材 由于免疫組化技術(shù)的組織塊大小要適由于免疫組化技術(shù)的組織塊大小要適中，一般在中，一般在1cm1cm0.2cm至至2cm1cm0.2cm之間，這樣有利于固定之間，這樣有利于固定劑能快速滲出到組織內(nèi)。劑能快速滲出到組織內(nèi)。 為充分保存組織的抗原性，標(biāo)本離體后為充分保存組織的抗原性，標(biāo)本離體后應(yīng)立即處理，可以速凍后制作冰凍切片，也應(yīng)立即處理，可以速凍后制作冰凍切片，也可固定后制作石蠟切片。如不用迅速制片，可固定后制作石蠟切片。如不用迅速制片，可貯于液氮或可貯

14、于液氮或-70低溫冰箱備用。低溫冰箱備用。（二）細(xì)胞標(biāo)本的取材（二）細(xì)胞標(biāo)本的取材 1、印片法、印片法： 常用于活檢和手術(shù)切除標(biāo)本。常用于活檢和手術(shù)切除標(biāo)本。 優(yōu)點(diǎn)：簡便省時，細(xì)胞抗原保存良好。優(yōu)點(diǎn)：簡便省時，細(xì)胞抗原保存良好。 缺點(diǎn)：細(xì)胞分布不均勻，細(xì)胞重疊缺點(diǎn)：細(xì)胞分布不均勻，細(xì)胞重疊 2、穿刺法、穿刺法： 常用于實(shí)質(zhì)器官病變區(qū)的細(xì)胞常用于實(shí)質(zhì)器官病變區(qū)的細(xì)胞采集，如肝、腎、肺、淋巴結(jié)、軟組織等。采集，如肝、腎、肺、淋巴結(jié)、軟組織等。 3、沉淀法、沉淀法： 常用于胸水、腹水、尿液、腦常用于胸水、腹水、尿液、腦 脊液等體液多細(xì)胞少的標(biāo)本。脊液等體液多細(xì)胞少的標(biāo)本。二、固定二、固定 目的：目的

15、： 是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，以保持細(xì)胞和是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，以保持細(xì)胞和組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，更重要的保存組組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，更重要的保存組織或細(xì)胞的抗原，防止抗原破壞和彌散。織或細(xì)胞的抗原，防止抗原破壞和彌散。（一）常用的固定劑（一）常用的固定劑1.醛類固定劑：醛類固定劑： 特點(diǎn)：對組織的穿透性強(qiáng)，收縮性小。特點(diǎn)：對組織的穿透性強(qiáng)，收縮性小。（1）甲醛固定液：）甲醛固定液： 包括包括10%甲醛液、甲醛液、10%中性甲醛液和中性甲醛液和10%中性緩沖甲醛液中性緩沖甲醛液等。固定時間不宜超過等。固定時間不宜超過24小時小時（2） 4%多聚甲醛磷酸緩沖液：多聚甲醛磷酸緩沖液： 適用于光學(xué)顯微鏡

16、下免疫組化研究。適用于光學(xué)顯微鏡下免疫組化研究。（3）戊二醛）戊二醛-多聚甲醛緩沖液：多聚甲醛緩沖液： 適用于光鏡、電鏡免疫組化研究。適用于光鏡、電鏡免疫組化研究。 (4) Bouin液：液： 比單獨(dú)醛類固定更適合免疫組化。比單獨(dú)醛類固定更適合免疫組化。2、丙酮及醇類固定劑：、丙酮及醇類固定劑：（1）乙醚（或氯仿）與乙醇等量混合液：）乙醚（或氯仿）與乙醇等量混合液： 是理想的細(xì)胞是理想的細(xì)胞固定劑固定劑。（2）Carnoy液：液： 適用于癌基因、抗癌基因蛋白等抗原固定。適用于癌基因、抗癌基因蛋白等抗原固定。（3）丙酮：）丙酮： 適合于冰凍切片和細(xì)胞涂片的后固定，抗原適合于冰凍切片和細(xì)胞涂片的后

17、固定，抗原保存較好，且時間短，保存較好，且時間短， 切片在冷丙酮中的固定切片在冷丙酮中的固定僅需要僅需要515分鐘。分鐘。3、其他固定劑、其他固定劑（1）碳二亞酰胺）碳二亞酰胺-戊二醛液：戊二醛液： 適用于多肽類激素的固定。適用于多肽類激素的固定。（2）Zenker液液 ： 對免疫球蛋白固定后染色效果好，固定對免疫球蛋白固定后染色效果好，固定時間時間2-4h.染色前應(yīng)用染色前應(yīng)用0.5%碘液脫汞。碘液脫汞。（二）常用的固定方法（二）常用的固定方法1、浸入法：將組織或切片浸泡在固定液內(nèi)浸入法：將組織或切片浸泡在固定液內(nèi)2、注射、灌注固定法、注射、灌注固定法3、微波固定法、微波固定法（三）固定的注

18、意事項(xiàng)（三）固定的注意事項(xiàng)1、固定劑的選擇、固定劑的選擇： 多按多按HE常規(guī)處理常規(guī)處理 組織和細(xì)胞，固定劑一般都是組織和細(xì)胞，固定劑一般都是 10%中性緩沖甲醛液、中性緩沖甲醛液、 可用于大多數(shù)抗原的保護(hù)?？捎糜诖蠖鄶?shù)抗原的保護(hù)。2、固定劑的量：一般不少于組織體積、固定劑的量：一般不少于組織體積 4-5倍倍。3、固定后處理：必須充分沖洗。、固定后處理：必須充分沖洗。三、切片三、切片 要求切片薄而平整一般厚度在要求切片薄而平整一般厚度在35 微米微米之間石蠟切片。之間石蠟切片。（一）（一）石蠟切片石蠟切片：與常規(guī)切片制備基本相同。與常規(guī)切片制備基本相同。（二）（二）冰凍切片冰凍切片： 優(yōu)點(diǎn)：能

19、夠較完整地保存抗原，尤其是優(yōu)點(diǎn)：能夠較完整地保存抗原，尤其是 細(xì)胞膜抗原、受體抗原、酶及多細(xì)胞膜抗原、受體抗原、酶及多 肽類抗原等，并且快速、方便。肽類抗原等，并且快速、方便。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 冰凍時，組織中水分易形成冰晶，冰凍時，組織中水分易形成冰晶， 影響抗原定位。影響抗原定位。載玻片的防脫片的處理載玻片的防脫片的處理 一、載玻片和蓋玻片的處理一、載玻片和蓋玻片的處理 新的載玻片先用流水沖洗，洗衣新的載玻片先用流水沖洗，洗衣粉或肥皂水浸泡，再以流水充分沖洗。粉或肥皂水浸泡，再以流水充分沖洗。最后用蒸餾水清洗。再浸泡最后用蒸餾水清洗。再浸泡95%乙醇乙醇內(nèi)，干燥后備用。內(nèi)，干燥后備用。 蓋玻片

20、可直接浸泡于無水乙醇中，蓋玻片可直接浸泡于無水乙醇中，干燥后備用。干燥后備用。 二、二、 玻片的防脫片處理玻片的防脫片處理（一）樹脂膠（一）樹脂膠（二）明膠（二）明膠:甘油明膠甘油明膠 甲醛明膠甲醛明膠 鉻礬明膠鉻礬明膠（三）多聚賴氨酸（三）多聚賴氨酸（PLL） 多聚賴氨酸多聚賴氨酸0.5g g，加蒸餾水，加蒸餾水100ml100ml，配成濃度，配成濃度0.5%0.5%的儲存液，的儲存液，-20 -20 環(huán)境下可長期保存環(huán)境下可長期保存. .使用時按使用時按1 1：1010稀釋配成工作液。將清潔載玻片在工作液中反稀釋配成工作液。將清潔載玻片在工作液中反復(fù)蘸復(fù)蘸幾下，分散晾干備用。幾下，分散晾干

21、備用。 (四）四）APES APES是一種是一種 新型粘片劑，是通過化學(xué)作用改新型粘片劑，是通過化學(xué)作用改變變 玻璃表面的分子結(jié)構(gòu)，使組織切片牢固的帖在載玻璃表面的分子結(jié)構(gòu)，使組織切片牢固的帖在載玻片上，不易脫落。使用時用丙酮按玻片上，不易脫落。使用時用丙酮按1：50稀釋稀釋免疫組織化學(xué)常用液體及免疫組織化學(xué)常用液體及抗體的配制抗體的配制一、一、常用液體的配制常用液體的配制（一）（一）0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩沖液（PBS）pH7.2試劑：試劑：NaH2PO42H2O 9.0g Na2HPO412H2O 64.5g NaCl 160g 蒸餾水蒸餾水 加水至加水至2000ml(二二

22、)0.5mol/L Tris-HCI緩沖液緩沖液 pH7.6 試劑試劑：Tris(三羥甲基氨基甲烷）三羥甲基氨基甲烷） 60.57 g 1 mol/L HCl 420 ml 蒸餾水蒸餾水 加至加至1000ml 配制：先將少量蒸餾水溶解配制：先將少量蒸餾水溶解Tris，加入，加入HCl 后，將后，將pH值調(diào)至值調(diào)至7.6,然后加蒸餾水然后加蒸餾水 至至1000ml,置于置于4冰箱中保存?zhèn)浔渲斜４鎮(zhèn)?用。用。(三三) 0.05mol/L Tris-HCI緩沖液緩沖液(TBS) pH7.6試劑：試劑： 0.05mol/L Tris-HCI緩沖液緩沖液 100ml NaCl 8.59.0g 蒸餾水蒸

23、餾水 加至加至1000ml配制：先用蒸餾水少許溶解配制：先用蒸餾水少許溶解NaCl , 再加再加 Tris-HCI緩沖液緩沖液(pH7.6),最后加蒸最后加蒸 餾水至餾水至1000ml,充分搖勻使終濃度充分搖勻使終濃度 0.05mol/L （四）檸檬酸鹽緩沖液（四）檸檬酸鹽緩沖液儲存液：儲存液：A: 0.01mol/L 檸檬酸：稱取檸檬酸：稱取21.01g檸檬酸檸檬酸 溶解于溶解于1000ml蒸餾水中。蒸餾水中。B: 0.01mol/L 檸檬酸鈉：稱取檸檬酸鈉：稱取29.41g檸檬檸檬 酸鈉溶解于酸鈉溶解于1000ml蒸餾水中。蒸餾水中。工作液工作液：取取A液液9ml和和B液液41ml分別加入

24、分別加入450ml 蒸餾水中，調(diào)節(jié)蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為值為6.00.1，濃度為濃度為0.01mol/L。 檸檬酸鹽緩沖液主要用于抗原修復(fù)。檸檬酸鹽緩沖液主要用于抗原修復(fù)。（五）（五）3%過氧化氫甲醇液過氧化氫甲醇液試劑：試劑： 30%過氧化氫過氧化氫H2O2 10ml 甲醇甲醇 90ml 3%過氧化氫甲醇液處理標(biāo)本，過氧化氫甲醇液處理標(biāo)本，可以封閉內(nèi)源性過氧化物酶的活性。可以封閉內(nèi)源性過氧化物酶的活性。二、二、抗體的稀釋和保存抗體的稀釋和保存 (分濃縮型與即用型分濃縮型與即用型)（一）抗體的稀釋（一）抗體的稀釋1、影響抗體稀釋度的因素、影響抗體稀釋度的因素（1）抗體的濃度（滴度）：抗體的濃度

25、）抗體的濃度（滴度）：抗體的濃度 越高，稀釋度就越高。越高，稀釋度就越高。（2）非特異性蛋白質(zhì)的含量：）非特異性蛋白質(zhì)的含量：（3）孵育時間：）孵育時間：（4）免疫組織化學(xué)染色方法：）免疫組織化學(xué)染色方法：2、抗體最佳稀釋度的測定方法：抗體最佳稀釋度的測定方法： 用已知陽性抗原切片，進(jìn)行免疫組用已知陽性抗原切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，將其陽性強(qiáng)度與非特異性織化學(xué)染色，將其陽性強(qiáng)度與非特異性背景染色強(qiáng)度以背景染色強(qiáng)度以“+”的多少表示。的多少表示。 在某一稀釋度下特異性染色較強(qiáng)且在某一稀釋度下特異性染色較強(qiáng)且無背景著色，是較理想的稀釋度。無背景著色，是較理想的稀釋度。（1）直接測定法：）直接測定

26、法： 在其他條件已知的情況下（如二抗在其他條件已知的情況下（如二抗或三抗的稀釋度），用于檢測第一抗體或三抗的稀釋度），用于檢測第一抗體的最佳稀釋度。的最佳稀釋度。 表表3-1 直接測定法直接測定法一抗稀釋度一抗稀釋度 特異性染色強(qiáng)度特異性染色強(qiáng)度 非特異性背景染色強(qiáng)度非特異性背景染色強(qiáng)度 1：50 + + + + + + 1：100 + + + + + + 1：200 + + + + + + 1：400 + + + + 1：500 + + - 陰性對照陰性對照 - -_（2）棋盤（方陣）測定法）棋盤（方陣）測定法 表表3-2 棋盤稀釋法棋盤稀釋法二抗稀釋度二抗稀釋度 一抗稀釋度一抗稀釋度 _

27、1:50 1:100 1:200 1:400_1:100 + + + + +(+ +) + + + +(+) + + +(-) +(-)1:200 + + + +(+ ) + + +(-) + +(-) + +(-)1:400 + + + +(-) +(-) (-) (-)注：括號內(nèi)為背景著色強(qiáng)度注：括號內(nèi)為背景著色強(qiáng)度抗體稀釋液的配制：抗體稀釋液的配制： 取取0.05mol/L pH值為值為7.4的的TBS 100ml,加溫加溫到到60, , 再加入再加入0.1g0.1g明膠，攪拌溶解后，冷明膠，攪拌溶解后，冷卻到室溫，加入?yún)s到室溫，加入1.0g1.0g牛血清白蛋白、牛血清白蛋白、NaNNa

28、N3 3 0.2g0.2g溶解后，過濾分裝，溶解后，過濾分裝，4 4 保存保存. . (二）抗體的保存二）抗體的保存 對于新購進(jìn)的濃縮抗體，可按廠家提供對于新購進(jìn)的濃縮抗體，可按廠家提供的效價，按的效價，按50或或100 為一單位分裝為一單位分裝,并注明標(biāo)記（批號、名稱、效價、量），密并注明標(biāo)記（批號、名稱、效價、量），密封后放入封后放入-20 40 40 冰箱中保存?zhèn)溆帽渲斜４鎮(zhèn)溆? ,一一般可保存般可保存1-2 1-2 年。年。三、顯色劑的種類及配制三、顯色劑的種類及配制(一）一）3,3-二氨基聯(lián)苯胺二氨基聯(lián)苯胺(DAB)配制：取配制：取25mgDAB溶于溶于50ml TBS (0.05

29、mol/L pH7.6)中，完全溶解后，用濾紙過濾沉淀。顯中，完全溶解后，用濾紙過濾沉淀。顯 色前再加入適量色前再加入適量H2O2 陽性部位呈棕色，一般以蘇木精復(fù)染陽性部位呈棕色，一般以蘇木精復(fù)染 配制配制DAB時注意：時注意： （1）DAB有致癌性，可誘發(fā)皮膚癌和膀胱癌有致癌性，可誘發(fā)皮膚癌和膀胱癌 （2）DAB一定要新鮮配制一定要新鮮配制 （3）DAB的濃度不宜太高。的濃度不宜太高。 (二）二）3-氨基氨基-9-乙基卡巴唑乙基卡巴唑（AEC） 取取4mgAEC溶于溶于1ml二甲基甲酰胺中二甲基甲酰胺中，加入，加入14ml 濃度為濃度為0.1mol/L pH5.2的醋酸的醋酸緩沖液，然后加入

30、適量緩沖液，然后加入適量H2O2，過濾去掉沉過濾去掉沉淀物。淀物。 陽性部位呈紅色，蘇木精或亮綠復(fù)染陽性部位呈紅色，蘇木精或亮綠復(fù)染 抗原的修復(fù)抗原的修復(fù)一、抗原修復(fù)的原因一、抗原修復(fù)的原因 甲醛固定劑使組織蛋白內(nèi)或蛋白質(zhì)之間甲醛固定劑使組織蛋白內(nèi)或蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)發(fā)生交聯(lián)，封閉了許多抗原決定簇，影響了，封閉了許多抗原決定簇，影響了抗原的定位，使染色結(jié)果不明顯或失敗?？乖亩ㄎ?，使染色結(jié)果不明顯或失敗。 抗原修復(fù)或暴露是將固定時分子之間形抗原修復(fù)或暴露是將固定時分子之間形成成 的的交聯(lián)打開，交聯(lián)打開，恢復(fù)到原有空間?；謴?fù)到原有空間。二、抗原修復(fù)的機(jī)制二、抗原修復(fù)的機(jī)制1、化學(xué)反應(yīng)、化學(xué)反應(yīng)2

31、、熱反應(yīng)、熱反應(yīng)3、微波的高速震蕩效應(yīng)、微波的高速震蕩效應(yīng)三、常用的抗原修復(fù)的方法三、常用的抗原修復(fù)的方法 （一）酶消化方法（一）酶消化方法1、胰蛋白酶消化方法、胰蛋白酶消化方法 濃度一般是濃度一般是0.05%0.1%。 主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的修復(fù)。主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的修復(fù)。2、胃蛋白酶消化方法、胃蛋白酶消化方法 濃度一般為濃度一般為0.04% 主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的修復(fù)。主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的修復(fù)。 3、尿素消化方法、尿素消化方法 濃度為濃度為3mol/L,37消消 化化5分鐘。分鐘。 主要用于單克隆抗體所做的石蠟切片。主要用于單克隆抗體所做的石蠟切片。t （二）物理化學(xué)方法（二）物理化學(xué)方法

32、 1、單純加熱方法、單純加熱方法 2、高壓加熱方法：、高壓加熱方法： 3、微波加熱方法、微波加熱方法t抗原修復(fù)前抗原修復(fù)前抗原修復(fù)后抗原修復(fù)后抗原修復(fù)的注意事項(xiàng)抗原修復(fù)的注意事項(xiàng)v任何修復(fù)方法都不能使組織片干燥；任何修復(fù)方法都不能使組織片干燥；v加熱必須達(dá)到規(guī)定的溫度；加熱必須達(dá)到規(guī)定的溫度；v加熱后應(yīng)放置足夠的時間使之冷卻。加熱后應(yīng)放置足夠的時間使之冷卻。v抗原修復(fù)效果取決于緩沖液的組成抗原修復(fù)效果取決于緩沖液的組成成分及成分及pHpH值。值。v實(shí)踐中證明檸檬酸緩沖液效果較好，實(shí)踐中證明檸檬酸緩沖液效果較好，最常使用。最常使用。 各種抗原修復(fù)方法的評價各種抗原修復(fù)方法的評價（一）酶消化方法（

33、一）酶消化方法（二）物理化學(xué)方法（二）物理化學(xué)方法 各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)注意各公各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)注意各公司的抗體產(chǎn)品的說明書。司的抗體產(chǎn)品的說明書。免疫組織化學(xué)的免疫組織化學(xué)的染色染色 常規(guī)取材、固定、切片常規(guī)取材、固定、切片 免疫組化的染色免疫組化的染色 顯色劑的種類顯色劑的種類(一）一）3,3-二氨基聯(lián)苯胺二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 陽性部位呈棕色陽性部位呈棕色 (二）二）3-氨基氨基-9-乙基卡巴唑（乙基卡巴唑（AEC） 陽性部位呈紅色陽性部位呈紅色t顯顯 色色 反反 應(yīng)應(yīng) HRP+H2O2 H2O + O DAB AEC HRP+H2O2 H2O + O DAB AEC 棕色棕色 紅色紅色 免疫組

34、化染色后，必須對切片進(jìn)行免疫組化染色后，必須對切片進(jìn)行復(fù)染，復(fù)染，更能襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，便更能襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，便于對結(jié)果分析于對結(jié)果分析 。 石蠟切片常用蘇木精復(fù)染石蠟切片常用蘇木精復(fù)染 冰凍切片常用甲基綠冰凍切片常用甲基綠 免疫金銀法染色常用核固紅。免疫金銀法染色常用核固紅。E-cadE-cad（+ +） DABDAB顯色顯色 蘇木精復(fù)染蘇木精復(fù)染P-185P-185（+ +），），AECAEC顯色顯色角蛋白，角蛋白，DABDAB顯色，甲基綠襯染顯色，甲基綠襯染丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒, AEC, AEC顯色顯色 蘇木精復(fù)染蘇木精復(fù)染免疫組織化學(xué)的染色方法免疫組織化學(xué)的染色方法 免疫組

35、織化學(xué)的染色方法有很多，根據(jù)免疫組織化學(xué)的染色方法有很多，根據(jù)標(biāo)記物的種類不同可分為三大類。標(biāo)記物的種類不同可分為三大類。即即:免疫熒免疫熒光法、光法、免疫酶標(biāo)法、免疫酶標(biāo)法、免疫膠體金銀法。每一免疫膠體金銀法。每一類染色方法均可分為直接法、間接法。類染色方法均可分為直接法、間接法。 免疫熒光法在腎臟、皮膚的免疫性疾免疫熒光法在腎臟、皮膚的免疫性疾病的診斷上，具有重要價值。目前，逐漸被病的診斷上，具有重要價值。目前，逐漸被免疫酶標(biāo)法所代替。免疫酶標(biāo)法所代替。免免 疫疫 酶酶 標(biāo)標(biāo) 法法 常用的染色方法常用的染色方法: 一步法一步法-直接酶標(biāo)法直接酶標(biāo)法 二步法二步法: 間接酶標(biāo)法間接酶標(biāo)法 E

36、nvision System法法 SP二步法二步法 三步法三步法: PAP法、法、 ABC法法 四步法四步法: 酶橋法酶橋法 、ASPAPAP法法 五步法五步法: 雙雙PAP法法 免疫免疫酶標(biāo)染色方法及原理酶標(biāo)染色方法及原理 ( (以辣根過氧化物酶以辣根過氧化物酶( (HRPHRP) ) 和二氨基聯(lián)和二氨基聯(lián)苯胺苯胺( (DABDAB）顯示劑為例顯示劑為例) ) 直接酶標(biāo)法（一步法）直接酶標(biāo)法（一步法）： 將酶標(biāo)記在特異性抗體上，將酶標(biāo)記在特異性抗體上，然后與組織中的相應(yīng)抗原結(jié)合形然后與組織中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成成抗原抗原-特異性抗體特異性抗體-酶復(fù)合酶復(fù)合物，物，再與顯色劑反應(yīng)，以顯示抗再與顯

37、色劑反應(yīng)，以顯示抗原所在部位原所在部位t 免疫免疫酶標(biāo)染色方法及原理酶標(biāo)染色方法及原理 ( (以辣根過氧化物酶以辣根過氧化物酶(HRP(HRP) ) 和二氨基聯(lián)和二氨基聯(lián)苯胺苯胺( (DABDAB）顯示劑為例顯示劑為例) ) 間接酶標(biāo)法（二步法）：間接酶標(biāo)法（二步法）： 先用未標(biāo)記的特異性抗體（一抗）與先用未標(biāo)記的特異性抗體（一抗）與組織中的相應(yīng)抗原結(jié)合，形成抗原抗體組織中的相應(yīng)抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)記的抗特異性抗體的復(fù)合物，再用酶標(biāo)記的抗特異性抗體的抗體（二抗）與特異性抗體結(jié)合，形成抗體（二抗）與特異性抗體結(jié)合，形成抗原抗原-特異性抗體特異性抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物酶標(biāo)抗體復(fù)合物

38、，最后用顯色劑，顯示抗原所在部位。最后用顯色劑，顯示抗原所在部位。 Envision System法法 多重免疫組織化學(xué)染色方法多重免疫組織化學(xué)染色方法1 1、染色原理：是利用各種染色方法之間、染色原理：是利用各種染色方法之間所利用的標(biāo)記物及顯色劑的不同而加以所利用的標(biāo)記物及顯色劑的不同而加以組合，在同一張切片上，進(jìn)行多種免疫組合，在同一張切片上，進(jìn)行多種免疫組化染色的方法。組化染色的方法。2 2、染色方法：同前。、染色方法：同前。3 3、應(yīng)用：、應(yīng)用：最普遍的是雙重免疫組化染色最普遍的是雙重免疫組化染色 ，即用即用HRP-DAB與堿性磷酸酶與堿性磷酸酶AP-red顯顯色系統(tǒng)染色方法進(jìn)行組合。

39、色系統(tǒng)染色方法進(jìn)行組合。 P504P504S S 胞漿呈棕色胞漿呈棕色 P63 P63 核呈黑色核呈黑色前列腺癌前列腺癌雙重染色雙重染色，EMA胞膜呈紅色，胞膜呈紅色，Ki-67核呈藍(lán)黑色核呈藍(lán)黑色 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷原則免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷原則1、首先應(yīng)觀察常規(guī)石蠟切片，形成初首先應(yīng)觀察常規(guī)石蠟切片，形成初步診斷意見并選好靶細(xì)胞步診斷意見并選好靶細(xì)胞2、每一批染色都應(yīng)設(shè)置陽性和陰性，、每一批染色都應(yīng)設(shè)置陽性和陰性，這是正確判斷染色結(jié)果的前提。這是正確判斷染色結(jié)果的前提。3、抗原的表達(dá)必須在靶細(xì)胞或組織的、抗原的表達(dá)必須在靶細(xì)胞或組織的特定部位上，才能視為陽性，不在抗特定部位上，

40、才能視為陽性，不在抗原特定部位上的陽性顆粒不能視為陽原特定部位上的陽性顆粒不能視為陽性表達(dá)。性表達(dá)。t4、陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。、陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。 陰性的原因很多，從固定到制片以及陰性的原因很多，從固定到制片以及細(xì)胞的細(xì)胞的 分化程度均可影響著色。分化程度均可影響著色。5、當(dāng)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與、當(dāng)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與HE診斷診斷不相符或發(fā)生矛盾時，應(yīng)以不相符或發(fā)生矛盾時，應(yīng)以HE診斷為標(biāo)診斷為標(biāo)準(zhǔn)，而不能用免疫組化染色結(jié)果代替準(zhǔn)，而不能用免疫組化染色結(jié)果代替HE診斷。診斷。 免疫組織化學(xué)染色過程中的注意事項(xiàng)免疫組織化學(xué)染色過程中的注意事項(xiàng)（一）（一）正確設(shè)置陽性、陰性對

41、照正確設(shè)置陽性、陰性對照 免疫組化染色常用的對照有陽性對照、免疫組化染色常用的對照有陽性對照、陰性對照（空白對照、替代對照）吸收實(shí)驗(yàn)陰性對照（空白對照、替代對照）吸收實(shí)驗(yàn)、抑制實(shí)驗(yàn)和自身對照等。、抑制實(shí)驗(yàn)和自身對照等。1、陽性對照：、陽性對照： 是指用已經(jīng)被證實(shí)了含有靶抗是指用已經(jīng)被證實(shí)了含有靶抗 原的組織切片與待檢組織切片一起做免疫原的組織切片與待檢組織切片一起做免疫 組織化學(xué)染色，結(jié)果為陽性，稱為陽性對組織化學(xué)染色，結(jié)果為陽性，稱為陽性對 照。每一次都應(yīng)設(shè)置陽性對照。照。每一次都應(yīng)設(shè)置陽性對照。2、陰性對照：、陰性對照： 是指已知不含靶抗原的組是指已知不含靶抗原的組織切片與待檢組織切片一起

42、做免疫組織織切片與待檢組織切片一起做免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果為陰性，稱為陰性對照化學(xué)染色，結(jié)果為陰性，稱為陰性對照。 陰性對照主要包括空白對照和替代陰性對照主要包括空白對照和替代對照兩種。對照兩種。 每一次染色均應(yīng)設(shè)置陰性對照。每一次染色均應(yīng)設(shè)置陰性對照。 設(shè)置陰性對照的方法有：設(shè)置陰性對照的方法有： PBS液（空白對照）或用動物非免液（空白對照）或用動物非免疫血清（替代對照）代替一抗進(jìn)行染色疫血清（替代對照）代替一抗進(jìn)行染色，結(jié)果為陰性。，結(jié)果為陰性。 （二）時間（二）時間 在免疫組化染色時，除嚴(yán)格按照操作規(guī)在免疫組化染色時，除嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行外，還應(yīng)嚴(yán)格控制各步的染色時間。程進(jìn)行外，還應(yīng)

43、嚴(yán)格控制各步的染色時間。每個實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的特點(diǎn)，逐每個實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的特點(diǎn)，逐步摸索出適合自己實(shí)驗(yàn)室的每一步驟的染色步摸索出適合自己實(shí)驗(yàn)室的每一步驟的染色時間。時間。（三）顯色（三）顯色 應(yīng)在顯微鏡下控制顯色，當(dāng)陽性顆粒應(yīng)在顯微鏡下控制顯色，當(dāng)陽性顆粒顯示較清楚，而背景清晰無著色時，即可終顯示較清楚，而背景清晰無著色時，即可終止顯色。止顯色。（四）溫度（四）溫度 在免疫組化染色過程中，溫度也直接在免疫組化染色過程中，溫度也直接影響免疫組化的染色結(jié)果。影響免疫組化的染色結(jié)果。（五）濕度（五）濕度 在免疫組化染色過程中，應(yīng)滴加足夠在免疫組化染色過程中，應(yīng)滴加足夠量的稀釋好的抗

44、體或復(fù)合物，將組織塊完量的稀釋好的抗體或復(fù)合物，將組織塊完全覆蓋，并將切片放入濕盒內(nèi)，濕盒下面全覆蓋，并將切片放入濕盒內(nèi)，濕盒下面加入適量溫水，表面密封蓋好，在濕盒內(nèi)加入適量溫水，表面密封蓋好，在濕盒內(nèi)進(jìn)行孵育，確保組織切片表面濕潤，以免進(jìn)行孵育，確保組織切片表面濕潤，以免抗體蒸發(fā)?？贵w蒸發(fā)。 常用免疫組織化學(xué)染色方法的評價常用免疫組織化學(xué)染色方法的評價1、 常用染色方法敏感性比較常用染色方法敏感性比較 各種免疫組化染色的方法和使各種免疫組化染色的方法和使用的標(biāo)記物的不同，敏感性也不相用的標(biāo)記物的不同，敏感性也不相同。同。 一般膠體金標(biāo)志的染色方法敏一般膠體金標(biāo)志的染色方法敏感性比酶標(biāo)記的染色

45、方法敏感性高感性比酶標(biāo)記的染色方法敏感性高。2、常用染色方法的優(yōu)缺點(diǎn)、常用染色方法的優(yōu)缺點(diǎn)（1）直接法：）直接法： 優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速、特異性強(qiáng)，背景優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速、特異性強(qiáng)，背景 非特異性染色輕。非特異性染色輕。 缺點(diǎn)：敏感性低。缺點(diǎn)：敏感性低。（2） 間接法：間接法： 優(yōu)點(diǎn)：敏感性比直接法高，且一種酶優(yōu)點(diǎn)：敏感性比直接法高，且一種酶 標(biāo)記抗體可與多種特異性一抗標(biāo)記抗體可與多種特異性一抗 配合檢測多種抗原配合檢測多種抗原 缺點(diǎn)：敏感性比酶橋法、缺點(diǎn)：敏感性比酶橋法、PAP法低。法低。 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷原則免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷原則1、首先應(yīng)觀察常規(guī)石蠟切片，形成初首先應(yīng)觀察常規(guī)

46、石蠟切片，形成初步診斷意見并選好靶細(xì)胞步診斷意見并選好靶細(xì)胞2、每一批染色都應(yīng)設(shè)置陽性和陰性，、每一批染色都應(yīng)設(shè)置陽性和陰性，這是正確判斷染色結(jié)果的前提。這是正確判斷染色結(jié)果的前提。3、抗原的表達(dá)必須在靶細(xì)胞或組織的、抗原的表達(dá)必須在靶細(xì)胞或組織的特定部位上，才能視為陽性，不在抗特定部位上，才能視為陽性，不在抗原特定部位上的陽性顆粒不能視為陽原特定部位上的陽性顆粒不能視為陽性表達(dá)。性表達(dá)。4、陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)、陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)5、當(dāng)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與、當(dāng)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與HE診斷診斷 不相符或發(fā)生矛盾時，應(yīng)以不相符或發(fā)生矛盾時，應(yīng)以HE診斷診斷 為標(biāo)準(zhǔn)，而不能用免疫

47、組化染色結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，而不能用免疫組化染色結(jié)果 代替代替HE診斷。診斷。 假陽性、假陰性及背景著色的原因假陽性、假陰性及背景著色的原因1、出現(xiàn)假陽性染色的原因出現(xiàn)假陽性染色的原因（1）抗體濃度過高）抗體濃度過高（2）抗體特異性較差）抗體特異性較差（3）內(nèi)源性過氧化物酶封閉不徹底。）內(nèi)源性過氧化物酶封閉不徹底。（4）由于抗原的彌散或被腫瘤細(xì)胞吞噬）由于抗原的彌散或被腫瘤細(xì)胞吞噬。 ( 5 ) 抗原的例外表達(dá)等。抗原的例外表達(dá)等。 出現(xiàn)假陰性染色的原因出現(xiàn)假陰性染色的原因（1）抗體稀釋不當(dāng)，濃度過低。）抗體稀釋不當(dāng)，濃度過低。（2）抗體失活或抗體效價過低，敏感性）抗體失活或抗體效價過低，敏感性 較差

48、。較差。（3）標(biāo)本處理不當(dāng)，致使抗原丟失或破）標(biāo)本處理不當(dāng)，致使抗原丟失或破 壞過多。如切片長期保存抗原會丟壞過多。如切片長期保存抗原會丟 失。失。（4）抗體孵育時間過程短，致使抗體與）抗體孵育時間過程短，致使抗體與 抗原不能充分結(jié)合，導(dǎo)致染色呈現(xiàn)抗原不能充分結(jié)合，導(dǎo)致染色呈現(xiàn) 假陰性。假陰性。室溫保存半年切片染色室溫保存半年切片染色新切片對照染色新切片對照染色（5）染色過程中，組織切片未放入濕盒）染色過程中，組織切片未放入濕盒 內(nèi)，組織表面過分干燥。內(nèi)，組織表面過分干燥。（6）染色操作步驟不正確）染色操作步驟不正確 ，隨意省略，隨意省略 步驟等。步驟等。（7）沖洗步驟、）沖洗步驟、PBS緩沖

49、液的緩沖液的pH值對染值對染 色結(jié)果有影響。色結(jié)果有影響。（8）抗體與檢測試劑盒不匹配。）抗體與檢測試劑盒不匹配。Ki-67:PBS pH6.0沖洗染色沖洗染色Ki-67:PBS pH7.6沖洗染色沖洗染色3、引起背景染色的原因有很多，主要有引起背景染色的原因有很多，主要有以下幾方面：以下幾方面：（1）組織標(biāo)本陳舊，固定不及時或固定）組織標(biāo)本陳舊，固定不及時或固定 時間過長。時間過長。（2）組織切片太厚，脫蠟不徹底。）組織切片太厚，脫蠟不徹底。（3）組織切片處理不當(dāng)，防脫片劑濃度）組織切片處理不當(dāng)，防脫片劑濃度 過高。過高。（4）內(nèi)源性過氧化物酶封閉不完全，導(dǎo)內(nèi)源性過氧化物酶封閉不完全，導(dǎo) 致

50、內(nèi)源性酶顯色。致內(nèi)源性酶顯色。（5）所用的動物非免疫血清與抗體不匹配。）所用的動物非免疫血清與抗體不匹配。（6）抗體濃度過高。）抗體濃度過高。（7）抗體特異性較差，與組織內(nèi)某些抗原或）抗體特異性較差，與組織內(nèi)某些抗原或其其 他成分發(fā)生交叉反應(yīng)或非特異性染色。他成分發(fā)生交叉反應(yīng)或非特異性染色。（8）PBS液沖洗不徹底。液沖洗不徹底。（9）標(biāo)記物質(zhì)量較差，純度不夠，游離的標(biāo)）標(biāo)記物質(zhì)量較差，純度不夠，游離的標(biāo) 記物過多等，均可導(dǎo)致背景著色。記物過多等，均可導(dǎo)致背景著色。（10）底物染色時間過長。）底物染色時間過長。免疫組化應(yīng)用中的注意事項(xiàng)免疫組化應(yīng)用中的注意事項(xiàng)v正確認(rèn)識設(shè)置對照的意義正確認(rèn)識設(shè)置

51、對照的意義v正確判斷免疫組化的染色結(jié)果正確判斷免疫組化的染色結(jié)果v正確分析假陽性、假陰性的原因正確分析假陽性、假陰性的原因v正確認(rèn)識抗原的正確認(rèn)識抗原的“例外例外”表達(dá)表達(dá)v正確認(rèn)識抗原的正確認(rèn)識抗原的聯(lián)合表達(dá)聯(lián)合表達(dá) v正確應(yīng)用正確應(yīng)用雙重互補(bǔ)及反正法雙重互補(bǔ)及反正法t抗原的抗原的“例外例外”表達(dá)與聯(lián)合表達(dá)表達(dá)與聯(lián)合表達(dá)v抗原的抗原的“例外例外”表達(dá)表達(dá)是指在正常情是指在正常情況下或從理論上講不應(yīng)該為陽性的況下或從理論上講不應(yīng)該為陽性的抗原而出現(xiàn)了陽性表達(dá)的現(xiàn)象。如抗原而出現(xiàn)了陽性表達(dá)的現(xiàn)象。如CKCK不僅可表達(dá)在上皮組織，而且還不僅可表達(dá)在上皮組織，而且還可表達(dá)在非上皮組織。可表達(dá)在非上皮

52、組織。v聯(lián)合表達(dá)聯(lián)合表達(dá)即一種細(xì)胞可表達(dá)多種抗即一種細(xì)胞可表達(dá)多種抗原。如肺癌細(xì)胞可同時表達(dá)原。如肺癌細(xì)胞可同時表達(dá)CK,VIM CK,VIM NF,DES NF,DES 。t雙重互補(bǔ)及反正法雙重互補(bǔ)及反正法 惡性黑色素瘤惡性黑色素瘤 陽性陽性 陰性陰性 HMB45 CK S-100 EMA VIM LCA 惡惡 性性 黑黑 色色 素素 瘤瘤HEVIMHMB45CK免疫組化檢查流程v鏡檢鏡檢HEHE染色切片染色切片v確定待檢靶細(xì)胞（待檢抗原）確定待檢靶細(xì)胞（待檢抗原）v選擇決定用哪幾種相應(yīng)抗體選擇決定用哪幾種相應(yīng)抗體v免疫組化染色免疫組化染色v鏡檢免疫組化染色結(jié)果鏡檢免疫組化染色結(jié)果中間絲的特

53、異性組織表達(dá)中間絲的特異性組織表達(dá)v 不同的中間絲有其特異的組織分不同的中間絲有其特異的組織分布，這種特異分布是比較穩(wěn)定的，即正布，這種特異分布是比較穩(wěn)定的，即正常組織及其相應(yīng)腫瘤組織都保持相同的常組織及其相應(yīng)腫瘤組織都保持相同的中間絲?；谶@一理論，中間絲作為組中間絲?；谶@一理論，中間絲作為組織起源的標(biāo)記，可識別正常組織及其腫織起源的標(biāo)記，可識別正常組織及其腫瘤。瘤。代表性的最有五種抗原代表性的最有五種抗原 、角蛋白角蛋白（CytoKeratin, CK） 、波紋蛋白波紋蛋白（Vimentin, Vim） 、結(jié)蛋白結(jié)蛋白（Desmin, Des） 、神經(jīng)絲神經(jīng)絲（ Neurofilamen

54、t，NF） 、膠質(zhì)纖維酸性蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白（ GFAP） ( (Glial Fibrillary Acidic Protein ） 中間絲的特異性組織表達(dá)中間絲的特異性組織表達(dá) CK Vim Des GFAP NF 上皮組織上皮組織 間葉組織間葉組織 肌肌 組組 織織 神經(jīng)膠質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì) 神神 經(jīng)經(jīng) 元元 常用抗體分類常用抗體分類v上皮細(xì)胞及其腫瘤標(biāo)記物上皮細(xì)胞及其腫瘤標(biāo)記物( (抗體抗體) )v間葉組織及其腫瘤標(biāo)記物間葉組織及其腫瘤標(biāo)記物v淋巴造血細(xì)胞標(biāo)記物淋巴造血細(xì)胞標(biāo)記物v神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)記物神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)記物v癌基因蛋白標(biāo)記物癌基因蛋白標(biāo)記物v其他標(biāo)記物其他標(biāo)記物: :病原、激

55、素、激素受體、病原、激素、激素受體、 細(xì)胞增殖活性等標(biāo)記物細(xì)胞增殖活性等標(biāo)記物 常常 用用 的的 標(biāo)標(biāo) 記記 物物、上皮細(xì)胞及其腫瘤標(biāo)記、上皮細(xì)胞及其腫瘤標(biāo)記物物: :（）細(xì)胞角蛋白細(xì)胞角蛋白（CKCK） 位于上皮細(xì)胞及其腫瘤細(xì)胞位于上皮細(xì)胞及其腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)的胞漿內(nèi), , 可用于鑒別上皮性和可用于鑒別上皮性和非上皮性細(xì)胞及其腫瘤。如未分非上皮性細(xì)胞及其腫瘤。如未分化癌與淋巴瘤、癌與惡性黑色素化癌與淋巴瘤、癌與惡性黑色素瘤、癌與肉瘤的鑒別。瘤、癌與肉瘤的鑒別。tHEHECKCK正正 常常 鱗鱗 狀狀 上上 皮皮NPCNpc: CKNpc: CKHECK正正 常常 腺腺 上上 皮皮CKCK正正

56、 常常 腺腺 上上 皮皮低分化癌低分化癌CKCK低分化癌低分化癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌CKCK淋淋 巴巴 結(jié)結(jié) 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 移移 癌癌CKCK（ ）甲甲 胎胎 蛋蛋 白白( AFP ） （ fetoprotein ） 是肝細(xì)胞癌的一種重要標(biāo)記是肝細(xì)胞癌的一種重要標(biāo)記物。在卵巢或睪丸的內(nèi)胚竇瘤、胚物。在卵巢或睪丸的內(nèi)胚竇瘤、胚胎性癌的癌細(xì)胞中亦有表達(dá)。胎性癌的癌細(xì)胞中亦有表達(dá)。 t肝細(xì)胞肝癌HEAFPHEHE肝肝 細(xì)細(xì) 胞胞 肝肝 癌癌AFPAFPA F PA F P肝肝 細(xì)細(xì) 胞胞 癌癌內(nèi)內(nèi) 胚胚 竇竇 瘤瘤CKCKAFPAFPH EH E胚胚 胎胎 性性 癌癌AFPAFP（）（）EMAEMA抗原

57、抗原 ( EMA EMA ） （epithelial membrane antigen 上皮膜上皮膜抗原抗原） 主要用于檢測內(nèi)臟上皮及主要用于檢測內(nèi)臟上皮及其腺癌其腺癌, ,優(yōu)于優(yōu)于CKCK。 EMAEMA正正 常常 腺腺 上上 皮皮腸腸 腺腺 癌癌腸腸 腺腺 癌癌EMAEMA（4）前列腺特異性抗原前列腺特異性抗原(PSAPSA) (Protate Specific Antigen): 主要用于檢測前列腺增生主要用于檢測前列腺增生和前列腺癌和前列腺癌, , 對轉(zhuǎn)移性前列腺對轉(zhuǎn)移性前列腺癌的確診特別有意義。癌的確診特別有意義。 tHEHEPSAPSA正正 常常 前前 列列 腺腺前前 列列 腺腺

58、癌癌PSA前前 列列 腺腺 癌癌HE、間葉組織及其腫瘤標(biāo)記物、間葉組織及其腫瘤標(biāo)記物： （）（）波紋蛋白波紋蛋白（VimVim）: : 主要位于間葉細(xì)胞及其腫瘤主要位于間葉細(xì)胞及其腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)，是間葉細(xì)胞及其細(xì)胞的胞漿內(nèi)，是間葉細(xì)胞及其腫瘤的特異性標(biāo)記物。常與腫瘤的特異性標(biāo)記物。常與細(xì)胞細(xì)胞角蛋白配對使角蛋白配對使用，鑒別癌與肉瘤、用，鑒別癌與肉瘤、惡性黑色素瘤與癌、未分化癌與惡性黑色素瘤與癌、未分化癌與淋巴瘤等腫瘤。淋巴瘤等腫瘤。 tVIM正正 常常 纖纖 維維 組組 織織纖纖 維維 肉肉 瘤瘤VimHE（）結(jié)蛋白結(jié)蛋白（DesDes）: : 結(jié)蛋白是平滑肌、骨骼肌及結(jié)蛋白是平滑肌、骨骼

59、肌及其腫瘤的特異性標(biāo)記物。主要用其腫瘤的特異性標(biāo)記物。主要用于標(biāo)記平滑肌、橫紋肌及其腫瘤；于標(biāo)記平滑肌、橫紋肌及其腫瘤；對一些未分化的腫瘤可與其他標(biāo)對一些未分化的腫瘤可與其他標(biāo)記物合用進(jìn)行鑒別診斷。記物合用進(jìn)行鑒別診斷。 tDesDes正 常 腸 壁 平 滑 肌平滑肌肉瘤平滑肌肉瘤平平 滑滑 肌肌 肉肉 瘤瘤Des （）（）肌動蛋白肌動蛋白( (ActinActin) ) 廣泛分布于各種類型的肌細(xì)胞中，廣泛分布于各種類型的肌細(xì)胞中，對肌源性腫瘤特異性強(qiáng)對肌源性腫瘤特異性強(qiáng), ,敏感性更高。敏感性更高。 平滑肌型的肌動蛋白（平滑肌型的肌動蛋白（SMASMA）：主要用于平滑肌源性腫瘤的診斷。對主要

60、用于平滑肌源性腫瘤的診斷。對一些外分泌腺的肌上皮細(xì)胞和肌上皮一些外分泌腺的肌上皮細(xì)胞和肌上皮瘤有較高特異性。瘤有較高特異性。ActAct正正 常常 腸腸 壁壁 平平 滑滑 肌肌平平 滑滑 肌肌 肉肉 瘤瘤HEHEVIMVIMACTACT平平 滑滑 肌肌 肉肉 瘤瘤SMA3 3、淋巴造血細(xì)胞標(biāo)記物、淋巴造血細(xì)胞標(biāo)記物（）（） CD45 （LCA）: 全白細(xì)胞共同抗體只存在于全白細(xì)胞共同抗體只存在于所有的造血細(xì)胞中，不存在于非所有的造血細(xì)胞中，不存在于非造血組織中。是區(qū)別淋巴瘤（造血組織中。是區(qū)別淋巴瘤（/ /白血病）與非造血組織腫瘤的一白血?。┡c非造血組織腫瘤的一個良好標(biāo)記物。個良好標(biāo)記物。tL