蛋白酶的測(cè)定方法ppt課件

1、呼應(yīng)面法優(yōu)化蛋白酶消費(fèi)工藝呼應(yīng)面法優(yōu)化蛋白酶消費(fèi)工藝下下實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、干物質(zhì)失重的測(cè)定、干物質(zhì)失重的測(cè)定2、蛋白酶活力的測(cè)定、蛋白酶活力的測(cè)定3、數(shù)據(jù)分析與建模、數(shù)據(jù)分析與建模4、呼應(yīng)曲面作圖、呼應(yīng)曲面作圖5、整改方案分析、整改方案分析一、干物質(zhì)失重的測(cè)定干重失重發(fā)酵前干重發(fā)酵后干重干重失重發(fā)酵前干重發(fā)酵后干重二、蛋白酶活力分析二、蛋白酶活力分析1、 原理原理 1 1、福林試劑在堿性情況下極不穩(wěn)定，可被酚類化合物復(fù)、福林試劑在堿性情況下極不穩(wěn)定，可被酚類化合物復(fù)原而呈藍(lán)色反響。原而呈藍(lán)色反響。2 2、蛋白質(zhì)分子中含有具有酚基的氨基酸、蛋白質(zhì)分子中含有具有酚基的氨基酸( (酪氨酸、色氨酪氨

2、酸、色氨酸及苯丙氦酸等酸及苯丙氦酸等) )。3 3、以酪蛋白為底物，同酶液反響，經(jīng)一定時(shí)間后，加三、以酪蛋白為底物，同酶液反響，經(jīng)一定時(shí)間后，加三氯醋酸，終止酶反響，并使剩余的酪蛋白質(zhì)沉淀，同水解產(chǎn)氯醋酸，終止酶反響，并使剩余的酪蛋白質(zhì)沉淀，同水解產(chǎn)物分開，經(jīng)過濾后取濾液。用碳酸鈉堿化，再參與福林試劑物分開，經(jīng)過濾后取濾液。用碳酸鈉堿化，再參與福林試劑使之發(fā)色，用分光光度計(jì)測(cè)定。使之發(fā)色，用分光光度計(jì)測(cè)定。4 4、藍(lán)色反響的強(qiáng)弱，同蛋白水解產(chǎn)物的多少成正比而水、藍(lán)色反響的強(qiáng)弱，同蛋白水解產(chǎn)物的多少成正比而水解產(chǎn)物的量又是同酶活力成正比例關(guān)系。因此，根據(jù)藍(lán)色反解產(chǎn)物的量又是同酶活力成正比例關(guān)系。

3、因此，根據(jù)藍(lán)色反響的強(qiáng)弱就可推測(cè)蛋白酶的活力。響的強(qiáng)弱就可推測(cè)蛋白酶的活力。 2 2 試劑試劑1 1 福林試劑福林試劑 于于2000ml2000ml磨口回流安裝內(nèi)參與鎢酸鈉磨口回流安裝內(nèi)參與鎢酸鈉( N a 2 W O 4 2 H 2 O ) 1 0 0 g( N a 2 W O 4 2 H 2 O ) 1 0 0 g ， 鉬 酸 鈉， 鉬 酸 鈉(NaMoO42H2O)25g(NaMoO42H2O)25g，水，水700ml700ml，85%85%磷酸磷酸50m150m1，濃鹽酸濃鹽酸1000ml1000ml，文火回流，文火回流10h10h參與硫酸鋰參與硫酸鋰(Li2SO4)150g(Li2S

4、O4)150g，蒸溜水，蒸溜水50m150m1，混勻取去冷凝，混勻取去冷凝器，參與幾滴液體溴，再煮沸器，參與幾滴液體溴，再煮沸l(wèi)5minl5min，以驅(qū)逐，以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。假設(shè)溶液仍有綠色，需再滴加溴液。再煮沸假設(shè)溶液仍有綠色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷卻后，定溶至除去之。冷卻后，定溶至1000ml1000ml。過濾，置。過濾，置于棕色瓶中保管。此溶液運(yùn)用時(shí)加于棕色瓶中保管。此溶液運(yùn)用時(shí)加2 2倍蒸餾水倍蒸餾水稀釋，即成稀釋的福林試劑。稀釋，即成稀釋的福林試劑。 2 2、0.4mol/L0.4mol/L三氯醋酸三氯醋酸(TC

5、A)(TCA)溶液溶液 稱取三氯醋酸稱取三氯醋酸65.4g65.4g，定容至，定容至1000ml1000ml。3 3、0.4mol/L0.4mol/L碳酸鈉溶液碳酸鈉溶液 稱取無(wú)水碳酸鈉稱取無(wú)水碳酸鈉(Na2CO3)42.4g(Na2CO3)42.4g，定容至，定容至1000m11000m1。4 4、0.05mol/L pH2.5 0.05mol/L pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸鈉緩沖液乳酸鈉緩沖液 A A液：稱取液：稱取10.6g80-90%10.6g80-90%乳酸加蒸餾水定容至乳酸加蒸餾水定容至1000ml1000ml。 B B液：稱取液：稱取1616克克70%70%乳酸鈉加蒸餾水定容

6、至乳酸鈉加蒸餾水定容至1000ml1000ml。 取取A A液液16ml16ml與與B B液液1ml1ml稀釋稀釋1 1倍即成倍即成0.05mol/L 0.05mol/L pH2.5 pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸鈉緩沖液。乳酸鈉緩沖液。5 5、2%2%酪蛋白溶液酪蛋白溶液 稱取干酪素稱取干酪素2g2g參與參與0.1mol/L0.1mol/L氫氧化氫氧化鈉鈉20ml20ml在水浴中加熱使溶解在水浴中加熱使溶解( (必要時(shí)用必要時(shí)用小火加熱煮沸小火加熱煮沸) )，然后用，然后用pH2.5pH2.5乳酸乳酸- -乳乳酸鈉緩沖液定容至酸鈉緩沖液定容至1000ml1000ml即成。即成。 配制后應(yīng)及時(shí)

7、運(yùn)用或放入冰箱內(nèi)保配制后應(yīng)及時(shí)運(yùn)用或放入冰箱內(nèi)保管。否那么極易繁衍細(xì)菌，引起蛻變。管。否那么極易繁衍細(xì)菌，引起蛻變。 配制酪蛋白溶液定容時(shí)，假設(shè)泡沫配制酪蛋白溶液定容時(shí)，假設(shè)泡沫過多，那么可加過多，那么可加1212滴酒精消泡。滴酒精消泡。33503350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，應(yīng)加弄酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，應(yīng)加弄乳酸乳酸2323滴潮濕。滴潮濕。6 6、100g/m1100g/m1酪氨酸溶液酪氨酸溶液 準(zhǔn)確稱取在準(zhǔn)確稱取在l05l05烘箱中烘至恒重的烘箱中烘至恒重的酪氨酸酪氨酸0.1g0.1g，逐漸參與，逐漸參與0.1mol/L0.1mol/L鹽酸鹽酸(HCl)(HCl)使溶解，加蒸溜水

8、定容至使溶解，加蒸溜水定容至100m1100m1，其濃度為，其濃度為1000g/m11000g/m1。 再汲取此液再汲取此液10ml10ml以蒸餾水定容至以蒸餾水定容至100ml100ml即配成即配成100g/m1100g/m1酪氨酸镕液酪氨酸镕液 此溶液配成后也應(yīng)及時(shí)運(yùn)用或放入冰此溶液配成后也應(yīng)及時(shí)運(yùn)用或放入冰箱內(nèi)保管，以免繁衍細(xì)菌而蛻變。箱內(nèi)保管，以免繁衍細(xì)菌而蛻變。 3 3 操作步驟操作步驟3.1 規(guī)范曲線的繪制規(guī)范曲線的繪制 1 1按表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液按表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液(2)(2)測(cè)定步驟測(cè)定步驟 另取另取6 6支試管按上表編號(hào)分別汲取不同濃度的酪氨支試管按上

9、表編號(hào)分別汲取不同濃度的酪氨酸酸1ml1ml，各參與，各參與0.4mo1/L0.4mo1/L碳酸鈉碳酸鈉5m15m1，再參與已稀釋的福，再參與已稀釋的福林試劑林試劑1m11m1。 搖勻置于水浴鍋中，搖勻置于水浴鍋中，4040保溫發(fā)色保溫發(fā)色20min20min，在波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)660nm660nm處測(cè)定吸光度。普通測(cè)處測(cè)定吸光度。普通測(cè)3 3次，取平均值次，取平均值 以吸光度為縱座標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫座標(biāo)，繪制以吸光度為縱座標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫座標(biāo)，繪制成規(guī)范曲線。成規(guī)范曲線。 準(zhǔn)確稱取蛋白酶固態(tài)發(fā)酵的濕曲準(zhǔn)確稱取蛋白酶固態(tài)發(fā)酵的濕曲2g2g，用，用101020ml20ml蒸蒸餾水，餾水，303

10、0浸提半小時(shí)，用濾紙過濾。將濾液稀釋一定浸提半小時(shí)，用濾紙過濾。將濾液稀釋一定倍數(shù)倍數(shù)( (使其測(cè)定光密度在使其測(cè)定光密度在0.20.20.40.4范圍內(nèi)為宜范圍內(nèi)為宜) )。3.2 3.2 酶液的制備酶液的制備 取四支試管，分別參與取四支試管，分別參與1ml1ml稀釋酶液，其中一支為空白稀釋酶液，其中一支為空白管，三支為平行實(shí)驗(yàn)管，置入管，三支為平行實(shí)驗(yàn)管，置入4040水浴中預(yù)熱水浴中預(yù)熱3 35min5min。 在三支平行實(shí)驗(yàn)管中分別參與在三支平行實(shí)驗(yàn)管中分別參與1ml 2% 1ml 2% 酪蛋白溶液，準(zhǔn)酪蛋白溶液，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)保溫確計(jì)時(shí)保溫10min10min。立刻參與。立刻參與2ml 0.

11、4M2ml 0.4M三氯乙酸溶液，三氯乙酸溶液，l5minl5min后用濾紙過濾。分別汲取后用濾紙過濾。分別汲取1ml1ml清液，加清液，加5ml 0.4M5ml 0.4M碳酸碳酸鈉溶液，最后參與鈉溶液，最后參與1ml1ml福林福林- -酚試劑，搖勻，于酚試劑，搖勻，于4040水浴中水浴中顯色顯色20min20min。 空白管中先參與空白管中先參與2ml 0.4M2ml 0.4M三氯乙酸溶液，再加三氯乙酸溶液，再加l ml 2%l ml 2%酪蛋白溶液，酪蛋白溶液，15min15min后用濾紙過濾。以下操作與平行實(shí)驗(yàn)管后用濾紙過濾。以下操作與平行實(shí)驗(yàn)管一樣。一樣。 以空白管為對(duì)照，在以空白管為

12、對(duì)照，在680680納米波長(zhǎng)下測(cè)光密度，取其納米波長(zhǎng)下測(cè)光密度，取其平均值。平均值。 3.3 3.3 測(cè)定測(cè)定 蛋白酶活力單位定義：在蛋白酶活力單位定義：在4040，pH2.5pH2.5下，每分鐘水解下，每分鐘水解酪蛋白釋放酪蛋白釋放1 1微克酪氨酸的酶量定義為微克酪氨酸的酶量定義為1 1個(gè)蛋白酶單位。個(gè)蛋白酶單位。 式中：式中： K K：規(guī)范曲線中：規(guī)范曲線中ODOD值為值為1 1所相當(dāng)?shù)睦野彼岬奈⒖藬?shù)；所相當(dāng)?shù)睦野彼岬奈⒖藬?shù)； OD OD：平行實(shí)驗(yàn)管的平均光密度；：平行實(shí)驗(yàn)管的平均光密度； 4 4：試管中反響液總體積：試管中反響液總體積( (毫升毫升) )； 10 10：反響：反響1010

13、分鐘；分鐘； N N：稀釋倍數(shù)；：稀釋倍數(shù)；W W：曲的稱取量：曲的稱取量( (克克) )4 4 計(jì)算計(jì)算 1 1對(duì)于同一臺(tái)分光光度計(jì)與同一批福林對(duì)于同一臺(tái)分光光度計(jì)與同一批福林- -酚試劑，酚試劑，其任務(wù)曲線其任務(wù)曲線K K值可以沿用，當(dāng)另配福林值可以沿用，當(dāng)另配福林- -酚試劑時(shí)，任務(wù)曲酚試劑時(shí)，任務(wù)曲線應(yīng)重作。線應(yīng)重作。 2 2當(dāng)用不同產(chǎn)品的酪蛋白對(duì)同一蛋白酶測(cè)定時(shí)，當(dāng)用不同產(chǎn)品的酪蛋白對(duì)同一蛋白酶測(cè)定時(shí)，其結(jié)果會(huì)有差別，故蛋白酶活力表示時(shí)應(yīng)注明所用酪蛋白其結(jié)果會(huì)有差別，故蛋白酶活力表示時(shí)應(yīng)注明所用酪蛋白的消費(fèi)廠。的消費(fèi)廠。5 5 闡明闡明三、數(shù)據(jù)分析與建模三、數(shù)據(jù)分析與建模運(yùn)用運(yùn)用DESIGN EXPERT 7.1 軟件軟件1、建立數(shù)學(xué)模型、建立數(shù)學(xué)模型2、模型顯著性檢驗(yàn)、模型顯著性檢驗(yàn)3、解方程，求出最正確發(fā)酵條件、解方程，求出最正確發(fā)酵條件4、求出模型所預(yù)測(cè)的最高產(chǎn)量。、求出模型所預(yù)測(cè)的最高產(chǎn)量。四、呼應(yīng)曲面作圖四、呼應(yīng)曲面作圖D esign-E xpert?S oftwareR155.328.8X 1 = A : AX 2 = B : BA c tual Fac to