核桃褐斑病及研究

1、核桃褐斑病的研究摘要 林間觀測、室內(nèi)鏡檢及人工接種試驗(yàn)證明核桃盤二孢M(jìn)arssonina juglandis Magn是核桃褐斑病的病原菌，核桃盤二孢5月初開始產(chǎn)生分生孢子，6月中旬為發(fā)病和分生孢子流行高峰期，至7月中旬分生孢子雨后減少，發(fā)病減輕。一般以中幼樹危害嚴(yán)重，樹冠西北側(cè)比東南發(fā)病嚴(yán)重，樹冠下部比中上部發(fā)病嚴(yán)重，內(nèi)部比樹冠表層發(fā)病重。多種殺菌劑對核桃盤二孢M(jìn)arssonina juglandis Magn的室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示，70%甲基托布津、百菌清、多菌靈、退菌特、乙磷鋁錳鋅對病菌分生孢子的萌發(fā)具有強(qiáng)烈的抑制作用； 其中甲基托布津、乙磷鋁錳鋅對病菌菌絲生長的抑制作用明顯。關(guān)鍵詞 核

2、桃褐斑病 研究 核桃褐斑病以前在我市尚未見報(bào)道，是我市城口縣近年來爆發(fā)的一種病害，該病在陜西、河北、吉林、四川、河南、山東等地均有發(fā)生，主要危害葉、嫩梢和果實(shí)。引起初期落葉、枯梢，影響樹木生長。以前各地報(bào)道也多以危害葉片及嫩梢為主，而對危害果實(shí)報(bào)道較少。2000年以前即由引進(jìn)的苗木穗條傳入我市，最初只發(fā)病于少數(shù)長勢衰弱核桃林、幼林且零星分布，造成的損失也不大，并未引起足夠的重視，隨著核桃銀杏大蠶蛾、核桃長足象等蟲災(zāi)的大面積啃食危害，造成的機(jī)械傷害成為病原菌侵入的最佳途徑，同時也成為來年的病原地而反復(fù)侵染傳播，加上2001年4月我市城口等地遭受嚴(yán)重罕見雪災(zāi)，雪災(zāi)造成的嚴(yán)重凍傷地加劇了病害的侵染流

3、行，出現(xiàn)了普遍嚴(yán)重爆發(fā)的勢頭，部分危害嚴(yán)重的果樹出現(xiàn)早衰死亡的跡象，致使核桃大量提前落果或不掛果，產(chǎn)量大幅下降，并造成部分植株生長衰弱至死亡。2002年-2003年課題組對核桃褐斑病進(jìn)行了系列觀察和研究。1 材料和方法1.1 林間發(fā)病情況觀察 于2002-2003年在城口高望試驗(yàn)地內(nèi)進(jìn)行研究試驗(yàn)，防治示范片設(shè)在城口縣高觀、東安、什邡、修齊、明通、白屏、紅花等鄉(xiāng)鎮(zhèn)。選擇不同立地條件具代表性的核桃樹10棵，每樹固定2枝，每枝固定20片葉，結(jié)果時每枝固定10果，分別標(biāo)記編號作固定樣株、樣枝、樣果。每隔5天調(diào)查1次，觀測葉片和果實(shí)上的病斑出現(xiàn)的始盛期，病斑數(shù)量及所占全葉全果面積的百分比。全縣核桃主產(chǎn)區(qū)

4、按不同海拔、不同坡向等立地條件進(jìn)行不定期調(diào)查，研究點(diǎn)及重點(diǎn)核桃主產(chǎn)區(qū)每月調(diào)查1次。均在核桃葉、枝、芽、梢、果實(shí)、主干等部位進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查病害種類、發(fā)病率、感病指數(shù)及對地上落果剖查觀察落果原因。1.2 用病原菌分生孢子捕捉法觀察傳播擴(kuò)散規(guī)律為研究病原孢子的來源，2002年4月1日至9月，我們用5根平均6米高的竹竿，立于坡度、方位、海拔均不同的6個地點(diǎn)，在竹竿2m、3、4m、5m、6m、7m、8m、9m處的東南西北四個不同方位各放置一塊帶甘油的載玻片，每隔2天檢查一次孢子種類、密度及數(shù)量并更換載玻片，記錄分生孢子水平傳播、垂直傳播情況；捕捉病原菌孢子時選擇6棵標(biāo)準(zhǔn)株，在核桃樹冠內(nèi)掛置培養(yǎng)皿，內(nèi)置涂有

5、甘油的玻片用夾子分別掛在標(biāo)準(zhǔn)株樹冠中上下層，每層分東南西北四個方向，逐日定時換取玻片鏡檢，每玻片一次觀測九個視野，分別統(tǒng)計(jì)分生孢子數(shù)以次來分析孢子擴(kuò)散的時期。1.3 核桃褐斑病病原菌的鑒定與分離培養(yǎng)室內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室鑒定 在從各樣地內(nèi)采回的核桃病果、枝葉上，采用徒手切片法切取病健交界處的組織，從5月份開始至8月底每隔5天在室內(nèi)顯微鏡40×10倍10×100倍顯微鏡下觀察；制作病害各個時期的石蠟標(biāo)本封存。1.3.2制作培養(yǎng)基 制作適用于一般真菌培養(yǎng)用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，其配方成分如下：馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂17克。水1000毫升和用于分離病原真菌的肉汁胨培養(yǎng)基，其

6、配方成分如下：牛肉浸膏3克，蛋白胨5-10克，瓊脂17克，水1000毫升。1.3.3病原分離 2002年4月下旬從林中按不同海拔、不同標(biāo)準(zhǔn)地采集核桃病害標(biāo)本，經(jīng)火焰表面消毒后用90%醫(yī)用酒精浸泡3秒，再用無菌水沖洗3次，切取核桃葉、果病部與健康部交界的組織，經(jīng)表面消毒后，置于培養(yǎng)皿PDA培養(yǎng)基上，每只培養(yǎng)皿接45塊；或?qū)⑾竞玫牟〗M織塊接入試管PDA斜面上，每只試管接1塊，均置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（溫度控制2428），采用一般分離的方法分離得病原菌的純種分生孢子懸液，稀釋20-100倍后，用倒平板法接入PDA培養(yǎng)基內(nèi)，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（溫度控制2428），觀察病原菌菌落發(fā)育進(jìn)度、菌落形態(tài)特征

7、。并保存病原菌菌種待用。1.4病原菌接種試驗(yàn)驗(yàn)證病原菌侵染情況 2002年5月課題組采用傷口接種、噴灑接種兩種方法進(jìn)行了接種試驗(yàn)，試驗(yàn)地選擇在高望鎮(zhèn)金洪3社，試驗(yàn)地條件為一塊2-3年生幼林純林，未見發(fā)病，面積約1畝，周圍與農(nóng)田和杉木林，與核桃歷史病區(qū)相隔2公里。1.4.1傷口接種：以組為單位取核桃嫩枝5根，除留頂部20張葉片外，其余的全部去除（用剪刀剪除可以不傷皮），將核桃褐斑病病原菌，加5毫升滅菌水，配成懸懸浮液，用接種針在火焰上滅菌后，蘸孢子懸浮液在葉上刺孔，對照蘸無菌水刺孔。將對照和接種核桃枝分別保濕24個小時，（放在塑料袋內(nèi)）扎上口，于3、5、7、9天觀察發(fā)病情況。 1.4.2噴灑接種

8、：以組為單位取核桃嫩枝5根，除留頂部20張葉片外，其余的全部去除（用剪刀剪除可以不傷皮），將核桃褐斑病病原菌，加10毫升滅菌水，配成懸懸浮液，在顯微鏡下觀察應(yīng)該有2030孢子，用小型噴霧器噴灑孢子懸液于葉面，葉背，對照噴無菌水（先噴對照）。將對照和接種核桃枝分別保濕24個小時，（放在塑料袋內(nèi)）扎上口，于3、5、7、9天觀察發(fā)病情況。1.5 室內(nèi)藥物防治試驗(yàn) 將70%甲基托布津、百菌清、多菌靈、退菌特、乙磷鋁錳鋅5種殺菌劑按不同的濃度，用微型噴霧器分別噴于培養(yǎng)基上，在1820C的情況下，用40%的福爾馬林殺死，鏡檢萌發(fā)率。2、結(jié)果與分析2.1 核桃林受核桃褐斑病危害情況，病情調(diào)查結(jié)果如下表1 核

9、桃褐斑病標(biāo)準(zhǔn)地調(diào)查匯總表 （城口 2001年9月）標(biāo)準(zhǔn)地?cái)?shù)調(diào)查地點(diǎn) 樹種組成海拔(m)調(diào)查株數(shù)(株)感病株數(shù)(株)感病株率(%)調(diào)查果數(shù)(個)感病果數(shù)(個)感病果率（%）感病指數(shù)(%)1東安沙灣核桃10002525100.00%237523751001002東安漆樹核桃1050252392.00%125012501001003高觀金江核桃90011100.00%45734575.4970.533高觀金江核桃90011100.00%27016059.2654.073高觀金江核桃91011100.00%29819665.77483高觀金江核桃90011100.00%1207058403高觀金江核桃

10、9501616100.00%70617061100100小計(jì)高觀金江核桃201890.00%8206718287.5264.414高觀橋坪核桃88011100.00%37026972.768.384高觀橋坪核桃90055100.00%3301986053.334高觀橋坪核桃88011100.00%36925669.3862.334高觀橋坪核桃90077100.00%21982198100100小4高觀橋坪核桃1010100.00%3267292189.4164.145高觀新鴿核桃91055100.00%105010501001006高觀橋口核桃90010990.00%2080208010010

11、0合計(jì)12912498.13%297012761192.9676.66 由表1可見：2001年核桃褐斑病的發(fā)病情況是十分嚴(yán)重的，共調(diào)查129株，發(fā)病株率達(dá)到98.13%，果實(shí)29701個，發(fā)病率達(dá)92.96%，平均感病指數(shù)76.66。2.2、樹冠不同方位發(fā)病情況 表2 樹冠不同方位發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)表 (城口 2002-2003年)方位總?cè)~數(shù)（片）病葉數(shù)（片）發(fā)病率%總果數(shù)（個）病果數(shù)（個）發(fā)病率%東1707845.88%703245.71%南1705934.71%703042.86%西1704828.24%704564.29%北1705130.00%704158.57%從表2看出，樹冠西北側(cè)比東南

12、發(fā)病嚴(yán)重，樹冠下部比中上部發(fā)病嚴(yán)重，內(nèi)部比樹冠表層發(fā)病重。2.3 樹冠不同部位發(fā)病情況 表3 樹冠不同部位發(fā)病情況 (城口 2002-2003年)部位總?cè)~數(shù)（片）病葉數(shù)（片）發(fā)病率%總果數(shù)（個）病果數(shù)（個）發(fā)病率%上部3505214.86%501326.00%中部35011532.86%502652.00%下部35021962.57%503468.00%樹冠內(nèi)部35024570.00%503774.00%樹冠外部3509828.00%501734.00%由表3看出，樹冠下部比中上部發(fā)病嚴(yán)重，內(nèi)部比樹冠表層發(fā)病重，單個病果受光照部位發(fā)病率遠(yuǎn)低于背陰面。2.4 褐斑病癥狀特征 經(jīng)過觀察，本病害多發(fā)

13、生中幼林，危害果實(shí)、嫩梢。果實(shí)和葉片上的病斑灰褐色，近園形或不規(guī)則形，果實(shí)上的病斑初期為灰黑色，果實(shí)硬核期在黑斑上產(chǎn)生白色小點(diǎn)，即病菌的分生孢子盤和分生孢子，后期為白色塊狀物覆蓋整個黑斑或果實(shí)，使果實(shí)變?yōu)榛野咨ü视址Q果實(shí)白星?。?，收果時果實(shí)變黑腐爛。病葉上產(chǎn)生黑色小點(diǎn)，嚴(yán)重發(fā)生時葉片枯焦，提早脫落嫩梢上病斑黑褐色，長橢圓形，稍凹陷，其上亦生小點(diǎn)；對幼苗危害從頂梢嫩葉開始，并擴(kuò)散至整株。2.5 病原菌的確定 在20株病株上取105個病果病葉，分離組織551片，其中核桃盤二孢菌出現(xiàn)547次，占98.7%，用該病原菌的分生孢子懸液做人工接種試驗(yàn)，發(fā)病達(dá)95%（表 4），對照不發(fā)病，經(jīng)過觀察發(fā)病過程

14、與自然發(fā)病過程相同，經(jīng)過再分離，分離到原接種菌分別占97%，證明核桃褐斑病是由核桃盤二孢菌寄生所致；通過上述接種試驗(yàn)以及病組織徒手切片鏡檢后初步鑒定該病原菌為Marssonina juglandis Magn，屬于真菌半知菌亞門腔孢綱黑盤孢目的核桃盤二孢菌（以前稱盤單隔孢，），分生孢子暗褐色，墊狀，分生孢子梗無色，短小，分生孢子無色，紡錘形，微彎，雙胞，上下孢子不等，上細(xì)下大，頂端略彎成短鉤狀、半月型。分生孢子無色，雙孢，上部細(xì)胞頂端常彎成短鉤狀，大小0.2-29.4 4.6-6.2um。其有性世代黑菌綱球殼孢目Gnomonia leptostyla，林間產(chǎn)生很少。2.6 發(fā)病高峰與病菌孢子擴(kuò)

15、散從收集到的孢子種類、時間和數(shù)量情況來看，城口在3月至4月底由于氣溫底，僅能捕捉到少量的雜菌，6月初可以見少量核桃盤二孢分生孢子出現(xiàn)，此時發(fā)病早的少部分受害核桃果實(shí)病斑上出現(xiàn)白色斑點(diǎn)即分生孢子盤，此時開始產(chǎn)生分生孢子；6月底8月10日為分生孢子流行高峰期，此時為病果產(chǎn)生分生孢子高峰期，至7月中旬后分生孢子為成熟期，易被雨水沖刷而急劇減少，孢子捕捉量也接近低谷。 分生孢子的擴(kuò)散主要靠風(fēng)力傳播其傳播，分水平和垂直傳播方向擴(kuò)散，水平傳播距離隨著大氣，而垂直傳播則多在林冠內(nèi)由雨水的沖刷，有頂層向下層傳播，故往往在核桃枝葉茂密的中下層發(fā)病最重，而在林冠由于收陽光照射，發(fā)病很輕。2.7 接種試驗(yàn)結(jié)果表4

16、核桃褐斑病病原菌接種試驗(yàn)結(jié)果 (城口 2002-2003年)處理接種時間接種方法接種部位接種枝數(shù)發(fā)病枝數(shù)發(fā)病率（%）傷口接種2002年5月針刺接種嫩枝201785.00%2002年5月針刺接種果實(shí)201995.00%2002年5月針刺接種葉片201995.00%噴灑接種2002年5月噴灑接種嫩枝201470.00%噴灑接種果實(shí)201260.00%噴灑接種葉片201575.00%對照2002年5月噴灑清水嫩枝2015.00%噴灑清水果實(shí)2015.00%噴灑清水葉片2000.00% 從上表看出，分別接種于嫩枝幼果和葉片上的核桃褐斑病發(fā)病率在85%以上，而對照發(fā)病率在5%以下，觀察到的發(fā)病癥狀與林間

17、發(fā)病一致；對接種材料進(jìn)行再分離得到與原接種菌一致的病原菌，由此可以驗(yàn)證Marssonina juglandis Magn為核桃褐斑病的致病病原菌。2.8 侵染循環(huán)和發(fā)病規(guī)律 從2002年7月-2003年8月經(jīng)過分生孢子捕捉、定點(diǎn)定株觀察結(jié)果顯示，核桃褐斑病的病菌在病枝、葉、病殘組織越冬，5月上旬開始發(fā)病，越冬后的菌絲體5月中下旬就可以產(chǎn)生分生孢子盤及分生孢子，6月下旬到7月底為發(fā)病盛期。分生孢子以7月中下旬為最多，此時病斑不再擴(kuò)散，病害發(fā)育緩慢，當(dāng)年的分生孢子再次侵染后仍可生長發(fā)育直至產(chǎn)生分生孢子，所以林間可觀察到8月中下旬仍有少量核桃褐斑病受害果實(shí)產(chǎn)生分生孢子；分生孢子借風(fēng)雨傳播，再次侵染后

18、潛伏于病果、病枝葉內(nèi)，殘留林間，成為翌年發(fā)病病原。褐斑病病斑擴(kuò)展直徑主要受光照、溫濕度、植株抗病性影響，光照或輻射少、溫度高、濕度大則菌絲生長快，病斑擴(kuò)展迅猛，城口6、7月份是高溫、高濕季節(jié)，果實(shí)病斑在雨后高溫、高濕的情況下病斑擴(kuò)展迅速；在苗圃內(nèi)發(fā)病快，一般45天即可引起栽種密集、通風(fēng)透光不良、排水不好的苗圃幼苗枯萎，受害后可造成大量枯梢，嚴(yán)重時成團(tuán)狀死亡。 2.9 殺菌劑對分生孢子萌發(fā)的藥效試驗(yàn)表5 殺菌劑對分生孢子萌發(fā)的藥效試驗(yàn) （城口2002-2003年）處 理重 復(fù)分 生 孢 子鏡檢數(shù)（個）萌發(fā)數(shù)（個）萌發(fā)率（%）備 注1甲基托布津35048.00%2百菌清363711.11%3多菌靈

19、346817.39%4退菌特35359.43%5乙磷鋁錳鋅37911.27%對照1453986.67%表5顯示，多種殺菌劑對核桃盤二孢M(jìn)arssonina juglandis Magn的室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示，70%甲基托布津、百菌清、多菌靈、退菌特、乙磷鋁錳鋅對病菌分生孢子的萌發(fā)具有強(qiáng)烈的抑制作用； 其中70%甲基托布津、乙磷鋁錳鋅對病菌菌絲生長的抑制作用明顯。3結(jié)論與討論3.1核桃褐斑病為我市城口縣核桃主產(chǎn)區(qū)的新發(fā)病害，在各林區(qū)分布普遍，危害嚴(yán)重，2001年株發(fā)病率高達(dá)98.13%，果實(shí)發(fā)病率達(dá)92.96%，平均感病指數(shù)達(dá)76.66%。一般以中幼樹發(fā)病嚴(yán)重，樹冠西北側(cè)比東南發(fā)病嚴(yán)重，下部比中上部發(fā)病嚴(yán)重，核桃枝葉茂密的中下層發(fā)病最重，而在林冠由于收陽光照射，發(fā)病輕。3.2經(jīng)過對人工接種試驗(yàn)，證明核桃盤二孢M(jìn)arssonina juglandis Magn是核桃褐斑病的致病病原菌； 3.3孢子捕捉試驗(yàn)顯示，5月初可以見病害出現(xiàn)， 6月中旬至7月底為分生孢子流行高峰期，此時為病果產(chǎn)生分生孢子高峰期，至7月中旬分生孢子雨后急劇減少，捕捉量也接近低谷。3.4核桃褐斑病在城口縣核桃林區(qū)5月中旬開始發(fā)病，受害果實(shí)病斑上出現(xiàn)灰褐色斑點(diǎn)，6月