DNA-ladder-protocol細(xì)胞凋亡操作步驟

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上前言:由于實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)問(wèn)題(我想很多實(shí)驗(yàn)室都有這個(gè)問(wèn)題,畢竟很多時(shí)候我們沒(méi)有老外足夠的經(jīng)費(fèi)),我決定利用DNA LADDER來(lái)證明(當(dāng)然還輔助其它的方法)經(jīng)過(guò)藥物處理的細(xì)胞發(fā)生了凋亡還是壞死,所以一直研究DNA LADDER方法,自己曾經(jīng)看了文獻(xiàn)中的很多方法,自己也嘗試了一下,發(fā)現(xiàn)還是最經(jīng)典的是最好的!在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程得到了wscoco78等戰(zhàn)友的大力幫助和建議(下面方案中有一些是wscoco78的原話,表示感謝!),并最終成功了,回顧這一段經(jīng)歷,感覺(jué)對(duì)自己的科研態(tài)度和科研方法都很有啟發(fā),整理了一下資料,希望與大家共享!也希望大家能夠把自己好的成功方法也貼上來(lái),大家一起努

2、力,相信沒(méi)有做不好的實(shí)驗(yàn)!如果大家有什么這方面的問(wèn)題,可以發(fā)信至:biochujun,我會(huì)解答大家的問(wèn)題的!也希望大家批評(píng)指正!注:黑色字體部分為P108109的內(nèi)容(完全一樣),其中紅色部分為我的改動(dòng)以及一些建議,希望您能成功!三、DNA裂解分析 凋亡的標(biāo)準(zhǔn)特征之一，是基因組DNA斷裂為180-200bp的多條寡核小體片段。此現(xiàn)象可用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，是凋亡的特征。由于該技術(shù)只能提供細(xì)胞死亡的定性分析，一般要結(jié)合定量的方法以確定樣品的凋亡程度。另有需注意的重要之處，一些細(xì)胞類型或細(xì)胞系(如K562，10T1/2，Raji)在凋亡時(shí)不是以此種方式斷裂DNA，另外在壞死細(xì)胞中也不發(fā)生這樣的

3、DNA裂解。這不是凋亡細(xì)胞的限定性試驗(yàn)，但不論在何系統(tǒng)中，這都是確定細(xì)胞死亡有用的特性。 DNA裂解測(cè)量有幾種方法，包括FACS分析和完整的標(biāo)記DNA的檢測(cè)。另一種方法TUNEL，需DNA末端標(biāo)記，用于單個(gè)細(xì)胞DNA裂解的測(cè)定。凋亡常常伴隨有DNA的裂解，這些技術(shù)在凋亡測(cè)量中都有意義。(一)瓊脂糖凝膠電泳 1)將5105細(xì)胞移人無(wú)菌的1.5-ml Eppendorf管中，4 2000 rmin離心5分鐘，棄上清。注意不要使用過(guò)多的細(xì)胞，否則隨后的酶解可能不完全，形成很黏稠的DNA溶液。儲(chǔ)軍注:細(xì)胞接種數(shù):我一般是將細(xì)胞按照5105細(xì)胞/35mm平皿接種,然后培養(yǎng)兩天(因?yàn)榻臃N后的細(xì)胞 有部分會(huì)

4、死亡,所以培養(yǎng)一天的細(xì)胞可能會(huì)少,個(gè)人覺(jué)得培養(yǎng)兩天比較合適,細(xì)胞不要太多了!),然 后再加藥物處理,處理時(shí)間看您藥物的類型和劑量,不過(guò)建議您做幾個(gè)梯度,同時(shí)進(jìn)行,這樣可以看出 劑量和時(shí)間對(duì)細(xì)胞凋亡的影響程度,我當(dāng)時(shí)做的是每隔8h,測(cè)量一次,太累,建議您每隔12h或者24h 測(cè)量一次 離心速度:我是4 2000 rmin離心5分鐘,按照我實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)換算RCF(相對(duì)離心力)為367g 細(xì)胞收集: 貼壁細(xì)胞需要把漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞（胰酶消化）一起收集，離心，然后用預(yù)冷的 PBS再洗滌一次,注意丟棄上清液要小心,注意不要把細(xì)胞吸走了,我一般使用1ml和0.1ml兩個(gè)移 液槍來(lái)操作的,1ml取走大部分

5、上清夜,0.1ml把剩余的小心取走!2)加入20l溶解緩沖液20 mmol/L EDTA，100 mmoll/L Tris，pH8.0，0.8(w/v) SDS 。用移液管尖混勻細(xì)胞沉淀。 小心：SDS(見(jiàn)附錄5) 不要形成強(qiáng)的旋渦，因?yàn)楦叻肿恿緿NA可能被剪切。儲(chǔ)軍注: 加入溶解緩沖液前:雖然上清液被丟棄,但是一般在管底還是有少量上清液,此時(shí)可以用食指輕 彈管底,使得細(xì)胞沉淀盡可能融解,為加入溶解緩沖液后混勻創(chuàng)造條件。 溶解緩沖液的配制: 把EDTA,Tris-base,SDS放在一起攪拌混勻，使用pH計(jì)測(cè)得其pH值大概 在8.0左右，根本不需要加HCL調(diào)pH值!只要你的試劑好（fluka、

6、amresco、sigma），照 這些經(jīng)典方法基本上都不需要調(diào)pH值，真的很準(zhǔn)，上下0.5而已。 混勻細(xì)胞沉淀:有了,這步應(yīng)該可以很好做了, 把槍尖浸入液面下，部分按下按鈕(很重要,否 則溶液里有很多氣泡,導(dǎo)致溶解緩沖液沒(méi)有充分混勻啊!)，只是形成暗流，在液面下涌動(dòng)，氣體 不放出來(lái)自然無(wú)氣泡!3)加10l RNA酶A/T1混合液(分別為500U/ml，20000Uml，Ambion Inc)，輕彈管尖混勻，不要形成旋渦。37孵育30-120分鐘。儲(chǔ)軍注: 混勻:方法同2) 我采用37孵育120min,也采用過(guò)90min,效果一樣 RNA酶A/T1混合液:我只是配了500U/ml的RNA酶A,不

7、需要T1,效果也是很好!,而且我的 RNA酶也沒(méi)有進(jìn)行煮沸處理,不過(guò)最好是處理一下了! 將封口膜將EP管封好,以免EP管中的液體蒸發(fā)4)加10l蛋白酶K(20mg/ml，Ambion)，輕彈管尖混勻，50孵育至少90min，也可過(guò)夜。儲(chǔ)軍注: 在加蛋白酶K之前,輕輕將EP甩幾下,使得貼在管壁和管蓋上的水滴流至管底 我采用55水浴,時(shí)間曾用過(guò)3h,4h,6h,過(guò)夜,效果差不多,根據(jù)您自己的個(gè)人時(shí)間決定,比如你 現(xiàn)在需要陪MM看碟了,就讓它過(guò)夜吧,沒(méi)關(guān)系的了! 加入蛋白酶K后，溶液立即出現(xiàn)絮狀白色物，蛋白酶K是冷的緣故，加到37的裂解液自然 會(huì)出現(xiàn)絮狀物，再涌動(dòng)涌動(dòng)（同2）,然后再放入55一段時(shí)間

8、就消失了，不是什么怪現(xiàn)象 將封口膜將EP管封好,以免EP管中的液體蒸發(fā) 做完后, 輕輕將EP甩幾下,使得貼在管壁和管蓋上的水滴流至管底,這時(shí)可以進(jìn)行電泳或在-20 保存以后跑電泳5)加5l 6DNA加樣緩沖液(30甘油，025溴酚藍(lán))，在含0.5g/ml溴化乙錠TAE的1-1.5瓊脂糖凝膠干孔中加DNA樣品。小心：甘油；溴酚藍(lán)；溴化乙錠(見(jiàn)附錄5) 為了避免由于某些制備液黏稠而致DNA樣品損失，推薦加樣應(yīng)在干孔中(電泳池中加入緩沖液之前)。參考加樣量為100bp大小。儲(chǔ)軍注: 膠濃度:1%/1.5%的我都用過(guò),但是發(fā)現(xiàn)效果不好,建議使用2%,我就是用的2% 電泳相關(guān)參數(shù): 最好選擇24V/cm

9、電壓，用大的電泳槽（10cm以上）,我使用23cm電泳槽,電 壓為45V,跑6h30min 加樣緩沖液:我一般每孔加20l樣品+4l 10loading buffer(加液緩沖液用量加倍了,主要是 為了使樣品中的DNA樣品能否充分沉積在孔中)6)低電壓電泳，可以促進(jìn)DNA片段的分離(如35 V，4小時(shí)，或至染料泳動(dòng)到2/3處)。儲(chǔ)軍注:當(dāng)膠放入電泳槽后,小心加TAE,以免孔中的樣品流到外面 跑電泳過(guò)程,注意不要跑歪了,不時(shí)調(diào)整一下電泳槽的水平7)DNA序列梯最后有紫外光顯示，攝影。凋亡細(xì)胞形成明顯的DNA梯度，而壞死細(xì)胞為不清晰的成片條帶(或無(wú)DNA裂解)?；罴?xì)胞DNA在膠頂部，是一個(gè)高分子量

10、條帶。凋亡并不都能形成梯度，這取決于所研究的細(xì)胞類型。另外，壞死細(xì)胞在某些情況下能產(chǎn)生梯度。凋亡中如發(fā)生DNA裂解，通常會(huì)失去膜整合性。如因生存力喪失梯度形成明顯遲緩，則不像是凋亡發(fā)生。儲(chǔ)軍注:我一般泡20min EB吧,然后將它在水龍頭下輕輕漂洗45遍,然后開(kāi)始照相了,最好使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,這樣效果好,數(shù)碼相機(jī)效果不是特別好注意事項(xiàng)建議使用寬口移液管移取基因組DNA，以避免DNA的剪切。寬口吸頭可從商業(yè)途徑獲得，或?qū)?00l吸頭尖切掉而制得。吸頭應(yīng)高壓滅菌，避免DNA酶污染?？梢圆辉诃傊悄z中直接加入溴化乙啶，而是電泳后用含1lg/ml溴化乙啶的TAE緩沖液染1小時(shí)，用水脫色后進(jìn)行

11、DNA顯色。儲(chǔ)軍注:我第一次做DNA LADDER實(shí)驗(yàn)時(shí),是自己做的寬口吸頭,但后來(lái)發(fā)現(xiàn)其實(shí)沒(méi)必要,直接使用已滅過(guò)菌的tip頭效果一樣,只要在操作過(guò)程小心就行了!實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下(一)細(xì)胞凋亡結(jié)果說(shuō)明: 細(xì)胞為SP2/0（鼠骨髓瘤細(xì)胞），10ug/ml順鉑（終濃度）處理，每隔8h，進(jìn)行分析.凝膠兩端為lamda marker，從左至右分別為空白（未用順鉑處理），處理8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h，我可是連續(xù)奮斗了三個(gè)晚上啊，好累，不過(guò)值得，結(jié)果非常不錯(cuò)！：）隨著時(shí)間的累積,細(xì)胞凋亡程度在加大,一切都很明顯!(二)細(xì)胞壞死結(jié)果說(shuō)明: 細(xì)胞為SPC-A1（人源肺癌

12、細(xì)胞），10ug/ml順鉑（終濃度）處理，每隔8h，進(jìn)行分析.凝膠兩端為lamda marker，從左至右分別為空白（未用順鉑處理），處理8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h，我可是連續(xù)奮斗了三個(gè)晚上啊，好累，不過(guò)值得，結(jié)果非常不錯(cuò)?。海?隨著時(shí)間的累積,細(xì)胞壞死程度在加大,一切都很明顯!說(shuō)明:本來(lái)不想將結(jié)果列出的,有點(diǎn)怕有人將我的結(jié)果當(dāng)作自己的成果,我不希望有這種情況出現(xiàn),畢竟造假是不道德的!祝大家新年快樂(lè)!實(shí)驗(yàn)順利!儲(chǔ)軍2004-1-9于華中科技大學(xué)【求助】DNA瓊脂糖凝膠電泳方法我準(zhǔn)備做DNA瓊脂糖凝膠電泳,請(qǐng)教下列幾個(gè)問(wèn)題:1.RNA酶A/T1混合液中A

13、/T1是什么,它有什么作用?2.離心后DNA是存在上清液中還是在沉淀中?3.將上清液在等體積的苯酚1氯仿（1:1）、苯酚1氯仿1異丙醇（25:24:1）和氯仿中各提取1次.這一步的作用是什么?4.在上清液中加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積的冷無(wú)水乙醇，20靜置過(guò)夜.這一步作用又是什么?另:如有全面的操作過(guò)程請(qǐng)公布一下!非常感謝! 2.2.1.1 細(xì)菌中質(zhì)粒DNA的制備堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA1) 挑取培養(yǎng)基上的白色單菌落，接種于5ml含適當(dāng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2) 取1.5ml菌液于小離心管中，13000rpm離心1-2min，富集菌體，重復(fù)一次；3) 菌

14、體沉淀重懸于300ul溶液I中，振蕩混勻；4) 加入新鮮配置的300ul溶液II,上下顛倒混勻，冰上放置10min；5) 加入300ul溶液III，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰上放置5分鐘；6）室溫13000rpm離心15min；7) 取上清，加入等體積的Tris-中性酚,混勻后13000rpm離心10min；8) 取上清，再用等體積氯仿抽提一次；9) 取上清,加入2倍體積無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻至少5min,-20放置30min；10）13000rpm離心15min；11）棄上清, 抽干后溶于適量雙蒸水中。質(zhì)粒提取所需的溶液：溶液I：50mmol/L Tris-Hcl (pH7.5)；10mmol/L EDTA(pH 7.5)；125ug/ml RNase A;溶液II：0.2mol/L NaOH; 1% SDS；溶液III：1.32mol/L KAC苯酚1氯仿（1:1）、苯酚1氯仿1異丙醇（25:24:1）和氯仿中各提取1次使蛋白質(zhì)變性和抽提蛋白的作用在上清液中加入1/10體積3mol/L醋酸鈉使堿裂解變性質(zhì)粒復(fù)性，而基因組由于過(guò)大而不能及時(shí)復(fù)性而和蛋白一起纏繞沉淀倍體積的冷無(wú)水乙醇，20靜置過(guò)夜是充分洗除殘留的苯酚氯仿和使質(zhì)粒沉淀的作用至于RNA酶A/T1混合液中A/T1是什么,它有什么作用?中的A/T1我沒(méi)有