克隆基因的誘變

1、克隆基因的克隆基因的誘變誘變誘變育種:以誘發(fā)基因突變?yōu)槟康囊环N育種方法。 1、缺失誘變：用可從凹進(jìn)的3端沿3到5端方向移去一條鏈的外切核酸酶進(jìn)行單向缺失，再用一種單鏈特異性異性核酸酶制成平末端用于連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具缺失的克隆。2、定點(diǎn)誘變：在一個(gè)特定位點(diǎn)改變一個(gè)或幾個(gè)核苷酸通常需要將誘變引物與模板退火，再用DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈。3、PCR誘變：用正向與反向突變的引物及可結(jié)合常用載體序列的另一對(duì)引物，進(jìn)行兩組PCR反應(yīng)來(lái)分別擴(kuò)增待突變的DNA的5與3部分。然后將這兩組PCR產(chǎn)物混合，并進(jìn)行只用外部引物的另一PCR。這些產(chǎn)物中部分再通過(guò)亞克隆代替最初步分子中要突變的區(qū)域 缺失誘變 S1核酸酶核酸

2、酶 ：來(lái)源于稻谷曲霉(Aspergillusoryzae)，是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶，在最適的酶催反應(yīng)條件下，降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5，-磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。 S1核酸酶的單鏈水解功能可以作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)，并從單鏈部位切斷核酸分子，而且這種單鏈區(qū)可以小到只有一個(gè)堿基對(duì)的程度。由于具備這種功能，使S1核酸酶在分析核酸雜交分子(RNA-DNA)的結(jié)構(gòu)、給RNA分子定位、測(cè)定真核基因中間隔子序列的位置、去除去除DNADNA片段中突出的單鏈尾片段中突出的單鏈尾，以及打開(kāi)在雙鏈cDNA合成期間形成的發(fā)夾環(huán)。綠豆核酸酶綠豆核酸酶 ：來(lái)源于綠豆芽的核酸酶。將單鏈DNA降解為5端

3、帶磷酸基團(tuán)的單核苷酸或寡核苷酸。雙鏈DNA、雙鏈RNA及DNA與RNa雜交體對(duì)此酶相對(duì)不敏感。但此酶大量時(shí)也能將雙鏈核酸完全降解。其物理性質(zhì)及催化性質(zhì)與S1核酸酶相似，但綠豆核酸酶的作用比S1酶更溫和。用于使DNA突出端變?yōu)槠蕉恕?BAL 31 的主要活性為3“外切核酸酶活性。它可從線狀DNA兩條鏈的3”端去除單核苷酸。BAL 31還是一個(gè)內(nèi)切核酸酶，因此利用其3“外切酶活性連續(xù)去除3”端單核苷酸后形成的單鏈DNA，可被BAL 31的內(nèi)切酶活性所降解。 缺失誘變環(huán)狀D N A分子 中較小片段的缺 失1、環(huán)狀D NA的某一位點(diǎn)2、只有一個(gè)切點(diǎn)且切點(diǎn)位于該位 點(diǎn)附近的限制酶將環(huán)狀DNA切成線狀分子

4、3、外切核酸酶將線 狀D N A 的沿3到5端方向移去一條鏈4、用一種單鏈特異性異性核酸酶（S1或綠豆核酸酶）或綠豆核酸酶）制成平末端用于連接5、用連接酶將切割后的線狀D N A連接環(huán)化6、經(jīng)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具缺失的克隆 無(wú)論采用哪種內(nèi)切酶,都可以通過(guò)控制 反應(yīng)酶的濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和其它 條件控制切割的程度。利用這 種方 法,可 以在 DNA 上制造 20 一20 0 0堿基對(duì)的缺失。定點(diǎn)誘變1、將一段合適的DN A片段克隆到 M13載體上,形成重組噬菌體 M13。2、從重組M13內(nèi)制備單鏈的目的DNA3、設(shè)計(jì)并合成包含靶堿基的寡聚核苷酸4、將寡聚核昔酸與目的D N A雜交5、用 DNA 聚合

5、酶延伸寡聚核昔酸,完成互補(bǔ)鏈的合成6、傳染敏感的寄主細(xì)菌細(xì) 胞7、篩選帶有突變位點(diǎn)的噬 菌體8、從已突變了的重組噬 菌體內(nèi)分離單鏈DNA9、對(duì)分離到的單鏈DNA進(jìn)行 堿基序列分析再證實(shí)突變的可靠性。10、從復(fù)制型的雙鏈重 組 M13內(nèi)分離已突變了的D NA 片段11、用 突變的DNA 片段 代換 野生型D N A的相應(yīng)片段 滾環(huán)式復(fù)制(rolling circle replication)是噬菌體中常見(jiàn)的DNA復(fù)制方式。滾環(huán)式復(fù)制的一個(gè)特點(diǎn)是以一條環(huán)狀單鏈DNA為模板，進(jìn)行新的DNA環(huán)狀分子合成。噬菌體的雙鏈DNA環(huán)狀分子先在一條單鏈的復(fù)制起點(diǎn)上產(chǎn)生一個(gè)切口(nick)，然后以另一條單鏈為模板不斷地合成新的單鏈。釋放出的新合成的單鏈或是先復(fù)制成雙鏈