海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光及其應(yīng)用

1、第28卷第2期2007年4月發(fā)光學(xué)報(bào)CHINESE JOURNALOF LUMINESCENCEVol·28 No·2Apr., 2007文章編號(hào): 1000-7032(2007)02-0167-06海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光及其應(yīng)用張進(jìn)興,逄愛(ài)梅,孫修勤,孫培光(國(guó)家海洋局第一海洋研究所,山東青島266061)摘要:海洋發(fā)光細(xì)菌是一類在正常的生理?xiàng)l件下能夠發(fā)射可見(jiàn)光的異養(yǎng)細(xì)菌,其發(fā)光特性與細(xì)菌體內(nèi)的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、海洋環(huán)境要素、水中污染物等多種因素有關(guān)。通過(guò)對(duì)海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光特性及其應(yīng)用可能性的論述,如利用發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度與水中毒物的濃度、毒性的關(guān)系檢測(cè)污染物;利用潛艇航行時(shí)激發(fā)的生

2、物發(fā)光勾畫出潛艇渦動(dòng)的光尾流可跟蹤探測(cè)潛艇;海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光特性還可用以改進(jìn)水下光通訊與探測(cè)、海洋水色遙感、海洋發(fā)光細(xì)菌分類、發(fā)光免疫和抗菌素濃度測(cè)定等方面。闡明海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光特性的重要研究意義并為進(jìn)一步開(kāi)展應(yīng)用研究提供借鑒。關(guān)鍵詞:海洋發(fā)光細(xì)菌;發(fā)光特性;應(yīng)用研究中圖分類號(hào):O482. 31PACC:3250F; 7860P文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A收稿日期:2006-08-25;修訂日期:2006-11-24基金項(xiàng)目:國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目(海洋微生物菌種種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)化整理整合與共享)(2004DKA30640);國(guó)家908項(xiàng)目(我國(guó)近海海洋綜合調(diào)查與評(píng)價(jià))基金資助項(xiàng)目作者簡(jiǎn)介:張進(jìn)興(1954

3、-),男,山東濰坊人,研究員,主要從事應(yīng)用微生物學(xué)的研究。E-mai:l zhangjx fio. org. cn, Te:l (0532)889674491引言海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光現(xiàn)象一直是人們十分關(guān)注的問(wèn)題,各國(guó)科學(xué)家對(duì)此進(jìn)行了多方面的調(diào)查研究。國(guó)內(nèi)對(duì)海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光的觀測(cè)研究已有多年歷史。在國(guó)標(biāo)海洋調(diào)查規(guī)范中,早已把“海發(fā)光”列為海洋調(diào)查內(nèi)容,其中“彌漫型”海發(fā)光便是由海洋發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生的,作為常規(guī)海洋觀測(cè)項(xiàng)目之一,已積累了許多現(xiàn)場(chǎng)觀測(cè)資料。近年來(lái),由于實(shí)際應(yīng)用的需要,對(duì)海洋發(fā)光細(xì)菌的觀測(cè)研究有所加強(qiáng),如現(xiàn)正進(jìn)行的西北太平洋環(huán)境調(diào)查研究項(xiàng)目中,就包含了海洋發(fā)光細(xì)菌的分布調(diào)查。有關(guān)海洋發(fā)光細(xì)菌

4、的研究?jī)?nèi)容相當(dāng)廣泛,從近期國(guó)內(nèi)外發(fā)表的文獻(xiàn)資料看,主要有海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)理,發(fā)光基因、熒光素酶、發(fā)光特性以及某些應(yīng)用方法等研究。在發(fā)光特性研究方面,以往更多地側(cè)重于細(xì)菌發(fā)光與其體內(nèi)物質(zhì)、結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究,即側(cè)重于微生物學(xué)和生物化學(xué)方面的研究,而在環(huán)境要素和細(xì)菌種類、密度等對(duì)細(xì)菌光譜的影響方面的研究相對(duì)較少。在海洋發(fā)光細(xì)菌的研究中,發(fā)光特性及其應(yīng)用研究是一項(xiàng)重要內(nèi)容。利用細(xì)菌的發(fā)光特性,開(kāi)展應(yīng)用研究,尤其結(jié)合光學(xué)原理,制作某些傳感器,用于海洋環(huán)境污染監(jiān)測(cè),已引起國(guó)內(nèi)外廣泛重視。為了研究海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光特性的應(yīng)用前景,首先必須深入了解海洋發(fā)光細(xì)菌的性質(zhì),積累發(fā)光細(xì)菌發(fā)光特性的基礎(chǔ)資料和研究經(jīng)驗(yàn)。

5、然后,依據(jù)細(xì)菌發(fā)光的不同特性和應(yīng)用可能性,開(kāi)展相應(yīng)的應(yīng)用研究。此類研究不僅可為細(xì)菌發(fā)光特性的應(yīng)用提供有效方法,并將促進(jìn)海洋生物學(xué)、海洋光學(xué)、生物化學(xué)之間交叉學(xué)科綜合研究的發(fā)展,為從物理學(xué)角度研究海洋發(fā)光細(xì)菌提供依據(jù)。為此,本文擬在簡(jiǎn)要綜述海洋發(fā)光細(xì)菌的分布特點(diǎn)與發(fā)光機(jī)理研究基礎(chǔ)上,論述發(fā)光特性及其在海洋環(huán)境污染物監(jiān)測(cè)、發(fā)光細(xì)菌分類、水下通訊探測(cè)和水色遙感上的應(yīng)用研究現(xiàn)狀,為進(jìn)一步開(kāi)展海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光特性的應(yīng)用研究提供借鑒。2分布特點(diǎn)與發(fā)光機(jī)理海洋發(fā)光細(xì)菌是一類從海水中或者從海洋動(dòng)物體表、消化道和發(fā)光器官上以及海底沉積物中可以分離到的,在適宜條件下能夠發(fā)射可見(jiàn)光的異養(yǎng)細(xì)菌。海洋中的發(fā)光細(xì)菌,除了

6、在海水中自由浮游生存的外,還有寄生于其他海洋生物體的。許多海洋生物的發(fā)光與發(fā)光細(xì)菌有關(guān),如某些魚類、軟體動(dòng)物等的發(fā)光是由海洋發(fā)光細(xì)菌寄生、共168發(fā)光學(xué)報(bào)第28卷?xiàng)嫠隆：Ｑ蟀l(fā)光細(xì)菌的種類不是很多,但其分布卻非常廣,從海表層至深海;從熱帶海洋至非常寒冷的極地海域都有其蹤跡。為了更好地掌握海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光特性及應(yīng)用可能性,除需要了解發(fā)光細(xì)菌的分布特點(diǎn)外,也有必要對(duì)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)理作簡(jiǎn)要介紹。發(fā)光機(jī)理的研究結(jié)果表明,不同種類的發(fā)光細(xì)菌其發(fā)光機(jī)理是基本一致的,都必須有細(xì)菌熒光素酶(LE)、還原性的黃素單核苷酸(FMN·H2)、氧氣(O2)、長(zhǎng)鏈脂肪醛(RCHO)的參與,大致歷程如下

7、:FMNH2+LEFMNH2·LE +O2LE·FMNH2·O2+RCHOLE·FMNH2·O2·RCHOLE·FMN+H2O+RCOOH+光概括地說(shuō),細(xì)菌生物發(fā)光反應(yīng)是由分子氧作用,胞內(nèi)熒光酶催化,將還原態(tài)的黃素單核苷酸及長(zhǎng)鏈脂肪醛氧化為黃素單核苷酸(FMN)及長(zhǎng)鏈脂肪酸,同時(shí)釋放出藍(lán)綠光。發(fā)光細(xì)菌發(fā)出的光是連續(xù)的,屬“冷光”。這是一種化學(xué)發(fā)光類型,在化學(xué)能轉(zhuǎn)換為輻射能的過(guò)程中發(fā)光。熒光素酶是菌體內(nèi)催化熒光素或脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱,細(xì)菌熒光素酶是含、兩個(gè)多肽亞基的單加氧酶,只有兩個(gè)亞基共存時(shí)才有活性。從不同海洋發(fā)光

8、細(xì)菌中提取的細(xì)菌熒光素酶其分子量差別較小。由于海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光細(xì)胞內(nèi)含有熒光素和熒光素酶,有了氧氣,細(xì)胞內(nèi)的熒光素就受到熒光素酶的催化作用而吸收能量,變成氧化熒光素并釋放光子而發(fā)光。不同種類的海洋發(fā)光細(xì)菌可產(chǎn)生不同的熒光素酶,發(fā)光特性也不同。3發(fā)光特性研究海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光特性研究,包括不同菌種所具有的特異光譜特性研究,發(fā)光強(qiáng)度、發(fā)光特征參數(shù)和發(fā)光條件對(duì)細(xì)菌發(fā)光的影響等項(xiàng)研究,以及不同種類的發(fā)光組分和酶結(jié)構(gòu)的差異研究。各種生物發(fā)光的本質(zhì)大體一樣,都是由一組化合物熒光酶和高能化合物腺苷三磷酸等構(gòu)成發(fā)光光源。它們發(fā)出的藍(lán)、青、綠、黃、橙等不同顏色的光,是因?yàn)楦髯缘臒晒馑亍晒饷冈诮Y(jié)構(gòu)上的微小差異引

9、起的。發(fā)光細(xì)菌的光譜范圍約420670 nm,max在475485 nm左右,為單一發(fā)射峰,max和半峰全寬有種屬差異。從發(fā)光特征參數(shù)發(fā)光量子產(chǎn)率來(lái)看,其生物發(fā)光反應(yīng)特點(diǎn)是高光子產(chǎn)生效率: 0. 50. 8。通過(guò)發(fā)射光的比率可以推出未知成分的濃度,因此測(cè)定化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中的發(fā)射光是非常有用的。反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的光與發(fā)射光的量子產(chǎn)率是直接相關(guān)的,與相應(yīng)的發(fā)光物質(zhì)的濃度成比例。因此,反應(yīng)過(guò)程中的光可以相對(duì)反映出目標(biāo)樣品中發(fā)光物質(zhì)的量。有關(guān)生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移是指在一個(gè)發(fā)光或熒光供體和一個(gè)熒光受體(如綠色熒光蛋白的突變體GFP)之間會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。利用這種方法可以非侵入性地監(jiān)測(cè)特異蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相

10、互作用。如Kudryasheva等1研究了細(xì)菌生物發(fā)光電子激發(fā)態(tài)上限能量估算,用染色分子作為能量接收者,證實(shí)了細(xì)菌生物發(fā)光電子激發(fā)態(tài)上限活動(dòng)的假設(shè)。并給出了MSB(Methylstyryl benzene)中的偶聯(lián)酶系統(tǒng)NADHFMN-氧化還原酶-熒光素酶的細(xì)菌發(fā)光光譜。從已有的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果看,大多數(shù)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光,僅發(fā)生于高細(xì)胞密度,細(xì)菌發(fā)光依賴于培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)蛋白的濃度和積累。細(xì)菌種類和生長(zhǎng)條件,包括溫度、鹽度和營(yíng)養(yǎng)成分以及其他實(shí)驗(yàn)條件對(duì)其發(fā)光也有影響2。在正常的生理?xiàng)l件下,發(fā)光細(xì)菌能發(fā)出波長(zhǎng)為450490 nm的藍(lán)綠光;在一定的試驗(yàn)條件下,發(fā)光強(qiáng)度是恒定的3。但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),發(fā)光桿菌

11、屬經(jīng)某種處理后其發(fā)光光譜產(chǎn)生位移,如HajimeKaratani等4在由發(fā)光桿菌發(fā)光現(xiàn)象產(chǎn)生的兩種熒光蛋白質(zhì)的特性研究中,發(fā)現(xiàn)從深海發(fā)光細(xì)菌中分離的熒光蛋白質(zhì)中,發(fā)光桿菌屬經(jīng)提純、克隆和排序出兩種熒光蛋白質(zhì),最大發(fā)射的熒光波長(zhǎng)在488, 517 nm。在尿素中刺激熒光蛋白質(zhì)引起488 nm譜段光強(qiáng)度的減弱,顯示出新的熒光峰值為423 nm;尿素消除,部分可逆轉(zhuǎn)。對(duì)海洋發(fā)光細(xì)菌的體內(nèi)生物發(fā)光光譜的研究,如朱文杰等5發(fā)現(xiàn),發(fā)光光譜有種屬特異性。以最大發(fā)射波長(zhǎng)來(lái)說(shuō),弧菌屬為482485 nm,發(fā)光桿菌屬則在474480 nm。其中東方弧菌為(484±1) nm,半峰全寬為(92±

12、1) nm。又如朱文杰等6對(duì)東方弧菌的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的發(fā)光研究,從東方弧菌的細(xì)胞裂解液中分離到一種組分,僅需長(zhǎng)鏈脂肪醛就可以啟動(dòng)發(fā)光,其最大發(fā)射峰在480490 nm。他們還測(cè)量提取物的吸收光譜和熒光光譜,其中吸收光譜顯示在414 nm處有一最大吸收峰,在380, 485 nm處各有一個(gè)弱吸收峰;反應(yīng)后的吸收光譜,除380 nm峰消失外,其余不第2期張進(jìn)興,等:海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光及其應(yīng)用169變。汪杰等7則將發(fā)光細(xì)菌的生物發(fā)光光譜作微分處理,使各種發(fā)光細(xì)菌在光譜上的差異充分顯示出來(lái)。近年來(lái),在有關(guān)刊物上發(fā)表了多篇關(guān)于海洋環(huán)境要素、細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)成分、細(xì)菌體內(nèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)等對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光特性影響的研究論文,主

13、要的有,杜宗軍等8對(duì)一株海洋發(fā)光細(xì)菌的分離鑒定及其發(fā)光條件的初步研究表明,該菌種在pH7. 5、溫度30、NaCl濃度3. 0%時(shí),發(fā)光強(qiáng)度最高;正常發(fā)光的溫度在2040、pH=6. 08. 0;液體培養(yǎng)4 h開(kāi)始發(fā)光, 6 h后發(fā)光達(dá)到峰值,持續(xù)發(fā)光時(shí)間可達(dá)19 h。水體的pH值、溫度、鹽度和營(yíng)養(yǎng)成分等環(huán)境條件的變化將引起熒光素酶的改變,從而改變細(xì)菌的發(fā)光特性。Hkaratani等9關(guān)于海洋中費(fèi)氏弧菌生物發(fā)光的光譜分布和它的熒光蛋白及細(xì)胞密度之間的關(guān)系研究,該研究表明,費(fèi)氏弧菌產(chǎn)生黃色熒光蛋白(YFP)與產(chǎn)生藍(lán)色熒光蛋白(BFP)之比,和細(xì)胞密度、菌體生長(zhǎng)時(shí)間有關(guān);費(fèi)氏弧菌在細(xì)胞生長(zhǎng)期間生物

14、發(fā)光的改變,依賴于細(xì)胞內(nèi)YFP水平。Miyamoto等10研究了S腺苷-L-蛋氨酸有關(guān)結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白對(duì)哈維氏弧菌發(fā)光的影響。王江安等11潛艇光尾流產(chǎn)生機(jī)理及其探測(cè)技術(shù)研究表明,不同的聲波、電磁波的波長(zhǎng)對(duì)不同種類的海洋發(fā)光細(xì)菌的生物效應(yīng)是不同的,在受到外界電磁場(chǎng)刺激下,將影響發(fā)光反應(yīng)生理過(guò)程,發(fā)光強(qiáng)度有所改變,強(qiáng)度的變化與受試物的類型和強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)呈相關(guān)關(guān)系。發(fā)光特性與熒光素酶的結(jié)構(gòu)有關(guān),配體蛋白的相互作用,對(duì)化學(xué)修飾和致突變實(shí)驗(yàn)中測(cè)定特殊氨基酸殘基的功能方面是非常有用的,而氨基酸殘基的突變可引起發(fā)光光譜的位移。對(duì)這些改變加以分析研究,將有助于加深對(duì)細(xì)菌發(fā)光規(guī)律性的認(rèn)識(shí)。通過(guò)基因重組及細(xì)胞融

15、合技術(shù)可獲得能滿足各種用途的熒光素酶,改變發(fā)射光波長(zhǎng)。有關(guān)這方面的綜合研究報(bào)道如茆燦泉等12發(fā)光細(xì)菌lux報(bào)告基因系統(tǒng)的評(píng)價(jià)及應(yīng)用和張菊梅等13熒光素酶研究進(jìn)展。4細(xì)菌發(fā)光的應(yīng)用研究4.1在海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用海洋環(huán)境中的污染物種類和數(shù)量日益增多,傳統(tǒng)的分析鑒定手段難以達(dá)到實(shí)時(shí)、迅速、在線的要求。發(fā)展新的快速、準(zhǔn)確、有效的分析方法與檢測(cè)技術(shù)顯得非常迫切、必要。由于發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度與某些污染物的濃度呈較好的線性關(guān)系,能夠穩(wěn)定、快速地反映環(huán)境中的污染物濃度變化;而且檢測(cè)時(shí)間短(在515 min)、靈敏度高(細(xì)胞基本物質(zhì)代謝受到影響前發(fā)光反應(yīng)先被抑制)海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光特性與環(huán)境中有毒污染物的毒性

16、有關(guān),可用于毒物的檢測(cè)。杜宗軍等2發(fā)光細(xì)菌的研究和應(yīng)用提出利用發(fā)光細(xì)菌來(lái)檢測(cè)有毒物質(zhì)。由于有毒物質(zhì)僅干擾發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光系統(tǒng),費(fèi)時(shí)較少且靈敏度高,操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確,所以利用發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度作為指標(biāo)來(lái)監(jiān)測(cè)有毒物質(zhì),在國(guó)內(nèi)外越來(lái)越受到重視。我國(guó)于1995年將這一方法列為環(huán)境毒性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T15441-1995)。這方面的研究有:黃正等14發(fā)光細(xì)菌的生理特性及其在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用,就發(fā)光細(xì)菌的生理特性、發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用及該技術(shù)的新進(jìn)展3個(gè)方面進(jìn)行了較為全面的概述,評(píng)價(jià)了發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)的特點(diǎn),提出了該技術(shù)今后的發(fā)展方向,預(yù)視它將成為環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要手段。薛建華等15發(fā)光

17、細(xì)菌應(yīng)用于監(jiān)測(cè)水環(huán)境污染的研究中指出,水環(huán)境中的汞、苯酚都抑制細(xì)菌發(fā)光,且抑制程度與汞、苯酚的濃度之間存在著明顯的相關(guān)關(guān)系。吳偉等16發(fā)光細(xì)菌在漁業(yè)水域污染物毒性快速檢測(cè)中的應(yīng)用一文中,以明亮發(fā)光桿菌為指示生物,對(duì)漁業(yè)區(qū)域中污染物的急性毒性進(jìn)行了檢測(cè);同時(shí)研究了pH值、溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。研究表明,發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)是一種快速、簡(jiǎn)便的毒性測(cè)試方法,在溫度2030, pH6. 09. 0條件下進(jìn)行的測(cè)試,其結(jié)果與魚類毒性試驗(yàn)可以互相替代。林志芬等17在發(fā)光菌生物毒性測(cè)試方法的改進(jìn)中,針對(duì)發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度本底差異較大,檢測(cè)期間發(fā)光變化幅度寬的問(wèn)題,在傳統(tǒng)發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)中引入校正因子(P2丙酮)

18、;同時(shí)也研究了磁力攪拌時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)代數(shù)和培養(yǎng)溫度等條件對(duì)EC50測(cè)定值的影響。海洋發(fā)光細(xì)菌種類不同時(shí),發(fā)光特性有變化,其最佳的發(fā)光條件也不同。因此,利用不同種類的海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光特性,可以監(jiān)測(cè)海洋環(huán)境中的某些污染物。在應(yīng)用細(xì)菌發(fā)光特性探測(cè)污染物的有關(guān)研究中,利用發(fā)光細(xì)菌制備識(shí)別元件,成為海洋環(huán)境中污染物探測(cè)傳感器研究和發(fā)展的熱點(diǎn)。20世紀(jì)80年代初,美國(guó)Beck-man公司推出功能完備的170發(fā)光學(xué)報(bào)第28卷生物毒性測(cè)試儀,它具有應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、相關(guān)性好、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn),受到廣泛重視。發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試技術(shù)在世界范圍內(nèi)迅速推廣。黃正等細(xì)菌發(fā)光傳感器在快速檢測(cè)污染物急性毒性中的應(yīng)

19、用18一文中以明亮發(fā)光桿菌作為指示生物,將細(xì)胞固定化技術(shù)、生物傳感器與發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來(lái),建立了細(xì)菌發(fā)光傳感器。在細(xì)菌發(fā)光傳感器研制中,篩選優(yōu)良的菌種是關(guān)鍵技術(shù)之一。4.2在發(fā)光細(xì)菌分類、發(fā)光免疫和抗菌素濃度測(cè)定上的應(yīng)用以往的發(fā)光細(xì)菌分類研究結(jié)果表明,海洋發(fā)光細(xì)菌主要分為3個(gè)屬,分別是:發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、弧菌屬(Vibrio)和異短桿菌屬(Xenorhabdus)。發(fā)光細(xì)菌的分類鑒定按常規(guī)方法進(jìn)行比較繁瑣,往往需要做大量的生理、生化特征實(shí)驗(yàn),而這些實(shí)驗(yàn)既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。在發(fā)光細(xì)菌分類中,還可利用發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光光譜作為分類的重要特征,用熒光分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)光細(xì)

20、菌的發(fā)光光譜就簡(jiǎn)便多了。如前面提到的,朱文杰等對(duì)海洋發(fā)光細(xì)菌的生物光譜研究表明,由于發(fā)光細(xì)菌有種屬特異性,因而發(fā)光光譜可作為發(fā)光細(xì)菌分類的重要特征。又如汪杰等對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光的一、二階微分光譜的檢測(cè)結(jié)果表明,不同種的發(fā)光細(xì)菌的微分光譜有顯著差異,同一種菌的不同菌株則無(wú)顯著差異,表明生物發(fā)光光譜,微分光譜可作為發(fā)光細(xì)菌菌種分類的特征。也就是說(shuō),依賴生物發(fā)光光譜及其微分光譜,不僅在發(fā)光細(xì)菌屬的認(rèn)定上有幫助,還可以區(qū)分不同的菌種。不同菌種有其自身的光譜特征參數(shù),因而研究其光譜特征,可以在發(fā)光細(xì)菌分類中找到簡(jiǎn)便有效的方法。在生物發(fā)光分析技術(shù)應(yīng)用研究方面,由于發(fā)光測(cè)量具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、反應(yīng)

21、速度快、使用方便等優(yōu)點(diǎn),在免疫學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、臨床檢驗(yàn)、病毒學(xué)等得到了廣泛應(yīng)用。如Edward Jablonski19細(xì)菌熒光素酶類制品結(jié)合免疫測(cè)定法應(yīng)用于風(fēng)疹抗體檢測(cè)。利用生物發(fā)光反應(yīng)的輔助因子標(biāo)記抗原或抗體,免疫后,運(yùn)用生物發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。免疫檢測(cè)中進(jìn)行標(biāo)記物的超靈敏檢測(cè)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。生物發(fā)光反應(yīng)也已經(jīng)被證明是檢測(cè)酶標(biāo)記的極為靈敏的方法,作為一種新的生物技術(shù)工具,生物免疫檢測(cè)具有一個(gè)光明的前景,已有多種雙功能生物發(fā)光分子被準(zhǔn)備應(yīng)用到免疫檢測(cè)中。同時(shí),還可以發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度為指標(biāo)去定量抗菌素的效價(jià)。如朱文杰等20“海洋發(fā)光細(xì)菌快速測(cè)定四環(huán)素效價(jià)的方法研究”中表明,目前用微生物

22、測(cè)定抗菌素效價(jià)很費(fèi)時(shí),操作也較繁瑣,四環(huán)素效價(jià)的測(cè)定亦然。試驗(yàn)證明了,四環(huán)素對(duì)明亮發(fā)光桿菌A2發(fā)光的影響是在低濃度時(shí)刺激發(fā)光,較高濃度時(shí)則抑制發(fā)光,在短時(shí)間內(nèi),所用的四環(huán)素濃度跟抑制發(fā)光的效應(yīng)呈現(xiàn)依存關(guān)系。據(jù)此,利用發(fā)光細(xì)菌可以快速測(cè)定四環(huán)素的效價(jià)。還有生物發(fā)光技術(shù)在ATP水平測(cè)定中的應(yīng)用,所有活細(xì)胞都含有ATP,ATP可以從細(xì)胞中提取出來(lái),用熒光素酶檢測(cè),并進(jìn)行生物數(shù)量評(píng)估,如微生物學(xué)家通過(guò)檢測(cè)ATP的量測(cè)定土壤或沉積物中的全部活微生物含量。4.3在水下通訊探測(cè)和水色遙感上的應(yīng)用艦船在發(fā)光水域航行,會(huì)留下曳光,使海面戰(zhàn)艦夜間暴露航蹤。在海洋中潛艇的行駛使其身后的海水形成渦流,激使發(fā)光細(xì)菌的生

23、物發(fā)光勾畫出潛艇渦動(dòng)的光尾流,潛艇光尾流是發(fā)光細(xì)菌對(duì)渦流應(yīng)力攪動(dòng)的一種應(yīng)激反應(yīng)。利用潛艇光尾流現(xiàn)象可對(duì)潛艇進(jìn)行跟蹤探測(cè)。王江安等9在“潛艇光尾流產(chǎn)生機(jī)理及其探測(cè)技術(shù)研究”一文中就論述了這一應(yīng)用前景。水下潛艇之間用光波進(jìn)行通訊或者水下潛艇與水面艦艇間的光通訊、水下光探測(cè)、照相等都可能對(duì)海洋發(fā)光細(xì)菌對(duì)光的吸收及細(xì)菌發(fā)光產(chǎn)生影響。尤其,水下通訊與探測(cè)多用藍(lán)綠光,這種波段最易透過(guò)水層,但它也正好與發(fā)光細(xì)菌發(fā)出的光譜吻合,最可能成為水下光通訊與探測(cè)的干擾源。藍(lán)綠光也是海洋水色遙感的重要工作波段,當(dāng)海面存在大量發(fā)光細(xì)菌時(shí),其產(chǎn)生的“彌漫型”發(fā)光也可能對(duì)海洋水色遙感信息產(chǎn)生影響,如何消除或減小這類干擾是相關(guān)

24、應(yīng)用技術(shù)研究中需解決的問(wèn)題。5結(jié)論海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光特性研究的應(yīng)用前景,近期主要集中在水下探測(cè)、環(huán)境污染監(jiān)測(cè)、發(fā)光細(xì)菌分類及抗菌素濃度測(cè)定等方面;應(yīng)用研究的深度也有進(jìn)展,已由一般的應(yīng)用可能性研究,進(jìn)入生物傳感器研制階段。而發(fā)光特性的應(yīng)用研究離不開(kāi)對(duì)細(xì)菌發(fā)光特性的深入了解,海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光特性的研究涉及微生物學(xué)、生物化學(xué)、海洋光學(xué)等第2期張進(jìn)興,等:海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光及其應(yīng)用171學(xué)科,研究?jī)?nèi)容較為廣泛且相互交叉、相互滲透。因此,不僅需要在微生物學(xué)和生物化學(xué)方面進(jìn)行研究,從海洋水體光學(xué)性質(zhì)上,進(jìn)行系統(tǒng)、深入的研究也是十分必要的。對(duì)發(fā)光特性的深入研究,有可能發(fā)現(xiàn)新的應(yīng)用前景,擴(kuò)展應(yīng)用領(lǐng)域,為應(yīng)用技術(shù)

25、研究打下更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn): 1 KudryashevaN S, Nemtseva E V, Sizykh A G,et al.Estimation of energy of the upper electron-excited states of thebacterial bioluminescent emitter J.J. Photochemistry andPhotobiologyB:Biology, 2002,68(2-3): 88-92. 2 EdwardAMeighen. Autoinduction of lightemission in differentspecies o

26、fbioluminescentbacteria J.Lumin., 1999,14(1): 3-9. 3 ZhuWenjie, He Xuemin, Yang Yikang. Bioluminescent emission spectra ofmarine luminous bacteria J.Chin. J.Lumin.(發(fā)光學(xué)報(bào)), 1986,7(1): 127-132 ( in Chinese). 4 Du Zongjun, WangXianghong, LiHaifeng,et al.The study and application luminescentbacteria J.Hi

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30、ip between spectral distribution of vibrio fischer strain Y1 bioluminescenceand intracellular level of its fluorescent proteins A.Bioluminescence and Chemiluminescence Progress and CurrentApplicationsC. 2002 byWorld Scientific Publishing, 81-84.10 Miyamoto C, Lin Ly, Huang S-Y,et al.Effect SAM-relat

31、ed structural and regulatory proteins on luminescence in vibrioharveyi A.Bioluminescence and Chemiluminescence Progress and CurrentApplicationsC. 2002 byWorld ScientificPublishing, 93-96.11 Wang Jiangan, Zong Siguang·The study engendermechanism of submarine ray track and detect ability J·L

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36、inescent biosensor in rapid determination of acute toxicity ofpollutants J.EnvironmentalScience(環(huán)境科學(xué)), 1997,18(1): 14-16 ( in Chinese).172發(fā)光學(xué)報(bào)第28卷19 Edward Jablonski·The preparation of bacterial luciferase conjugates for immunoassay and application to rubella antibodydetection J.AnalyticalBioch

37、emistry, 1985,148(1): 199-206·20 ZhuWenjie, YangYikang·A quick assay for tetracycline J.Marine Sciences(海洋科學(xué)), 1985,9(1): 48-51( inChinese).Application ofLum inescence of theM arine Lum inous BacteriaZHANG Jin-xing, PANG Ai-me,i SUN Xiu-qin, SUN Pei-guang(First Institute ofOceanography, St

38、ateOceanicAdministration People sRepublic ofChina, Qingdao266061, China)Abstract:Marine luminous bacteria, heterotrophic bacteria give outvisible light in normalphysiological con-dition. Many study results show that the luminescencemechanisms ofvariety luminous bacteria are the same.The light-emitti

39、ng in bacteria involves the oxidation of reduced riboflavin phosphate (FMNH2) and a long-chain fatty aldehyde with the emission of blue-green ligh.t The enzymes that catalyze the bioluminescencereaction in these organisms are called luciferases, and inmostcases the substrates are designated as lucif

40、erins.However, consistentwith the apparent absence of strong evolutionary relationship between many of the light-emitting systems, significantdifferences existbetween the bioluminescence reactions aswell as the structuresof the luciferases (enzymes) and luciferins (substrates) from different organis

41、ms. The luminescent characte-ristics ofmarine luminous bacteria connectwith material structure in the bacteria, marine environment ele-ments and pollutants in the seawateretc, the connectstudy includes thatspectrum property, light-emitting in-tensity, light-emitting characteristic parameter, light-e

42、mitting conditions and the structure of luciferases fromdifferent luminous bacteria. Thorough understanding these properties ofmarine luminous bacteria and carryingout the study ofapplication can supply effectivemethods for the application of the property ofmarine luminousbacteria, and promote compr

43、ehensive researches on ocean biology, ocean optics and biochemistry, and showthe feasibility ofphysics researches onmarine luminous bacteria. And the predictions show the concentrationand toxicity ofpollutants in thewater is determined by luminescent intensity of luminous bacteria, the subma-rine sa

44、iling exits the whirlpool and the luminescent bacteria bioluminescentmakes the whirlpool to be a raytrackwhich can be used to detect submarine, the luminescent characteristics can also be used to improve inthe underwater lightcommunications and exploring, oceanwater color remote sensing, bacterial c

45、lassificationbioluminescent immunity and antibiotic concentration determinationetc.In this article, important significanceof the study on luminescent characteristic ofmarine luminous bacteriawas clarified and reference is given forfurther developing.Key words:marine luminous bacteria; luminescent ch

46、aracteristic; application studyReceived date: 2006-08-25第28卷第2期2007年4月發(fā)光學(xué)報(bào)CHINESE JOURNALOF LUMINESCENCEVol·28 No·2Apr., 2007文章編號(hào): 1000-7032(2007)02-0167-06海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光及其應(yīng)用張進(jìn)興,逄愛(ài)梅,孫修勤,孫培光(國(guó)家海洋局第一海洋研究所,山東青島266061)摘要:海洋發(fā)光細(xì)菌是一類在正常的生理?xiàng)l件下能夠發(fā)射可見(jiàn)光的異養(yǎng)細(xì)菌,其發(fā)光特性與細(xì)菌體內(nèi)的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、海洋環(huán)境要素、水中污染物等多種因素有關(guān)。通過(guò)對(duì)海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光

47、特性及其應(yīng)用可能性的論述,如利用發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度與水中毒物的濃度、毒性的關(guān)系檢測(cè)污染物;利用潛艇航行時(shí)激發(fā)的生物發(fā)光勾畫出潛艇渦動(dòng)的光尾流可跟蹤探測(cè)潛艇;海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光特性還可用以改進(jìn)水下光通訊與探測(cè)、海洋水色遙感、海洋發(fā)光細(xì)菌分類、發(fā)光免疫和抗菌素濃度測(cè)定等方面。闡明海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光特性的重要研究意義并為進(jìn)一步開(kāi)展應(yīng)用研究提供借鑒。關(guān)鍵詞:海洋發(fā)光細(xì)菌;發(fā)光特性;應(yīng)用研究中圖分類號(hào):O482. 31PACC:3250F; 7860P文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A收稿日期:2006-08-25;修訂日期:2006-11-24基金項(xiàng)目:國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目(海洋微生物菌種種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)化整理整合與共享)

48、(2004DKA30640);國(guó)家908項(xiàng)目(我國(guó)近海海洋綜合調(diào)查與評(píng)價(jià))基金資助項(xiàng)目作者簡(jiǎn)介:張進(jìn)興(1954-),男,山東濰坊人,研究員,主要從事應(yīng)用微生物學(xué)的研究。E-mai:l zhangjx fio. org. cn, Te:l (0532)889674491引言海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光現(xiàn)象一直是人們十分關(guān)注的問(wèn)題,各國(guó)科學(xué)家對(duì)此進(jìn)行了多方面的調(diào)查研究。國(guó)內(nèi)對(duì)海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光的觀測(cè)研究已有多年歷史。在國(guó)標(biāo)海洋調(diào)查規(guī)范中,早已把“海發(fā)光”列為海洋調(diào)查內(nèi)容,其中“彌漫型”海發(fā)光便是由海洋發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生的,作為常規(guī)海洋觀測(cè)項(xiàng)目之一,已積累了許多現(xiàn)場(chǎng)觀測(cè)資料。近年來(lái),由于實(shí)際應(yīng)用的需要,對(duì)海洋發(fā)光細(xì)

49、菌的觀測(cè)研究有所加強(qiáng),如現(xiàn)正進(jìn)行的西北太平洋環(huán)境調(diào)查研究項(xiàng)目中,就包含了海洋發(fā)光細(xì)菌的分布調(diào)查。有關(guān)海洋發(fā)光細(xì)菌的研究?jī)?nèi)容相當(dāng)廣泛,從近期國(guó)內(nèi)外發(fā)表的文獻(xiàn)資料看,主要有海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)理,發(fā)光基因、熒光素酶、發(fā)光特性以及某些應(yīng)用方法等研究。在發(fā)光特性研究方面,以往更多地側(cè)重于細(xì)菌發(fā)光與其體內(nèi)物質(zhì)、結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究,即側(cè)重于微生物學(xué)和生物化學(xué)方面的研究,而在環(huán)境要素和細(xì)菌種類、密度等對(duì)細(xì)菌光譜的影響方面的研究相對(duì)較少。在海洋發(fā)光細(xì)菌的研究中,發(fā)光特性及其應(yīng)用研究是一項(xiàng)重要內(nèi)容。利用細(xì)菌的發(fā)光特性,開(kāi)展應(yīng)用研究,尤其結(jié)合光學(xué)原理,制作某些傳感器,用于海洋環(huán)境污染監(jiān)測(cè),已引起國(guó)內(nèi)外廣泛重視。為了研

50、究海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光特性的應(yīng)用前景,首先必須深入了解海洋發(fā)光細(xì)菌的性質(zhì),積累發(fā)光細(xì)菌發(fā)光特性的基礎(chǔ)資料和研究經(jīng)驗(yàn)。然后,依據(jù)細(xì)菌發(fā)光的不同特性和應(yīng)用可能性,開(kāi)展相應(yīng)的應(yīng)用研究。此類研究不僅可為細(xì)菌發(fā)光特性的應(yīng)用提供有效方法,并將促進(jìn)海洋生物學(xué)、海洋光學(xué)、生物化學(xué)之間交叉學(xué)科綜合研究的發(fā)展,為從物理學(xué)角度研究海洋發(fā)光細(xì)菌提供依據(jù)。為此,本文擬在簡(jiǎn)要綜述海洋發(fā)光細(xì)菌的分布特點(diǎn)與發(fā)光機(jī)理研究基礎(chǔ)上,論述發(fā)光特性及其在海洋環(huán)境污染物監(jiān)測(cè)、發(fā)光細(xì)菌分類、水下通訊探測(cè)和水色遙感上的應(yīng)用研究現(xiàn)狀,為進(jìn)一步開(kāi)展海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光特性的應(yīng)用研究提供借鑒。2分布特點(diǎn)與發(fā)光機(jī)理海洋發(fā)光細(xì)菌是一類從海水中或者從海洋動(dòng)物體

51、表、消化道和發(fā)光器官上以及海底沉積物中可以分離到的,在適宜條件下能夠發(fā)射可見(jiàn)光的異養(yǎng)細(xì)菌。海洋中的發(fā)光細(xì)菌,除了在海水中自由浮游生存的外,還有寄生于其他海洋生物體的。許多海洋生物的發(fā)光與發(fā)光細(xì)菌有關(guān),如某些魚類、軟體動(dòng)物等的發(fā)光是由海洋發(fā)光細(xì)菌寄生、共168發(fā)光學(xué)報(bào)第28卷?xiàng)嫠?。海洋發(fā)光細(xì)菌的種類不是很多,但其分布卻非常廣,從海表層至深海;從熱帶海洋至非常寒冷的極地海域都有其蹤跡。為了更好地掌握海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光特性及應(yīng)用可能性,除需要了解發(fā)光細(xì)菌的分布特點(diǎn)外,也有必要對(duì)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)理作簡(jiǎn)要介紹。發(fā)光機(jī)理的研究結(jié)果表明,不同種類的發(fā)光細(xì)菌其發(fā)光機(jī)理是基本一致的,都必須有細(xì)菌熒光素酶(

52、LE)、還原性的黃素單核苷酸(FMN·H2)、氧氣(O2)、長(zhǎng)鏈脂肪醛(RCHO)的參與,大致歷程如下:FMNH2+LEFMNH2·LE +O2LE·FMNH2·O2+RCHOLE·FMNH2·O2·RCHOLE·FMN+H2O+RCOOH+光概括地說(shuō),細(xì)菌生物發(fā)光反應(yīng)是由分子氧作用,胞內(nèi)熒光酶催化,將還原態(tài)的黃素單核苷酸及長(zhǎng)鏈脂肪醛氧化為黃素單核苷酸(FMN)及長(zhǎng)鏈脂肪酸,同時(shí)釋放出藍(lán)綠光。發(fā)光細(xì)菌發(fā)出的光是連續(xù)的,屬“冷光”。這是一種化學(xué)發(fā)光類型,在化學(xué)能轉(zhuǎn)換為輻射能的過(guò)程中發(fā)光。熒光素酶是菌體內(nèi)催化熒光素或脂

53、肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱,細(xì)菌熒光素酶是含、兩個(gè)多肽亞基的單加氧酶,只有兩個(gè)亞基共存時(shí)才有活性。從不同海洋發(fā)光細(xì)菌中提取的細(xì)菌熒光素酶其分子量差別較小。由于海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)光細(xì)胞內(nèi)含有熒光素和熒光素酶,有了氧氣,細(xì)胞內(nèi)的熒光素就受到熒光素酶的催化作用而吸收能量,變成氧化熒光素并釋放光子而發(fā)光。不同種類的海洋發(fā)光細(xì)菌可產(chǎn)生不同的熒光素酶,發(fā)光特性也不同。3發(fā)光特性研究海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光特性研究,包括不同菌種所具有的特異光譜特性研究,發(fā)光強(qiáng)度、發(fā)光特征參數(shù)和發(fā)光條件對(duì)細(xì)菌發(fā)光的影響等項(xiàng)研究,以及不同種類的發(fā)光組分和酶結(jié)構(gòu)的差異研究。各種生物發(fā)光的本質(zhì)大體一樣,都是由一組化合物熒光酶和高能化合物腺苷

54、三磷酸等構(gòu)成發(fā)光光源。它們發(fā)出的藍(lán)、青、綠、黃、橙等不同顏色的光,是因?yàn)楦髯缘臒晒馑?、熒光酶在結(jié)構(gòu)上的微小差異引起的。發(fā)光細(xì)菌的光譜范圍約420670 nm,max在475485 nm左右,為單一發(fā)射峰,max和半峰全寬有種屬差異。從發(fā)光特征參數(shù)發(fā)光量子產(chǎn)率來(lái)看,其生物發(fā)光反應(yīng)特點(diǎn)是高光子產(chǎn)生效率: 0. 50. 8。通過(guò)發(fā)射光的比率可以推出未知成分的濃度,因此測(cè)定化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中的發(fā)射光是非常有用的。反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的光與發(fā)射光的量子產(chǎn)率是直接相關(guān)的,與相應(yīng)的發(fā)光物質(zhì)的濃度成比例。因此,反應(yīng)過(guò)程中的光可以相對(duì)反映出目標(biāo)樣品中發(fā)光物質(zhì)的量。有關(guān)生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移是指在一個(gè)發(fā)光或熒光供體和一個(gè)熒光

55、受體(如綠色熒光蛋白的突變體GFP)之間會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。利用這種方法可以非侵入性地監(jiān)測(cè)特異蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用。如Kudryasheva等1研究了細(xì)菌生物發(fā)光電子激發(fā)態(tài)上限能量估算,用染色分子作為能量接收者,證實(shí)了細(xì)菌生物發(fā)光電子激發(fā)態(tài)上限活動(dòng)的假設(shè)。并給出了MSB(Methylstyryl benzene)中的偶聯(lián)酶系統(tǒng)NADHFMN-氧化還原酶-熒光素酶的細(xì)菌發(fā)光光譜。從已有的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果看,大多數(shù)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光,僅發(fā)生于高細(xì)胞密度,細(xì)菌發(fā)光依賴于培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)蛋白的濃度和積累。細(xì)菌種類和生長(zhǎng)條件,包括溫度、鹽度和營(yíng)養(yǎng)成分以及其他實(shí)驗(yàn)條件對(duì)其發(fā)光也有影響2。在正常的生理?xiàng)l件下,發(fā)光細(xì)菌能發(fā)出波長(zhǎng)為450490 nm的藍(lán)綠光;在一定的試驗(yàn)條件下,發(fā)光強(qiáng)度是恒定的3。但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),發(fā)光桿菌屬經(jīng)某種處理后其發(fā)光光譜產(chǎn)生位移,如HajimeKaratani等4在由發(fā)光桿菌發(fā)光現(xiàn)象產(chǎn)生的兩種熒光蛋白質(zhì)的特性研究中,發(fā)現(xiàn)從深海發(fā)光細(xì)菌中分離的熒光蛋白質(zhì)中,發(fā)光桿菌屬經(jīng)提純、克隆和排序出兩種熒光蛋白質(zhì),最大發(fā)射的熒光波長(zhǎng)在488, 517 nm。在尿素