第九章 基因組與比較基因組學

1、第九章第九章 基因組與比較基因組學基因組與比較基因組學 9.1 人工染色體構(gòu)建人工染色體構(gòu)建 9.2 新的測序策略新的測序策略-全基因組鳥槍法測序全基因組鳥槍法測序 9.3 全基因組序列分析全基因組序列分析-基因組學的新內(nèi)容基因組學的新內(nèi)容 9.4 比較基因組學比較基因組學(Comparative genomics) 9.1 人工染色體構(gòu)建人工染色體構(gòu)建 1983年，美國的年，美國的Dana-Farber癌癥研究所和哈佛大癌癥研究所和哈佛大學醫(yī)學院的教授首次在學醫(yī)學院的教授首次在Nature上發(fā)表文章，報道了構(gòu)建上發(fā)表文章，報道了構(gòu)建YAC（Yeast Artificial Chromosom

2、e）庫的過程。）庫的過程。1987年，年，Burke等人發(fā)現(xiàn)，僅僅帶有等人發(fā)現(xiàn)，僅僅帶有ARS序列序列(autonomous replicating sequence) 的載體雖然能夠被復制，但極易在的載體雖然能夠被復制，但極易在有絲分裂時丟失。即使在選擇培養(yǎng)基上，也只有有絲分裂時丟失。即使在選擇培養(yǎng)基上，也只有5%-20%的子代細胞帶有的子代細胞帶有ARS載體。加入載體。加入Centromeres （CEN）能顯著提高）能顯著提高ARS質(zhì)粒在有絲分裂時的穩(wěn)定性，質(zhì)粒在有絲分裂時的穩(wěn)定性，90%以上子代細胞帶有該載體。以上子代細胞帶有該載體。CEN還能顯著降低拷貝還能顯著降低拷貝數(shù)，從數(shù)，從2

3、0-50/細胞降為細胞降為1-2/細胞。（細胞。（Science, 236:806-812）。）。 人工染色體含有三種必需成分：著絲粒、端粒和復人工染色體含有三種必需成分：著絲粒、端粒和復制起點。制起點。 著絲粒著絲粒(CEN)位于染色體中央，呈紐扣狀結(jié)構(gòu)，在位于染色體中央，呈紐扣狀結(jié)構(gòu)，在有絲分裂時結(jié)合微管并調(diào)控染色體的運動，也是姐妹有絲分裂時結(jié)合微管并調(diào)控染色體的運動，也是姐妹染色單體配對時的最后位點，接收細胞信號而使姐妹染色單體配對時的最后位點，接收細胞信號而使姐妹染色體分開。染色體分開。 端粒端粒（TEL）：主要功能是防止染色體融合、降解、）：主要功能是防止染色體融合、降解、確保其完整

4、復制。端粒酶以其自身確保其完整復制。端粒酶以其自身RNA為模板，在染為模板，在染色體端部添加上端粒重復序列，并參與端粒長度和細色體端部添加上端粒重復序列，并參與端粒長度和細胞增殖的調(diào)控。胞增殖的調(diào)控。 復制起點復制起點： DNA復制通常由起始蛋白與特定的復制通常由起始蛋白與特定的DNA序列相互作用開始。序列相互作用開始。DNA合成的起始位點和合成的起始位點和DNA復制復制起點起點(遺傳位點遺傳位點)所需的所需的Cis靶區(qū)常位于同一段長約靶區(qū)常位于同一段長約100bp的的DNA上。上。 YAC的主要缺點的主要缺點 1存在高比例的嵌合體，即一個存在高比例的嵌合體，即一個YAC克隆含有兩個本克隆含有

5、兩個本來不相連的獨立片段；來不相連的獨立片段；2部分克隆子不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)中可能會發(fā)生缺失部分克隆子不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)中可能會發(fā)生缺失或重排；或重排；3難與酵母染色體區(qū)分開，因為難與酵母染色體區(qū)分開，因為YAC與酵母染色體具與酵母染色體具有相似的結(jié)構(gòu)。有相似的結(jié)構(gòu)。4操作時容易發(fā)生染色體機械切割。操作時容易發(fā)生染色體機械切割。 以細菌寄主系統(tǒng)為基礎(chǔ)的克隆載體形成嵌合體的頻以細菌寄主系統(tǒng)為基礎(chǔ)的克隆載體形成嵌合體的頻率較低，轉(zhuǎn)化效率高，又易于分離。科學家用率較低，轉(zhuǎn)化效率高，又易于分離?？茖W家用染色體染色體建造建造法用法用F質(zhì)粒及其調(diào)控基因構(gòu)建細菌載體，克隆大質(zhì)粒及其調(diào)控基因構(gòu)建細菌載體，克隆

6、大片段片段DNA。該質(zhì)粒主要包括。該質(zhì)粒主要包括oriS， repE（控制（控制F質(zhì)粒質(zhì)粒復制）和復制）和parA、 parB（控制拷貝數(shù)）等成分。（控制拷貝數(shù)）等成分。 BAC的優(yōu)點的優(yōu)點 1 易于用電擊法轉(zhuǎn)化易于用電擊法轉(zhuǎn)化E.coli（轉(zhuǎn)化效率比轉(zhuǎn)化酵母高（轉(zhuǎn)化效率比轉(zhuǎn)化酵母高10-100倍）；倍）； 2 超螺旋環(huán)狀載體，易于操作；超螺旋環(huán)狀載體，易于操作； 3 F質(zhì)粒本身所帶的基因控制了質(zhì)粒的復制；質(zhì)粒本身所帶的基因控制了質(zhì)粒的復制； 4 很少發(fā)生體內(nèi)重排。很少發(fā)生體內(nèi)重排。 有人把人類染色體端粒有人把人類染色體端粒DNA上單個上單個-衛(wèi)星衛(wèi)星DNA單單元多聚化形成元多聚化形成1Mb左

7、右的大片段并與人類基因組左右的大片段并與人類基因組DNA混合，產(chǎn)生了能被復制、能正常分裂并得到長期穩(wěn)定混合，產(chǎn)生了能被復制、能正常分裂并得到長期穩(wěn)定保存的人工合成的染色體，長度約為保存的人工合成的染色體，長度約為6-10Mb，稱為，稱為MAC或或HAC。 9.2 新的測序策略新的測序策略-全基因組鳥槍法測序全基因組鳥槍法測序 對某基因組文庫全部克隆片段進行末端序列測定對某基因組文庫全部克隆片段進行末端序列測定中未測到的堿基數(shù)，即缺口中未測到的堿基數(shù)，即缺口(gap)，與已測定的總堿基，與已測定的總堿基數(shù)相關(guān)。隨著已測定堿基數(shù)的增加，缺口的總堿基數(shù)數(shù)相關(guān)。隨著已測定堿基數(shù)的增加，缺口的總堿基數(shù)目

8、會按照泊松公式的一個推論（目會按照泊松公式的一個推論（P=e-m）迅速減小。其）迅速減小。其中中P為基因組中某個堿基未被測定的概率，為基因組中某個堿基未被測定的概率，m為所測定為所測定的堿基數(shù)與基因組大小相比的倍數(shù)。的堿基數(shù)與基因組大小相比的倍數(shù)。m越大越大P值越小。值越小。當當m值達到值達到5（即隨機測定的堿基數(shù)達到基因組（即隨機測定的堿基數(shù)達到基因組5倍倍時），基因組中未測定的堿基數(shù)為基因組總堿基數(shù)的時），基因組中未測定的堿基數(shù)為基因組總堿基數(shù)的0.67%(e-5=0.0067)。對流感嗜血桿菌這樣大的基因組。對流感嗜血桿菌這樣大的基因組(1.83Mb)，可能留有，可能留有128個平均長度

9、為個平均長度為100bp的缺口。的缺口。 全基因組鳥槍法測序的主要步驟全基因組鳥槍法測序的主要步驟 v 第一，建立高度隨機、插入片段大小為第一，建立高度隨機、插入片段大小為2kb左右的基因左右的基因組文庫。組文庫?？寺?shù)要達到一定數(shù)量，即經(jīng)末端測序的克克隆數(shù)要達到一定數(shù)量，即經(jīng)末端測序的克隆片段的堿基總數(shù)應(yīng)達到基因組隆片段的堿基總數(shù)應(yīng)達到基因組5倍以上。倍以上。v 第二，高效、大規(guī)模的末端測序。第二，高效、大規(guī)模的末端測序。對文庫中每一個克對文庫中每一個克隆，進行兩端測序，隆，進行兩端測序，TIGR在完成流感嗜血桿菌的基因在完成流感嗜血桿菌的基因組時，使用了組時，使用了14臺測序儀，用三個月時

10、間完成了必需臺測序儀，用三個月時間完成了必需的的28,463個測序反應(yīng)，測序總長度達個測序反應(yīng)，測序總長度達6倍基因組。倍基因組。v 第三，序列集合。第三，序列集合。TIGR發(fā)展了新的軟件，修改了序列發(fā)展了新的軟件，修改了序列集合規(guī)則以最大限度地排除錯誤的連鎖匹配。集合規(guī)則以最大限度地排除錯誤的連鎖匹配。v 第四，填補缺口。第四，填補缺口。有兩種待填補的缺口，一是沒有相有兩種待填補的缺口，一是沒有相應(yīng)模板應(yīng)模板DNA的物理缺口，二是有模板的物理缺口，二是有模板DNA但未測序的但未測序的序列缺口。他們建立了插入片段為序列缺口。他們建立了插入片段為15-20kb的的文庫以文庫以備缺口填補。備缺口填

11、補。 鳥槍法測序的缺點鳥槍法測序的缺點 對鳥槍法的改進對鳥槍法的改進 (1) Clone contig法。首先用稀有內(nèi)切酶把待測基因組降法。首先用稀有內(nèi)切酶把待測基因組降解為數(shù)百解為數(shù)百kb以上的片段，再分別測序。以上的片段，再分別測序。 (2) 靶標鳥槍法靶標鳥槍法(direted shotgun)。首先根據(jù)染色體上已。首先根據(jù)染色體上已知基因和標記的位置來確定部分知基因和標記的位置來確定部分DNA片段的相對位置，片段的相對位置，再逐步縮小各片段之間的缺口。再逐步縮小各片段之間的缺口。 一些常見的縮寫一些常見的縮寫 SSLPs, simple sequence length polymorp

12、hisms; STRs, simple tandem repeats; SNPs, single nucleotide polymorphisms. LINEs, long interspersed nuclear elements; SINEs, short interspersed nuclear elements; LTR, long terminal repeat. FISH, Fluorescent in situ Hybridization; STS, Sequence Tagged Site EST, End Sequence Tag. 9.3 全基因組序列分析全基因組序列分析-

13、基因組學的新內(nèi)容基因組學的新內(nèi)容 1數(shù)據(jù)存放。數(shù)據(jù)存放。2堿基百分含量分析。無論是堿基百分含量分析。無論是GC富含區(qū)還是富含區(qū)還是AT富含富含區(qū)，都可能是一些特殊功能的區(qū)域。區(qū)，都可能是一些特殊功能的區(qū)域。肺炎支原體肺炎支原體GC百分含量高和百分含量高和GC百分含量低的區(qū)域?qū)Π俜趾康偷膮^(qū)域?qū)?yīng)于重組值較低的區(qū)域，包括著絲粒和端粒，而尿殖應(yīng)于重組值較低的區(qū)域，包括著絲粒和端粒，而尿殖道支原體道支原體GC百分含量最低的區(qū)域?qū)?yīng)于百分含量最低的區(qū)域?qū)?yīng)于rRNA和和tRNA。流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌GC百分含量高的區(qū)域也對應(yīng)于百分含量高的區(qū)域也對應(yīng)于6個個rRNA基因?；?。 3.ORF分析。首先

14、要用多個不同的軟件來要找到并估分析。首先要用多個不同的軟件來要找到并估測基因組中的每一個測基因組中的每一個ORF。 (1)通過流感嗜血桿菌能量代謝類群的通過流感嗜血桿菌能量代謝類群的ORF分析，了解分析，了解到在這種生物中缺乏三羧酸循環(huán)到在這種生物中缺乏三羧酸循環(huán)(TCA)中必需的三個中必需的三個酶，即檸檬酸合成酶基因、異檸檬酸脫氫酶基因和順酶，即檸檬酸合成酶基因、異檸檬酸脫氫酶基因和順烏頭酸酶基因。由此推斷流感嗜血桿菌烏頭酸酶基因。由此推斷流感嗜血桿菌TCA缺失，不缺失，不能合成谷氨酸，因為谷氨酸的供體是能合成谷氨酸，因為谷氨酸的供體是TCA的中間產(chǎn)生的中間產(chǎn)生物物-酮戊二酸。酮戊二酸。 (2)在尿殖道支原體基因組中有一個稱為在尿殖道支原體基因組中有一個稱為MgPa的的ORF。考察全基因組，共發(fā)現(xiàn)有考察全基因組，共發(fā)現(xiàn)有9個與個與MgPa同源的重復序列，同源的重復序列，這些重復序列之間發(fā)生重組可能誘導尿殖道支原體群這些重復