微生物的分離與純化技術(shù)()

1、實驗七實驗七 微生物的分離與純化技術(shù)微生物的分離與純化技術(shù) n土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。有價值的菌株。n一般土壤中，細菌最多，放線菌及霉菌次之，一般土壤中，細菌最多，放線菌及霉菌次之，而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中。而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中。 n從混雜微生物群體中獲得只含某一種或某

2、一株微從混雜微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的生物的過程稱為微生物的分離與純化分離與純化。n平板分離法平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。普遍用于微生物的分離與純化。n基本原理基本原理是選擇適合于待分離微生物生長的條件，是選擇適合于待分離微生物生長的條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧的要求，或加入如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧的要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其它微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微它微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。生物。一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：目的： 學習

3、從土壤中分離微生物的方法，學習從土壤中分離微生物的方法， 學習無菌操作技術(shù)。學習無菌操作技術(shù)。內(nèi)容：內(nèi)容： 1 1 培養(yǎng)基的配制及相關(guān)物品的滅菌；培養(yǎng)基的配制及相關(guān)物品的滅菌； 2 2 用稀釋法從土壤中分離微生物；用稀釋法從土壤中分離微生物； 用平板劃線方法分離微生物用平板劃線方法分離微生物 二、實驗材料和用具二、實驗材料和用具n牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、高氏牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、高氏1號固體培號固體培養(yǎng)基，土豆蔗糖固體培養(yǎng)基，養(yǎng)基，土豆蔗糖固體培養(yǎng)基，99mL無菌水無菌水(帶玻璃珠帶玻璃珠) ，9mL無菌水，無菌水，10%酚液，土酚液，土壤樣品壤樣品n無菌培養(yǎng)皿、無菌培養(yǎng)皿、1mL無菌移液管

4、、天平、稱無菌移液管、天平、稱量紙、藥勺、試管架量紙、藥勺、試管架n高壓滅菌鍋高壓滅菌鍋三、操作步驟三、操作步驟（一）（一） 固體培養(yǎng)基的配制固體培養(yǎng)基的配制（人一組）（人一組）l 稱量和溶解稱量和溶解 2pH調(diào)節(jié)、分裝（三角瓶）調(diào)節(jié)、分裝（三角瓶） 、包扎、包扎。3. 滅菌滅菌(二二) 土壤稀釋分離土壤稀釋分離（人一組）（人一組）1取土壤取土壤 取表層以下取表層以下510cm處的土樣，放入無菌的袋處的土樣，放入無菌的袋或瓶中備用，或放在或瓶中備用，或放在4冰箱中暫存。冰箱中暫存。2制備稀釋液制備稀釋液(要要無菌操作無菌操作) (1)準備準備三角瓶裝三角瓶裝99mL水（加玻璃珠），水（加玻璃珠

5、），1只；只； 試管裝試管裝4.5mL無菌水，；無菌水，； 包扎、滅菌包扎、滅菌 角匙一只角匙一只（2）制備土壤懸液：）制備土壤懸液： 無菌角匙無菌角匙稱土樣稱土樣1g，迅速倒入帶玻璃珠的，迅速倒入帶玻璃珠的99mL無無菌水瓶中菌水瓶中(玻璃珠用量玻璃珠用量10粒左右粒左右)，振蕩，振蕩510min，使土樣充分打散，即成為使土樣充分打散，即成為10-2的土壤懸液。的土壤懸液。u在每根無菌移液管的報紙?zhí)咨献龊脴擞?，如在每根無菌移液管的報紙?zhí)咨献龊脴擞洠?0-3 、10-4 、10-5。u無菌移液管用前從中間拆開報紙?zhí)?，取出移液管，無菌移液管用前從中間拆開報紙?zhí)祝〕鲆埔汗?，用后再插回報紙用后?/p>

6、插回報紙?zhí)?，保護移液管尖端套，保護移液管尖端。u每次每次吸取土液吸取土液，要將移液管插入液面，以口吹吸，要將移液管插入液面，以口吹吸3次，每次吸上的液次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。u放土液放土液操作時移液管尖不能接觸下一稀釋度液體的液面，每一個稀操作時移液管尖不能接觸下一稀釋度液體的液面，每一個稀釋度換用一支移液管。釋度換用一支移液管。(3)稀釋：稀釋： 用無菌移液管吸用無菌移液管吸10-2的土壤懸液的土壤懸液1mL，放入，放入9mL無菌水中即為無菌水中即為10-3稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-310-的

7、稀釋液。的稀釋液。3.平板接種培養(yǎng)平板接種培養(yǎng) 3.1稀釋傾注平板法稀釋傾注平板法 (混菌混菌)u細菌細菌: 取取10-6、10-7兩管稀釋液各兩管稀釋液各1mL，分別接入相應(yīng)標號的平皿，每個稀，分別接入相應(yīng)標號的平皿，每個稀釋度接兩個平皿。釋度接兩個平皿。取冷卻至取冷卻至50（以不燙手為宜）（以不燙手為宜）的的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分別倒入以上，分別倒入以上培養(yǎng)皿中培養(yǎng)皿中(裝量以鋪滿皿底為宜，約裝量以鋪滿皿底為宜，約10-15ml)，迅速搖動平皿，使菌液，迅速搖動平皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成細菌平板。與培養(yǎng)基充分混勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊

8、脂凝固即成細菌平板。 倒平板時要注意倒平板時要注意無菌操作。無菌操作。u放線菌放線菌 取取10-4、10-5兩管稀釋液各兩管稀釋液各1mL，分別接入相應(yīng)標號的平皿，每個稀釋度接，分別接入相應(yīng)標號的平皿，每個稀釋度接兩個平皿。兩個平皿。 取冷卻至取冷卻至50（以不燙手為宜）（以不燙手為宜）的的高氏高氏1號培養(yǎng)基號培養(yǎng)基（添加（添加10%酚數(shù)滴）酚數(shù)滴），分別倒入以上培養(yǎng)皿中分別倒入以上培養(yǎng)皿中(裝量以鋪滿皿底為宜，約裝量以鋪滿皿底為宜，約10-15mL)，迅速搖動，迅速搖動平皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成平皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成

9、放線菌平板。放線菌平板。u 霉菌霉菌取取10-4、10-5兩管稀釋液各兩管稀釋液各1ML，分別接入相應(yīng)標號的平皿，每個稀釋度接，分別接入相應(yīng)標號的平皿，每個稀釋度接兩個平皿兩個平皿 取冷卻至取冷卻至50（以不燙手為宜）（以不燙手為宜）的的土豆蔗糖培養(yǎng)基土豆蔗糖培養(yǎng)基，分別倒入以上培養(yǎng)，分別倒入以上培養(yǎng)皿中皿中(裝量以鋪滿皿底為宜，約裝量以鋪滿皿底為宜，約10-15mL)，迅速搖動平皿，使菌液與培，迅速搖動平皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成霉菌平板。養(yǎng)基充分混勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成霉菌平板。n倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰倒平板的方法：

10、右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用右手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口旁邊，用右手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近保持對著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約10mL，加蓋后輕輕搖動，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于平置于桌面上，待凝后即為平板。桌面上，待凝后即為平板。3.2 平板劃線分離法。平板劃線分離法。u倒平板倒平板 按無菌操作要求，在火焰旁操作，倒固體培養(yǎng)基平板。按無菌操作要求，在火焰旁操作，倒固

11、體培養(yǎng)基平板。u劃線分離劃線分離 使用接種環(huán)，使用接種環(huán)， 挑取挑取-土壤懸液，在平板中劃線分離。土壤懸液，在平板中劃線分離。 劃線的方法多樣，目的是劃線的方法多樣，目的是獲得單個菌落獲得單個菌落。n用接種環(huán)以無菌操作挑取用接種環(huán)以無菌操作挑取-土壤懸土壤懸液，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平液，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線行劃線34條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70度角，度角，并將并將接種環(huán)上剩余物燒掉接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線部分作再用同樣的方法通過第二次劃線部分作第三

12、次劃線。第三次劃線。 掌握好力度，不要劃破培養(yǎng)基。掌握好力度，不要劃破培養(yǎng)基。4培養(yǎng)培養(yǎng) 將接種好的平板將接種好的平板倒置倒置，即皿蓋朝下放置，即皿蓋朝下放置，(可減少可減少培養(yǎng)基水分蒸發(fā)、可減少污染培養(yǎng)基水分蒸發(fā)、可減少污染)，培養(yǎng)細菌：培養(yǎng)細菌：37，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12d。培養(yǎng)放線菌：培養(yǎng)放線菌：28，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35d。培養(yǎng)霉菌：培養(yǎng)霉菌：28，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35d。四、結(jié)果四、結(jié)果觀察從土壤稀釋分離的微生物觀察從土壤稀釋分離的微生物菌落菌落 注意事項注意事項1. 稱藥品稱藥品天平用完要及時關(guān)畢天平用完要及時關(guān)畢。2.土壤稀釋

13、分離土壤稀釋分離注意無菌操作注意無菌操作（酒精燈）（酒精燈）制備土壤懸液時注意溫度不能太高。制備土壤懸液時注意溫度不能太高。3. 倒平板倒平板u溫度溫度 （50度左右，不燙手為宜，溫度太低瓊脂凝固；溫度太高會燙死培養(yǎng)度左右，不燙手為宜，溫度太低瓊脂凝固；溫度太高會燙死培養(yǎng)物）物）u裝量裝量 (以鋪滿皿底為宜，約以鋪滿皿底為宜，約10-15mL)，太少鋪不滿，鋪不平整，而且如果，太少鋪不滿，鋪不平整，而且如果培養(yǎng)時間長，則容易干裂；太多浪費。培養(yǎng)時間長，則容易干裂；太多浪費。u 平板表面應(yīng)平整平板表面應(yīng)平整 u 混菌法倒平板與平板劃線法倒平板不同：混菌法倒平板與平板劃線法倒平板不同：混菌法倒平板

14、前先加混菌法倒平板前先加1ml土壤稀釋液，再倒入培養(yǎng)基；土壤稀釋液，再倒入培養(yǎng)基；平板劃線法倒平板是先倒入培養(yǎng)基制成平板，再挑菌劃線平板劃線法倒平板是先倒入培養(yǎng)基制成平板，再挑菌劃線4.劃線劃線時，掌握好力度，不要劃破培養(yǎng)基。時，掌握好力度，不要劃破培養(yǎng)基。5.剩余的培養(yǎng)基不能倒入水槽，以防填塞。剩余的培養(yǎng)基不能倒入水槽，以防填塞。6.各種器皿用完各種器皿用完及時清洗及時清洗。7.玻璃珠、皮筋、報紙玻璃珠、皮筋、報紙等用完回收等用完回收值日生值日生負責負責u高壓滅菌鍋滅菌時的看守工作。高壓滅菌鍋滅菌時的看守工作。在斜面試管上用記號筆標明待接種的在斜面試管上用記號筆標明待接種的菌種名稱、接種者和

15、日期（菌種名稱、接種者和日期（eg:酵酵母母/0316/060315）。 雙手用醫(yī)用酒精消毒。雙手用醫(yī)用酒精消毒。點燃酒精燈或煤氣燈。點燃酒精燈或煤氣燈。 將菌種試管和待接種的斜面試管，用大拇指和食指、中指、無名指握在將菌種試管和待接種的斜面試管，用大拇指和食指、中指、無名指握在左手中，試管底部放在手掌內(nèi)并將中指夾在兩試管之間，使左手中，試管底部放在手掌內(nèi)并將中指夾在兩試管之間，使斜面向斜面向上成水平狀態(tài)上成水平狀態(tài)，在火焰邊用右手松動試管塞以利于接種時拔出。，在火焰邊用右手松動試管塞以利于接種時拔出。細菌斜面接種技術(shù)細菌斜面接種技術(shù)n右手拿接種環(huán)通過火焰燒灼滅菌右手拿接種環(huán)通過火焰燒灼滅菌

16、，在火焰邊，在火焰邊用右手的手掌邊緣和小指，小指和無名指分別用右手的手掌邊緣和小指，小指和無名指分別夾持棉塞夾持棉塞 ( 或試管帽或試管帽 ) 將其取出，并迅速燒灼將其取出，并迅速燒灼管口。取試管棉塞或試管帽時要緩慢拔出，不管口。取試管棉塞或試管帽時要緩慢拔出，不宜用力過猛。宜用力過猛。 n將滅菌的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)，先將環(huán)接觸試管內(nèi)將滅菌的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)，先將環(huán)接觸試管內(nèi)壁或未長菌的培養(yǎng)基，使接種環(huán)的溫度下降達到冷卻壁或未長菌的培養(yǎng)基，使接種環(huán)的溫度下降達到冷卻的目的，然后再挑取少許菌苔。將接種環(huán)退出菌種試的目的，然后再挑取少許菌苔。將接種環(huán)退出菌種試管，迅速伸入待接種的斜面試管，用

17、環(huán)在斜面上管，迅速伸入待接種的斜面試管，用環(huán)在斜面上由下由下往上做往上做S形劃線形劃線。不要將培養(yǎng)基劃破，也不要使接種。不要將培養(yǎng)基劃破，也不要使接種環(huán)接觸壁或管口。環(huán)接觸壁或管口。n接種環(huán)退出斜面試管，再用火焰燒灼管口，并接種環(huán)退出斜面試管，再用火焰燒灼管口，并在火焰邊將試管塞上。在火焰邊將試管塞上。 將接種環(huán)逐漸接近火將接種環(huán)逐漸接近火焰再燒灼，如果接種環(huán)上沾的菌體較多時，應(yīng)焰再燒灼，如果接種環(huán)上沾的菌體較多時，應(yīng)先將環(huán)在火焰邊烤干，然后燒灼，以免未燒死先將環(huán)在火焰邊烤干，然后燒灼，以免未燒死的菌種飛濺出污染環(huán)境，接種病原菌時更要注的菌種飛濺出污染環(huán)境，接種病原菌時更要注意此點。意此點。超

18、凈工作臺 工作原理工作原理：鼓風機驅(qū)動空氣通過高效過濾器得以：鼓風機驅(qū)動空氣通過高效過濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺面空間而將其凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺面空間而將其中的塵埃、細菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)中的塵埃、細菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構(gòu)成無菌環(huán)境。構(gòu)成無菌環(huán)境。超凈臺的使用與保養(yǎng)超凈臺的使用與保養(yǎng)：使用前最好開啟超凈臺內(nèi)使用前最好開啟超凈臺內(nèi)紫外燈照射紫外燈照射1030分分鐘鐘，然后讓超凈臺預(yù)工作，然后讓超凈臺預(yù)工作1015分鐘，以除去分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)；臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)；使用完畢后，要用使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周酒

19、精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈，以保證超凈臺無菌。擦拭干凈，以保證超凈臺無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺n劃線分離法操作錄像n無菌操作接種操作錄像1、菌落（、菌落（colony） 單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生表面或內(nèi)部生長長、繁殖到一定程度可以形成、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的肉眼可見的、有、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞生長群體，稱為的子細胞生長群體，稱為菌落菌落。當固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時，便成當固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時，便成為為菌苔菌苔(1awn) 。n菌落的觀察菌落的觀察2、菌落特征、菌落特征 各種細菌在一定條件下形成的菌落具有一各種細菌在一定條件下形成的菌落具有一定的定