免疫沉淀技術(shù)

1、免疫沉淀技術(shù)技術(shù)簡(jiǎn)介：蛋白質(zhì)作為生命形態(tài)中最重要的分子，一直以來(lái)都是全球科學(xué)家們研究的焦點(diǎn)。免疫沉淀技術(shù)是以抗體與抗原間的專一性為基礎(chǔ)用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，也是確定兩種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)相互性生理作用的有效方法。表現(xiàn)為可溶性抗原與相應(yīng)抗體在液相或凝膠中特異性結(jié)合后，形成的免疫復(fù)合物在一定條件下出現(xiàn)蛋白質(zhì)析出。免疫沉淀與凝集反應(yīng)、中和反應(yīng)、補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng)并稱經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)。隨著對(duì)蛋白質(zhì)研究的不斷深入，人們將免疫沉淀方法與其他方法相結(jié)合，在其基礎(chǔ)上衍生出很多更為復(fù)雜的技術(shù)，使蛋白質(zhì)分析方法更為多樣化，應(yīng)用范圍更為廣泛。該技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因、蛋白質(zhì)以及其相互作用等研究領(lǐng)域。免疫沉

2、淀技術(shù)的發(fā)展 ：免疫沉淀技術(shù)的基本策略就是利用抗體與相應(yīng)抗原的高親和力特性檢出和結(jié)合溶液中靶分子。免疫沉淀技術(shù)從誕生起就一直隨著科技的發(fā)展而進(jìn)步。早期，研究人員利用凝膠電泳分辨免疫沉淀蛋白，將抗原溶液加入瓊脂糖之類的可滲透基質(zhì)的小孔內(nèi)，并在鄰近孔內(nèi)加入抗血清，隨著抗原抗體擴(kuò)散，大分子進(jìn)入凝膠內(nèi)，兩者相互作用，形成由多個(gè)抗體分子與抗原橋聯(lián)組成的復(fù)合物，通過(guò)抗體和抗原的擴(kuò)散形成濃度梯度，并在最適濃度處形成多分子網(wǎng)絡(luò)復(fù)合物，最終大分子蛋白復(fù)合物從溶液中析出形成肉眼可見(jiàn)的沉淀線。免疫沉淀的早期改進(jìn)方向是促進(jìn)多聚體反應(yīng)，使免疫復(fù)合物從溶液中析出。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)利用第二抗體與免疫復(fù)合物中的抗體形成網(wǎng)絡(luò)

3、結(jié)構(gòu)，可以不必對(duì)每種抗原的第一抗體進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)，這種方法一直沿用至今。20世紀(jì)70年代中期，人們開(kāi)始采用固相反應(yīng)，利用固定在金黃色葡萄球菌表面的蛋白A吸附抗體，再與相應(yīng)抗原結(jié)合。隨著科技的發(fā)展，目前這種方法已改進(jìn)為利用表面固定了蛋白A或蛋白G的微球來(lái)分離抗原抗體復(fù)合物，以達(dá)到檢測(cè)抗原或目標(biāo)蛋白的目的。 免疫沉淀技術(shù)的分類 ：隨著對(duì)蛋白質(zhì)研究的不斷深入，人們將免疫沉淀方法與其他方法相結(jié)合，在其基礎(chǔ)上衍生出很多更為復(fù)雜的技術(shù)，使蛋白質(zhì)分析方法更為多樣化，應(yīng)用范圍更為廣泛。該技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因、蛋白質(zhì)以其相互作用等研究領(lǐng)域。按應(yīng)用范圍分類，可分為以下四類： 1) 免疫沉淀（Individual

4、protein immunoprecipitation, IP）：利用抗體特異性從細(xì)胞裂解物或其他可溶性生物樣品中純化已知特定蛋白質(zhì)。IP與SDS-PAGE方法聯(lián)用時(shí)，可達(dá)到測(cè)量蛋白質(zhì)相對(duì)分子量，對(duì)已知抗原定量，確定蛋白質(zhì)降解速率等目的。 2) 免疫共沉淀（Protein complex immunoprecipitation , Co-IP）：利用抗體沉淀相應(yīng)特定抗原，同時(shí)沉淀與該抗原相互結(jié)合的其他分子，主要用于研究蛋白質(zhì)相互作用。Co-IP與WB或質(zhì)譜方法結(jié)合，可用于確定特定蛋白-興趣蛋白在天然狀態(tài)下的結(jié)合情況，確定特定蛋白質(zhì)的新作用搭檔。 3) 染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin imm

5、unoprecipitation, ChIP）：在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷，通過(guò)免疫沉淀復(fù)合體特異性富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，再通過(guò)對(duì)DNA片段的純化和檢測(cè)，獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可用于研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)間的關(guān)系。將ChIP與基因芯片相結(jié)合形成的ChIP-on-chip方法，可用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；ChIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，可用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)。 4) RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）：其原理與ChIP相近，但R

6、NA免疫沉淀是用來(lái)研究與蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。 免疫沉淀的關(guān)鍵影響因素 ：每種免疫沉淀方法都有一套固定的操作程序，但都是以抗原-抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)。目前常規(guī)操作是利用共價(jià)結(jié)合蛋白A或蛋白G的瓊脂糖或磁性微球?qū)⒎磻?yīng)后的抗原-抗體復(fù)合物富集純化。蛋白A和蛋白G能特異地和抗體的保守區(qū)Fc段結(jié)合，形成穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物附著在微球上（示意圖見(jiàn)圖2），溶液內(nèi)無(wú)關(guān)的分子可以通過(guò)洗滌微球被清除，最后，再采用一系列方法分析純化抗原或與抗原結(jié)合的其他分子。整個(gè)過(guò)程中值得注意的幾個(gè)關(guān)鍵影響因素如下： 1) 樣品處理的質(zhì)量 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵在于第一步樣品處理。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)本質(zhì)是處于天然

7、構(gòu)象狀態(tài)的抗原和抗體之間的反應(yīng)，而樣品處理的質(zhì)量決定了抗原抗體反應(yīng)中抗原的質(zhì)量，如抗原的豐度及抗原的構(gòu)象狀態(tài)。 樣品處理應(yīng)根據(jù)抗原樣品的來(lái)源如組織樣品、細(xì)胞或其他形式的樣品，選擇適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行細(xì)胞或組織破碎，使待檢抗原釋放至樣品溶液中。裂解緩沖液的使用應(yīng)注意添加合適的蛋白酶抑制，避免抗原或抗原-其他分子復(fù)合物被降解，另外，應(yīng)選用去垢劑強(qiáng)度合適的裂解液，既保證有效裂解細(xì)胞釋放抗原又不破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用。 2) 抗體的選擇 在考慮抗體特異性的同時(shí)，還需考慮抗體對(duì)抗原的親和力，如單克隆抗體只對(duì)抗原的單一表位具有良好的特異性，因此在免疫沉淀中如果抗原表位暴露不充分，受到破壞，或受其他因素影響，造

8、成抗體不能識(shí)別抗原，無(wú)法有效形成免疫沉淀復(fù)合物，那么這將直接影響免疫沉淀的結(jié)果。而多克隆抗體或混合單克隆抗體可以和抗原的多個(gè)表位結(jié)合，從而解決親和力的問(wèn)題。但是，并不是所有抗體都能用于免疫沉淀，應(yīng)選用經(jīng)IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后的抗體以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。此外，不同類型、同類不同亞型的抗體對(duì)蛋白 A或G的親和力不同，應(yīng)選擇合適的抗體及微球用于免疫沉淀。 3) 微球的選擇 目前廣泛應(yīng)用于免疫沉淀的微球以結(jié)合了蛋白 A或G的瓊脂糖和磁性微球?yàn)橹鳎ㄎ⑶蛞?jiàn)圖3）。瓊脂糖材料是無(wú)色透明、粒徑達(dá)微米級(jí)的具有多孔表面的微球，有巨大的表面積，蛋白結(jié)合量高，曾一度成為免疫沉淀技術(shù)中的主要材料。但在免疫沉淀操作中需要采用離

9、心的方法達(dá)到固液分離，而反復(fù)離心產(chǎn)生的物理應(yīng)力極易破壞蛋白的天然構(gòu)象及完整性，且由于瓊脂糖本身容易破碎，不易保存，限制了瓊脂糖微球在免疫沉淀中的發(fā)展。相比之下，磁性微球其核心為超順磁性粒子，核心外層包裹一層高分子材料，表面平滑，粒徑可達(dá)納米級(jí)，比表面積大，單位重量的微球蛋白結(jié)合量更大。超順磁性微球可以在外加磁場(chǎng)中表現(xiàn)磁性，實(shí)現(xiàn)快速有效分離，大大縮短實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間。溫和的磁性分離方式避免反復(fù)離心對(duì)蛋白天然構(gòu)象及完整性的破壞。超順磁性微球在增大機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性的同時(shí)，縮減了產(chǎn)品造價(jià)。上述的優(yōu)勢(shì)使超順磁性微球成為免疫沉淀試劑盒行業(yè)的新秀，逐漸被研究者所采用。 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)操作流程 以共價(jià)結(jié)合蛋白A或G

10、的磁性微球?yàn)槔庖叱恋聿僮鞯幕玖鞒倘缦拢?1) 抗原樣品的制備：血清或細(xì)胞分泌上清液等：根據(jù)目標(biāo)蛋白的豐度適當(dāng)調(diào)整抗原原液濃度。細(xì)胞裂解上清液：樣品是懸浮細(xì)胞，離心收集后用PBS洗滌2次，按比例加入細(xì)胞裂解液冰上裂解一定時(shí)間，離心收集上清液；樣品是貼壁細(xì)胞，移去培養(yǎng)基后用PBS洗滌2次，把細(xì)胞刮脫收集至EP管，按比例加入細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞一定時(shí)間，離心收集上清液。細(xì)菌裂解上清液：每克菌體按比例加入裂解緩沖液重懸，簡(jiǎn)短超聲裂解細(xì)胞，離心收集上清液。如樣品來(lái)源于組織或其他形式樣品，也應(yīng)選擇合適的裂解緩沖液及方式進(jìn)行破碎，使待檢抗原釋放至樣品溶液中。 2) 磁性微球與抗體結(jié)合反應(yīng)：磁珠的準(zhǔn)備

11、及預(yù)平衡：取一定量磁珠懸液至EP管內(nèi)，把EP管置于磁性分離器上分離固液，用Binding Buffer洗滌2遍；抗體與磁珠反應(yīng)：用Binding Buffer將所需抗體稀釋至一定體積，與預(yù)平衡后的磁珠混合反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)磁性分離移走上清液；磁珠-抗體復(fù)合物的洗滌：從磁性分離器上取下EP管，加入Binding Buffer用微量移液器輕吹抗體-磁珠復(fù)合物使其均勻分散，再經(jīng)磁性分離移走上清，重復(fù)操作1次，去除殘留未結(jié)合抗體和其他雜質(zhì)等。 3) 抗原沉淀反應(yīng)：抗原與抗體反應(yīng)：向抗體-磁珠復(fù)合物中加入一定體積的抗原溶液，用移液器輕吹使磁珠分散均勻，孵育時(shí)間及溫度根據(jù)抗體與抗原結(jié)合強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)

12、整，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)磁性分離移走上清；磁珠-抗體-抗原復(fù)合物的洗滌：加入一定體積Washing Buffer輕吹磁珠使其分散，通過(guò)磁性分離移走上清，重復(fù)操作2次，是去除非特異性粘附的蛋白及雜質(zhì)。加入一定體積Washing Buffer輕吹磁珠，用移液器將懸液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，以為避免原管壁上非特異性吸附的蛋白被一起洗脫，影響免疫沉淀結(jié)果。 4) 抗原/抗原-其他分子復(fù)合物的洗脫及鑒定：變性洗脫：磁珠-抗體-抗原復(fù)合物與一定體積1×SDS Loading Buffer混合加熱，通過(guò)磁性分離收集的上清液可直接用于SDS-PAGE檢測(cè)；非變性洗脫（復(fù)合物保持完整可用于后期功能分析）：磁珠-

13、抗體-抗原復(fù)合物與一定體積Elution Buffer混合反應(yīng)一定時(shí)間，通過(guò)磁性分離收集上清液，如果Elution Buffer的pH較低，收集上清液后立即用堿性緩沖液調(diào)節(jié)pH至中性。 作為蛋白質(zhì)研究中的重要技術(shù)，國(guó)內(nèi)外各大公司都在不斷地開(kāi)發(fā)與免疫沉淀技術(shù)相關(guān)的產(chǎn)品。目前免疫沉淀產(chǎn)品系列豐富、涵蓋范圍廣，能夠滿足研究者的不同需求。對(duì)于剛剛開(kāi)始使用免疫沉淀技術(shù)的研究人員來(lái)說(shuō)，使用成熟的商品化試劑盒和相關(guān)的技術(shù)服務(wù)會(huì)達(dá)到事半功倍的效果，現(xiàn)已有一些質(zhì)量?jī)?yōu)異的品牌如Invitrogen DynalBeads、ThermoFisher以及BeaverBeads等。技術(shù)支持：本專題資料由海貍納米科技（蘇州

14、）有限公司提供并參與校對(duì)。海貍發(fā)源于美國(guó)麻省理工學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程中心。公司以具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的前沿生物納米表面技術(shù)為根本，定位于生命科學(xué)研究、生物醫(yī)藥研發(fā)和疾病診斷行業(yè)的全球市場(chǎng)，專注于多個(gè)領(lǐng)域的高端生物耗材和生物納米材料的產(chǎn)業(yè)化。“海貍”的口號(hào)是把高端產(chǎn)品做成常規(guī)，把常規(guī)產(chǎn)品做到極致。海貍公司的BeaverBeads系列免疫磁珠具有高度均一的IgG結(jié)合能力，一步純化可從血清樣品中分離出純度大于90%的抗體。 海貍納米市場(chǎng)部參考文獻(xiàn) 1 Collas, Philippe. (January 2010). The Current State of Chromatin Immunoprecipit

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