酪蛋白等電點(diǎn)實(shí)驗(yàn)講解學(xué)習(xí)

1、酪蛋白等電點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)要求與實(shí)驗(yàn)室規(guī)則一、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)要求與實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 1、遵守課堂紀(jì)律、維護(hù)課堂秩序，不遲到、不早退，嚴(yán)禁打鬧，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿實(shí)驗(yàn)服。 2、原則上不允許請假。如是病假，須醫(yī)院開具證明，且要輔導(dǎo)員簽字；如是事假，列出事假理由，并有輔導(dǎo)員簽字。由于請假漏做的實(shí)驗(yàn)，需要補(bǔ)做，否則零分。無故曠課，則零分，且實(shí)驗(yàn)課須重修。 3、實(shí)驗(yàn)前要認(rèn)真預(yù)習(xí)，掌握實(shí)驗(yàn)的目的、 原理，熟悉操作步驟。聽從老師的安排，不違規(guī)操作，注意自身安全。實(shí)驗(yàn)完成后要及時(shí)書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告（實(shí)驗(yàn)名稱、日期、目的、原理、步驟、結(jié)果、結(jié)果分析、思考題，文字簡練、準(zhǔn)確、認(rèn)真，實(shí)驗(yàn)報(bào)告下一次實(shí)驗(yàn)課開始前上交，統(tǒng)一用實(shí)驗(yàn)

2、報(bào)告紙）。 4、實(shí)驗(yàn)臺面應(yīng)隨時(shí)保持整潔，儀器、藥品擺放整齊。公用試劑用完后，應(yīng)及時(shí)復(fù)原。實(shí)驗(yàn)完成后，儀器洗凈并放回原處，將實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的垃圾打掃干凈，方可離開實(shí)驗(yàn)室。 5、注意節(jié)約藥品、試劑；洗滌和使用儀器時(shí)要小心仔細(xì)，防止損傷儀器及造成自身傷害；發(fā)現(xiàn)儀器故障應(yīng)立即報(bào)告老師，不可擅自動手檢修。 6、嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室吸煙、喝水、吃東西。 7、每次實(shí)驗(yàn)課結(jié)束，由班長負(fù)責(zé)安排值日生，負(fù)責(zé)打掃實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生。二、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作二、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作 （一）常用玻璃器皿的洗滌玻璃器皿潔凈與否，是實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確的重要環(huán)節(jié)。潔凈依據(jù)：內(nèi)壁應(yīng)十分明亮光滑，無水珠附在玻壁上。1、新購玻璃器材的清洗：一般用12

3、%的稀鹽酸浸泡12h，有條件的可以用濃硫酸浸泡30min，再用水沖洗，以去除附著的油污、灰塵和金屬離子等。2、用過的玻璃器材清洗：（1）一般器皿（如燒杯、試管等） 用肥皂水和毛刷刷洗，再用清水沖洗干凈。（2）定容分析器皿（如吸量管、量筒等） 比較干凈的，直接去離子水沖洗即可；否則用鉻酸（酸性和氧化性）洗液浸泡，自來水和蒸餾水沖洗。（3）粘附有血漿的刻度吸管清洗 45%尿素浸泡或1%氨水浸泡后，再稀鹽酸浸泡，對于頑固污垢可再次采用重鉻酸鉀溶液浸泡。 （二）常用器材的使用方法1、吸量管種類和使用（1）種類：移液管、奧氏吸管和刻度吸管移液管移液管奧氏吸管奧氏吸管刻度吸管刻度吸管 （2）刻度吸管的使用

4、 使用前： 吸管無破損且干凈；選取合適的量程；觀察有無“吹”字：若有，說明刻度到尖端，放液后需將尖端的溶液吹出，否則不吹。 握法：拇指和中指夾拄吸管，食指游離。 取液：垂直入液 ，且入液深度適中； 吸耳球吸取液體，并使液高高于待量刻度2-3cm； 食指按緊吸管上端，并提離液面、觀察液內(nèi)有無氣泡。 放液至刻度：刻度吸管垂直，右眼與刻度線平行，輕輕松開食指（轉(zhuǎn)動刻度吸管），使液面緩慢降低，直至最低點(diǎn)與刻度線相切。 放液至容器：刻度吸管垂直，容器傾斜45，使溶液自然流入容器，注意吹與不吹。 注意：一根吸管只吸取一種試劑；嚴(yán)禁用嘴吸。 2、自動移液器的使用優(yōu)點(diǎn)：使用方便，取、加樣速度優(yōu)點(diǎn)：使用方便，取

5、、加樣速度快，計(jì)量準(zhǔn)確，不易破損，可以快，計(jì)量準(zhǔn)確，不易破損，可以吸取多種液體（只需要換槍嘴即吸取多種液體（只需要換槍嘴即可）可）移液器使用方法和注意事項(xiàng)移液器使用方法和注意事項(xiàng) （1）設(shè)定移液體積：）設(shè)定移液體積： 從大量程調(diào)節(jié)至小量程為正常調(diào)節(jié)方法；從小量程調(diào)節(jié)至大量程時(shí)，應(yīng)先調(diào)至超過設(shè)定體積刻度，再回調(diào)至設(shè)定體積，這樣可以保證移液器的精確度。 （2）裝配移液槍頭裝配移液槍頭 ：將移液槍垂直插入吸頭，左右旋轉(zhuǎn)半圈，上緊即可。 （3）吸液及放液：）吸液及放液： 垂直吸液；吸頭尖端浸入液面3mm以下，吸液前槍頭先在液體中預(yù)潤洗2-3次確保移液的精度和準(zhǔn) ； 慢吸慢放，以防突然松開溶液吸入過快而

6、沖入取液器內(nèi)腐蝕柱塞而造成漏氣；放液時(shí)如果量很小則應(yīng)吸頭尖端可靠容器內(nèi)壁。 （4）不適合吸取濃度和粘度大的液體）不適合吸取濃度和粘度大的液體（可采用反向移液技術(shù)移取高粘度液體） 。 （5）吸有液體的移液槍不應(yīng)平放，）吸有液體的移液槍不應(yīng)平放，槍頭內(nèi)的液體很容易污染槍內(nèi)部而可能導(dǎo)致槍的彈簧生銹。 （6）移液槍在每次實(shí)驗(yàn)后應(yīng)將刻度調(diào)至最大，）移液槍在每次實(shí)驗(yàn)后應(yīng)將刻度調(diào)至最大，讓彈簧回復(fù)原型以延長移液槍的使用壽命 （7）移液槍校正 ：可用分析天平稱量所取純水的重量并進(jìn)行計(jì)算的方法，來校正取液器，1mL蒸餾水20時(shí)重0.9982g. （8）移液器嚴(yán)禁吸取有強(qiáng)揮發(fā)性、強(qiáng)腐蝕性的液體（如濃酸、濃堿、有機(jī)

7、物等）。 （9）嚴(yán)禁使用移液器吹打混勻液體。 （10）不要用大量程的移液器移取小體積的液體，以免影響準(zhǔn)確度； 同時(shí)，如果需要移取量程范圍以外較大量的液體，請使用移液管進(jìn)行操作。 （11）如液體不小心進(jìn)入活塞室應(yīng)及時(shí)清除污染物；定期清潔移液槍外壁，可以用95%酒精或60%的異丙醇，再用蒸餾水擦拭，自然晾干。 3、溶液的混勻、過濾及離心 （1）混勻的目的：）混勻的目的：使反應(yīng)體系內(nèi)的各種物質(zhì)分子很好的相互接觸，充分的進(jìn)行反應(yīng)；使欲稀釋的溶液成為濃度均一的溶液。 （2）常用的混勻方式）常用的混勻方式 ：腕混勻、指彈混勻、吹吸混勻、攪拌混勻、磁攪拌混勻、渦旋器混勻等。 （3）混勻注意事項(xiàng)：）混勻注意事

8、項(xiàng)：防止液體濺出，嚴(yán)禁用手指堵塞容器口。 （4）過濾：）過濾：收集濾液、沉淀或洗滌沉淀。三、分光光度法三、分光光度法 （一）分光光度法的原理（掌握） （二）如何求被測組分的含量（掌握） （三）分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu) （四）分光光度法計(jì)的使用與注意事項(xiàng)（一）分光光度法（一）分光光度法 概念概念：是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項(xiàng)技術(shù)。 特點(diǎn)特點(diǎn)：靈敏度高（可達(dá)10-510-6mol/L）、精確度高（誤差5%）、操作簡便、快速。對于復(fù)雜的組分系統(tǒng)，無須分離即可檢測出其中所含的微量組分。（二）分光光度法的原理（二）分光光度法的原理 LambertLambert（朗勃）定律（朗勃）定

9、律I0I入射光強(qiáng)度透過光強(qiáng)度LC液層厚度液層厚度0IIT 透光率lkIIolg BeerBeer（比爾）定律（比爾）定律ckIIolgI0I入射光強(qiáng)度透過光強(qiáng)度LC液層厚度液層厚度 Lambert-Beer（朗勃-比爾）定律lkIIolgckIIolglckIIolgIIlgA表示，即A用），absorbance度，稱作吸光度（表示溶液對光吸收的程IIlg由此可見，溶液不透光。乎被溶液完全吸收，即值無窮大，表示光線幾IIlg時(shí)，0I當(dāng)線較多；值大，表示溶液吸收光IIlg時(shí)，II當(dāng)光線；，表示溶液完全不吸收0IIlg時(shí)，I I當(dāng)公式的意義：0000000lckA（三）如何求被測組分的含量（三）如

10、何求被測組分的含量1、利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測定物的含量、利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測定物的含量2 2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測定物含量、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測定物含量3 3、利用標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)法求出待測溶液的濃度、利用標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)法求出待測溶液的濃度4 4、利用消光系數(shù)法求出待測溶液的濃度、利用消光系數(shù)法求出待測溶液的濃度（1）利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測定物的含量）利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測定物的含量 在相同條件下測定已知濃度（在相同條件下測定已知濃度（CS）標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度（）標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度（AS），），同時(shí)也測定末知濃度（同時(shí)也測定末知濃度（CU）的吸光度（）的吸光度（AU），），CsAsAuCuCsCuAsAuAuAsLsLuKs：KuKsCsL

11、sAsKuCuLu：Au即比值之比值也等于兩濃度之與所以因?yàn)楦鶕?jù)定律得（2 2）利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測定物含量）利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測定物含量 先配制一系列濃度由小到大的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測出它先配制一系列濃度由小到大的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測出它們的吸光度。然后以各管吸光度（們的吸光度。然后以各管吸光度（A A）為縱坐標(biāo)，各管的）為縱坐標(biāo)，各管的濃度（濃度（C C）為橫坐標(biāo)，在方格坐標(biāo)紙上作圖。）為橫坐標(biāo)，在方格坐標(biāo)紙上作圖。 若被測物質(zhì)對光的吸收符合光的吸收定律，則必然得若被測物質(zhì)對光的吸收符合光的吸收定律，則必然得到一條通過原點(diǎn)的直線，即到一條通過原點(diǎn)的直線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線，亦稱工作曲線。以，亦稱工作曲

12、線。以后對末知濃度物質(zhì)測定時(shí)，無需再作標(biāo)準(zhǔn)管，據(jù)測定管吸后對末知濃度物質(zhì)測定時(shí)，無需再作標(biāo)準(zhǔn)管，據(jù)測定管吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可求得測定物的濃度。光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可求得測定物的濃度。 標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度-吸光度曲線）吸光度曲線）對末知濃度物質(zhì)測對末知濃度物質(zhì)測定時(shí)，無需再作標(biāo)定時(shí)，無需再作標(biāo)準(zhǔn)管，據(jù)測定管吸準(zhǔn)管，據(jù)測定管吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可求得測定物的即可求得測定物的濃度。濃度。 0.20.80.40.6AC（四）分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)（四）分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)光源光源單單色色光器光器吸收池吸收池檢測檢測器器顯顯示示鎢絲鎢絲燈燈 可見光源可見光源3501000nm35

13、01000nm氫氫燈燈氘氘燈燈紫外光源紫外光源 200360nm200360nm棱鏡棱鏡衍射光衍射光柵柵玻璃比色杯玻璃比色杯石英比色杯石英比色杯硒硒光光電電池池光光電電管管光光電電倍增管倍增管玻璃玻璃能吸收能吸收UVUV光，僅適用于可見光，僅適用于可見光區(qū)。光區(qū)。石英石英不能吸收不能吸收紫外光，適用于紫紫外光，適用于紫外光區(qū)。外光區(qū)。將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)閷⒐庑盘栟D(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕难b置。電信號的裝置。記錄裝置：記錄裝置： 訊號處理和顯訊號處理和顯示系統(tǒng)。示系統(tǒng)。分光光度計(jì)使用的注意事項(xiàng)分光光度計(jì)使用的注意事項(xiàng) 比色杯應(yīng)相匹配性（對光的吸收和反射應(yīng)一致），不比色杯應(yīng)相匹配性（對光的吸收和反射應(yīng)一致），不得隨

14、意挪用。得隨意挪用。 比色杯應(yīng)持其側(cè)壁的毛玻璃面。比色杯應(yīng)持其側(cè)壁的毛玻璃面。 盛液時(shí)達(dá)到盛液時(shí)達(dá)到比色杯的比色杯的3/43/4即可，不能太滿，外壁如有液即可，不能太滿，外壁如有液體，只能用濾紙沾去水份，再用擦鏡紙擦干凈。體，只能用濾紙沾去水份，再用擦鏡紙擦干凈。 測畢，比色液測畢，比色液一般應(yīng)倒回原試管一般應(yīng)倒回原試管中，直至計(jì)算無誤后中，直至計(jì)算無誤后方可倒掉。方可倒掉。病原菌多基因調(diào)控機(jī)制研究病原菌多基因調(diào)控機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一酪蛋白等電點(diǎn)測定酪蛋白等電點(diǎn)測定（P62）實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 理解等電點(diǎn)的意義及蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)的性質(zhì) 熟悉蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測定的操

15、作方法實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，分子中含有的氨基和羧基均可電離。當(dāng)溶液中的pH值大于等電點(diǎn)時(shí)，其氨基電離被抑制而羧基電離，蛋白質(zhì)成帶負(fù)電荷的陰離子。反之，當(dāng)溶液pH小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，其羧基電離受到抑制而氨基接受質(zhì)子，蛋白質(zhì)成為帶正電荷的陽離子。當(dāng)溶液pH值達(dá)到某一值時(shí)，蛋白質(zhì)分子成為所帶的正、負(fù)電荷數(shù)相等的兼性離子，此時(shí)溶液的pH值就是該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的粘度和溶解度均大幅降低。 本實(shí)驗(yàn)觀察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解狀態(tài)以測定其等電點(diǎn)。以醋酸和酪蛋白溶液中的醋酸鈉構(gòu)成各種不同pH值的緩沖液，在某種溶液中，酪蛋白溶解度最小時(shí)，該溶液的pH值就是酪蛋白的等電點(diǎn)。（三）實(shí)驗(yàn)材料 器材：200和1000L可調(diào)移液槍、試管、試管架、刻度吸管等 試劑：1.00mol/L、0.01mol/L和0.100mol/L