細胞生物學(xué)3細胞生物學(xué)研究方法02ppt課件

1、基基因因敲敲除除基基因因敲敲除除表表示示圖圖1 1基基因因敲敲除除表表示示圖圖2 2基基因因敲敲除除原原理理 Knockout Mice 未未來來的的生生物物技技術(shù)術(shù)Caenorhabditis elegansDrosophila melanogasterArabidopsis thalianaC. elegansZebrafish免疫膠體金技術(shù) 根本原理：根本原理： 氯金酸氯金酸(HAuCl4)在復(fù)原劑作用下，可聚合成在復(fù)原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，構(gòu)成帶負電的疏水膠狀溶一定大小的金顆粒，構(gòu)成帶負電的疏水膠狀溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體形狀，故液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體

2、形狀，故稱膠體金。稱膠體金。 膠體金標志：本質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附膠體金標志：本質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒外表的過程。到膠體金顆粒外表的過程。 吸附機理：因膠體金顆粒外表負電荷，吸附機理：因膠體金顆粒外表負電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而構(gòu)與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而構(gòu)成結(jié)實結(jié)合。用復(fù)原法可以方便地從氯成結(jié)實結(jié)合。用復(fù)原法可以方便地從氯金酸值被各種不同顏色的膠體金顆粒。金酸值被各種不同顏色的膠體金顆粒。 運用：膠體金粒子對蛋白質(zhì)有很強的吸運用：膠體金粒子對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌蛋白、免疫附功能，可以與葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、

3、球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血潔白蛋白多肽聚合物等結(jié)合，激素、牛血潔白蛋白多肽聚合物等結(jié)合，因此在根底研討和臨床實驗中成為非常因此在根底研討和臨床實驗中成為非常有用的工具。有用的工具。免疫膠體金標定免疫膠體金標定(Immunogold labeling) 利用了膠體金顆粒具有高電子密度的特利用了膠體金顆粒具有高電子密度的特性，在蛋白質(zhì)與金粒子結(jié)合處，在顯微性，在蛋白質(zhì)與金粒子結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒。因此，可以察看鏡下可見黑褐色顆粒。因此，可以察看蛋白質(zhì)的分布區(qū)域。蛋白質(zhì)的分布區(qū)域。 在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培育從機體中取出在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培育從機體中取出的細

4、胞，并使之生存和生長的技術(shù)為細胞培育技的細胞，并使之生存和生長的技術(shù)為細胞培育技術(shù)。培育中的細胞不受體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的影響，人術(shù)。培育中的細胞不受體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的影響，人為改動培育條件為改動培育條件( (如物理、化學(xué)、生物等外界要素如物理、化學(xué)、生物等外界要素的變化的變化) )即可進一步察看細胞在單要素或多要素的即可進一步察看細胞在單要素或多要素的影響下的生理功能變化。影響下的生理功能變化。細胞培育細胞培育人的細胞培育人的細胞培育 細胞系細胞系: : 原代培育物經(jīng)初次傳代勝利后即為細胞系，有原代培育物經(jīng)初次傳代勝利后即為細胞系，有無限的傳代才干。無限的傳代才干。細胞株細胞株: : 經(jīng)過原代培育或經(jīng)過

5、細胞克隆與選擇而建立的、經(jīng)過原代培育或經(jīng)過細胞克隆與選擇而建立的、具有特異的性質(zhì)或標志的細胞系，但是它們具有有限的具有特異的性質(zhì)或標志的細胞系，但是它們具有有限的傳代才干。傳代才干。原代培育：是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立原代培育：是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立刻進展培育。因此，較為嚴厲地說是指勝利傳代之前的刻進展培育。因此，較為嚴厲地說是指勝利傳代之前的培育，此時的細胞堅持原有細胞的根本性質(zhì)培育，此時的細胞堅持原有細胞的根本性質(zhì) 植物組織培育植物組織培育 植物原生質(zhì)體培育植物原生質(zhì)體培育 植物組織培育植物組織培育 外植體外植體愈傷組織愈傷組織新植株新植株 來源于細胞，而不具有

6、完好的細胞構(gòu)造，但包含了進展正常生物學(xué)反響所需來源于細胞，而不具有完好的細胞構(gòu)造，但包含了進展正常生物學(xué)反響所需的物質(zhì)的物質(zhì)(如供能系統(tǒng)和酶反響體系等如供能系統(tǒng)和酶反響體系等)組成的體系即為非細胞體系組成的體系即為非細胞體系 近年來非細胞體系在研討近年來非細胞體系在研討DNA復(fù)制、復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、高爾基體的膜泡運輸轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、高爾基體的膜泡運輸機制以反細胞核裝配機制以反細胞核裝配(包括染色質(zhì)裝配、核膜裝配及核骨架的裝配包括染色質(zhì)裝配、核膜裝配及核骨架的裝配)等。等。概念概念 流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)Flow CytometryFlow Cytometry，F(xiàn)CMFCM 利用流式

7、細胞儀對處在快速、直線、流動形狀中的單細胞或生利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動形狀中的單細胞或生物顆粒進展多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的物顆粒進展多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術(shù)?，F(xiàn)代細胞分析技術(shù)。 流式細胞儀流式細胞儀Flow Cytometer)Flow Cytometer) 集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電丈量技術(shù)、電子計算機技集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電丈量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。技儀器。 原理：原理： 將待測細胞染色后制成

8、單細胞懸液。用一定壓力將待測樣將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就可以包鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就可以包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行陳列，依次經(jīng)過檢測區(qū)域。被下單行陳列，依次經(jīng)過檢測區(qū)域。Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged Pla

9、tesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector細細胞胞分分選選細細胞胞標標志志染染色色體體分分選選染染色色體體標標志志FACSAria科研型流式細胞儀檢測范圍細胞大小細胞粒度細胞外表面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細胞構(gòu)造特異性抗原細胞外表/胞漿/核細胞內(nèi)細胞因子細胞活性酶活性激素結(jié)合位點細胞受體細胞功能流式細胞儀的任務(wù)原理流式細胞儀的任務(wù)原理 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 激光光源激光光源 光搜集系統(tǒng)光搜集系統(tǒng) 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 流動室流動室 液流驅(qū)動系統(tǒng)液流驅(qū)動系統(tǒng) 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)

10、換光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處置系數(shù)據(jù)處置系統(tǒng)統(tǒng) 細胞分選系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng) 細胞工程技術(shù)是細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)的交細胞工程技術(shù)是細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)的交叉領(lǐng)域，主要利用細胞生物學(xué)的原理和方叉領(lǐng)域，主要利用細胞生物學(xué)的原理和方法，結(jié)合工程學(xué)的技術(shù)手段，按照人們預(yù)法，結(jié)合工程學(xué)的技術(shù)手段，按照人們預(yù)先的設(shè)計，有方案地改動或發(fā)明細胞遺傳先的設(shè)計，有方案地改動或發(fā)明細胞遺傳性的技術(shù)。包括體外大量培育和繁衍細胞，性的技術(shù)。包括體外大量培育和繁衍細胞，或獲得細胞產(chǎn)品、或利用細胞體本身。主或獲得細胞產(chǎn)品、或利用細胞體本身。主要內(nèi)容包括：細胞交融、細胞生物反響器、要內(nèi)容包括：細胞交融、細胞生物反響器、染色體轉(zhuǎn)移、細胞器移植、

11、基因轉(zhuǎn)移、細染色體轉(zhuǎn)移、細胞器移植、基因轉(zhuǎn)移、細胞及組織培育。胞及組織培育。細胞工程細胞工程在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個不同基因型的細胞兩個不同基因型的細胞或原生質(zhì)體交融構(gòu)成一或原生質(zhì)體交融構(gòu)成一個雜種細胞。根本過程個雜種細胞。根本過程包括細胞交融構(gòu)成異核包括細胞交融構(gòu)成異核體體(heterokaryon)、異核、異核體經(jīng)過細胞有絲分裂進體經(jīng)過細胞有絲分裂進展核交融、最終構(gòu)成單展核交融、最終構(gòu)成單核的雜種細胞。核的雜種細胞。 細胞交融細胞交融 聚乙二醇聚乙二醇PEG法細胞交融過程法細胞交融過程顯微鏡下細胞交融過程顯微鏡下細胞交融過程BHK-21細胞用核骨架蛋白抗體進展免疫膠體金

12、標志的結(jié)果細胞用核骨架蛋白抗體進展免疫膠體金標志的結(jié)果IF：中間纖維；：中間纖維；g:金顆粒；金顆粒；N:核區(qū)核區(qū)外周血血細胞掃描電鏡標本的制備外周血血細胞掃描電鏡標本的制備取血取血-PBS洗三次洗三次-滴片滴片(有有Formvar膜膜)-冷的冷的1%戊二醛戊二醛4度固定度固定2小時小時-PBS-1%四氧化鋨，四氧化鋨，30分分-PBS-50、70、90%丙酮各一次，丙酮各一次，100%兩次兩次-50、70、90%醋酸異戊酯丙酮溶液各一次，醋酸異戊酯丙酮溶液各一次，100%醋酸異戊酯兩次醋酸異戊酯兩次-臨界點枯燥臨界點枯燥-噴碳、噴碳、金金察看察看人類血細胞人類血細胞SEM照片照片 GFP是從

13、一種生活在北太平洋冰冷水域的水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)是從一種生活在北太平洋冰冷水域的水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。在蛋白質(zhì)編號的。在蛋白質(zhì)編號lema中可以看到中可以看到GFP發(fā)色團的骨架在發(fā)色團的骨架在左邊。蛋白質(zhì)鏈構(gòu)成一個圓柱形罐頭藍色，子鏈的左邊。蛋白質(zhì)鏈構(gòu)成一個圓柱形罐頭藍色，子鏈的一部分直接從中間穿過綠色，發(fā)色團剛好在罐頭盒一部分直接從中間穿過綠色，發(fā)色團剛好在罐頭盒的中間，它被維護起來以免受周圍環(huán)境的影響的中間，它被維護起來以免受周圍環(huán)境的影響 GFP的的純?nèi)芤涸诘湫偷氖夜庀鲁庶S色，但是當被拿到戶外的陽純?nèi)芤涸诘湫偷氖夜庀鲁庶S色，但是當被拿到戶外的陽光下時，它會發(fā)出鮮綠的顏色。這種蛋白質(zhì)從陽光中吸光下時，它

14、會發(fā)出鮮綠的顏色。這種蛋白質(zhì)從陽光中吸收紫外光，然后以能量較低的綠光方式發(fā)射出來。收紫外光，然后以能量較低的綠光方式發(fā)射出來。綠色熒光蛋白的運用綠色熒光蛋白的運用 綠色熒光蛋白是當代科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最重綠色熒光蛋白是當代科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最重要的工具之一，它從顯微程度上照亮了生要的工具之一，它從顯微程度上照亮了生命命 。隨著病毒在宿主體內(nèi)不斷分散，他就可以經(jīng)過跟蹤發(fā)出的綠隨著病毒在宿主體內(nèi)不斷分散，他就可以經(jīng)過跟蹤發(fā)出的綠光來察看病毒的分散途徑，或者他把它接合到一種蛋白質(zhì)上光來察看病毒的分散途徑，或者他把它接合到一種蛋白質(zhì)上并經(jīng)過顯微鏡察看它在細胞內(nèi)部的挪動并經(jīng)過顯微鏡察看它在細胞內(nèi)部的挪動科學(xué)運用

15、綠色熒光蛋白跟蹤大腦神經(jīng)細科學(xué)運用綠色熒光蛋白跟蹤大腦神經(jīng)細胞的發(fā)育過程。胞的發(fā)育過程。綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)下村修 1962年首先從水母年首先從水母中分別綠色熒光蛋中分別綠色熒光蛋白的科學(xué)家，他發(fā)白的科學(xué)家，他發(fā)現(xiàn)這種蛋白在紫外現(xiàn)這種蛋白在紫外線光中呈現(xiàn)亮色。線光中呈現(xiàn)亮色。 1992年，道格拉斯年，道格拉斯普瑞金拿到了綠色普瑞金拿到了綠色熒光蛋白的基因。熒光蛋白的基因。 綠色熒光蛋白的推行馬丁-查爾菲 1993年，馬丁年，馬丁查爾查爾菲勝利地經(jīng)過基因菲勝利地經(jīng)過基因重組的方法使得除重組的方法使得除水母以外的其他生水母以外的其他生物物(如大腸桿菌等如大腸桿菌等)也能產(chǎn)生綠色熒光也能產(chǎn)生綠色熒光蛋

16、白，證明了綠色蛋白，證明了綠色熒光蛋白與活體生熒光蛋白與活體生物的相容性。物的相容性。綠色熒光蛋白的改造錢永健 進展了大刀闊斧的化學(xué)進展了大刀闊斧的化學(xué)改造，不但大大加強了改造，不但大大加強了它的發(fā)光效率，還開展它的發(fā)光效率，還開展出了紅色、藍色、黃色出了紅色、藍色、黃色熒光蛋白，使得熒光蛋熒光蛋白，使得熒光蛋白真正成為了一個琳瑯白真正成為了一個琳瑯滿目的工具箱，供生物滿目的工具箱，供生物學(xué)家們選用。學(xué)家們選用。綠色熒光蛋白質(zhì)在科學(xué)研討和藝術(shù)領(lǐng)域發(fā)揚綠色熒光蛋白質(zhì)在科學(xué)研討和藝術(shù)領(lǐng)域發(fā)揚作用的美麗而令人詫異的例子。作用的美麗而令人詫異的例子。 3 3位諾貝爾獎得主第一次分別出的熒光基因，就是從

17、上面照片中的這位諾貝爾獎得主第一次分別出的熒光基因，就是從上面照片中的這種水晶水母體內(nèi)獲得的。種水晶水母體內(nèi)獲得的。 水晶水母水晶水母 圖片中的小老鼠是圖片中的小老鼠是2019年年7月在大阪大學(xué)降生的，它們是第一種可以月在大阪大學(xué)降生的，它們是第一種可以在夜里發(fā)光的哺乳動物。研討人員可利用熒光老鼠研討胎兒發(fā)育。在夜里發(fā)光的哺乳動物。研討人員可利用熒光老鼠研討胎兒發(fā)育。 會發(fā)光的老鼠會發(fā)光的老鼠 杰夫杰夫利希曼利希曼(Jeff Lichtman)之手，展現(xiàn)了大腦內(nèi)的銜接，圖片之手，展現(xiàn)了大腦內(nèi)的銜接，圖片中美麗的中美麗的“彩虹就是神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)。彩虹就是神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)。腦內(nèi)銜接腦內(nèi)銜接 這兩只熒光豬

18、誕生于中國黑龍江省哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的實驗室。這兩只熒光豬誕生于中國黑龍江省哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的實驗室。它們的發(fā)光身手并不是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的直接產(chǎn)物，而是從其經(jīng)過基因它們的發(fā)光身手并不是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的直接產(chǎn)物，而是從其經(jīng)過基因改造的母親那里遺傳而來。改造的母親那里遺傳而來。兩只熒光豬 發(fā)紅光的貓發(fā)紅光的貓左側(cè)的貓由韓國研討人員左側(cè)的貓由韓國研討人員2019年晚些時候打造，可以在紫外線下年晚些時候打造，可以在紫外線下發(fā)出紅光。某些情況下，這些熒光蛋白基因可用作一種分子開關(guān)，發(fā)出紅光。某些情況下，這些熒光蛋白基因可用作一種分子開關(guān)，觸發(fā)其它細胞活動觸發(fā)其它細胞活動 GFP賓尼兔賓尼兔 熒光兔熒光兔“阿爾

19、巴阿爾巴(Alba)。阿爾巴是在轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)助下。阿爾巴是在轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)助下?lián)碛羞@種熒光基因的。擁有這種熒光基因的。的問世在世界上引發(fā)的問世在世界上引發(fā)不小爭議。不小爭議。 蝌蚪也發(fā)光蝌蚪也發(fā)光 熒光魚熒光魚 在約克鎮(zhèn)科技公司將熒光魚引入市場后不久，熒光蛋白便在約克鎮(zhèn)科技公司將熒光魚引入市場后不久，熒光蛋白便迅速在商業(yè)上得到運用。迅速在商業(yè)上得到運用。 綠色熒光蛋白質(zhì)可以協(xié)助科學(xué)家了解細胞機制如綠色熒光蛋白質(zhì)可以協(xié)助科學(xué)家了解細胞機制如何任務(wù)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，一切細胞和動物都可何任務(wù)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，一切細胞和動物都可以產(chǎn)生熒光蛋白質(zhì)。以產(chǎn)生熒光蛋白質(zhì)。 康涅狄格學(xué)院化學(xué)家、康涅狄格學(xué)院化學(xué)家、作者馬克作者馬克齊齊默默(Mark Zimmer)將綠色熒光蛋白質(zhì)稱之為將綠色熒光蛋白質(zhì)稱之為“21世紀的顯微鏡。經(jīng)過讓基因攜帶綠色熒光蛋白世紀的顯微鏡。經(jīng)過讓基因攜帶綠色熒光蛋白質(zhì)質(zhì)與瘤轉(zhuǎn)移或大腦功能有關(guān)的基因與瘤轉(zhuǎn)移或大腦功能有關(guān)的基因科學(xué)科學(xué)家只需經(jīng)過尋覓熒光便可知道基因何時以及為什家只需經(jīng)過尋覓熒光便可知道基因何時以及為什么么“開啟。開啟。 細胞構(gòu)造、蛋白質(zhì)如受體、抗原、抗體、酶、細胞細胞構(gòu)造、蛋白質(zhì)如受體、抗原、抗體、酶、