生物技術(shù)藥物的相關(guān)知識

1、1第三節(jié)第三節(jié) 常用定量分析方法及其運用常用定量分析方法及其運用藥學藥學0201 30219010122生化藥物、基因工程藥物常用定量分析方法生化藥物、基因工程藥物常用定量分析方法理化分析法 化學分析法 電化學分析法 光譜分析法 色譜法生化測定法 酶法 電泳法生物檢定法3化學分析法化學分析法n重量法重量法 根據(jù)樣品中分離出的單質(zhì)或化合物的重量測定所含成分的含量根據(jù)被測組分分離方法分類： 提取法 胰酶中脂肪含量的測定 揮發(fā)法 熾灼殘渣 干燥失重 沉淀法 沉淀反應(yīng)n滴定分析法滴定分析法 根據(jù)樣品中某些成分與標準溶液能定量地發(fā)生酸堿中和、氧化還原或絡(luò)合反應(yīng)等進行測定 4電化學分析法電化學分析法離子選

2、擇性電極離子選擇性電極 藥物電極 酶電極 藥物膜電極 酶催化反應(yīng) 生物組織膜電極 生成產(chǎn)物不 微生物電極 同，電極種 免疫電極 類不同 免疫場效應(yīng)管 其他：極譜氧電極法 微電流電位法 生物傳感器技術(shù)5光譜分析法光譜分析法n比色法比色法 蛋白質(zhì) 雙縮脲反應(yīng) 硫酸軟骨素 Elson-Morgan比色法 按干燥品計算，測定氨基己糖含量 原理：酸性條件下水解 氨基己糖 堿性條件下與乙酰丙酮反應(yīng) 再與二甲氨基苯甲醛反應(yīng) 氨基葡萄糖（紅色） 以鹽酸葡萄糖溶液為對照，525nm測定A6計算: 氨基己糖的含量=AWs0.8309500AsW100式中 A供試品溶液吸收度平均值 As對照品溶液吸收度平均值 Ws

3、對照品溶液每1ml中含鹽酸氨基葡萄 糖的量（mg） 0.8309校正因數(shù)（氨基葡萄糖與鹽酸氨 基葡萄糖分子量的比值）7n紫外分光光度法紫外分光光度法 蛋白質(zhì) 280nm 糜蛋白酶與底物N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作用后產(chǎn)物 237nmn熒光分光光度法熒光分光光度法 反應(yīng)物或反應(yīng)激發(fā)產(chǎn)生熒光直接測定 應(yīng)用熒光試劑的熒光測定 應(yīng)用另一酶的催化反應(yīng)的熒光測定8酶法酶法 酶活力測定法酶活力測定法 酶分析法酶分析法 以酶為分析對象 以酶為分析工具或試劑 活力單位 比活性 酶以外其它物質(zhì)的含量 共同點： 以酶能專一而高效地催化某些反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過對酶反應(yīng)或生成物等濃度的測定而檢測相應(yīng)物質(zhì)的含量 9酶活力測定法

4、酶活力測定法n基本概念基本概念 酶活力 酶催化一定化學反應(yīng)的能力 活性單位（國際單位，IU） 任何一種酶，在25 以最適當?shù)牡孜餄舛取?最適當?shù)木彌_離子強度以及最適當?shù)膒H等 條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一微摩爾底物的酶量 比活性 每一毫克蛋白質(zhì)所含酶的單位數(shù) 分子活力 每微摩爾酶對最適底物的活性單位 每個酶分子每分鐘轉(zhuǎn)化底物的分子量10測定方法測定方法n物理法物理法 化學法化學法 酶分析法酶分析法n終點法終點法 動力學法（取樣測定法） 反應(yīng)速率法（連續(xù)測定法）11n取樣測定法取樣測定法 中止酶反應(yīng) 酶變性劑 5%三氯醋酸 3%高氯酸 酸 堿 醇n連續(xù)測定法連續(xù)測定法 在反應(yīng)過程中對反應(yīng)系統(tǒng)進行連續(xù)檢

5、測 準確性和測定效率都較取樣法更好12n檢測方法檢測方法 紫外可見分光光度法 氧化還原酶 脫氫輔酶NAD(P)H 340nm 細胞色素氧化酶底物細胞色素C 550nm 摩爾吸收系數(shù) 2.18104 氧化型 0.80104 熒光分光光度法 底物本身在酶反應(yīng)過程中有熒光變化 利用具有熒光底物 旋光度法 酶偶聯(lián)測定法 其他 電化學測定法 離子選擇性電極測定法 放射化學法13n舉例舉例 胰蛋白酶效價測定胰蛋白酶效價測定 胰蛋白酶能專一地作用于賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的羧基組成的肽鍵，酰氨鍵及酯鍵供試品溶液的配制 精密稱取本品適量 0.001mol/L鹽酸溶液溶解 制成50-60IU/ml胰蛋白酶溶液

6、14 底物溶液的配制 BAEE鹽酸鹽85.7mg 加水溶解使成100ml 精密量取10ml 磷酸緩沖液稀釋成100ml 25.0 0.5 ,253nm以水做空白，測定吸光度 A應(yīng)在0.5750.585之間為宜15測定 空白： 底物溶液3.0ml0.001mol/L鹽酸液0.2ml 供試品溶液 0.2ml與底物溶液3.0ml 立即計時并搖勻 253nm測定吸收度 每隔30s測一次，共5min 以A為縱坐標，時間為橫坐標作圖 每30s吸收度改變恒定在0.0150.018之間，呈線性關(guān)系不少于3min16計算 P=A1-A20.003TW式中P每1mg胰蛋白酶供試液中含胰蛋白酶 單位數(shù) A1直線上終

7、止的吸收度 A2直線上開始的吸收度 TA1至A2讀數(shù)的時間（min） W測定液中含供試品的mg數(shù) 0.003上述條件下，吸收度每改變0.003， 相當于1個胰蛋白酶單位17n影響效價測定的因素 酶濃度 最佳濃度 50IU/ml60IU/ml 溫度 溫度每升高1 活力單位增高5% 底物 底物溶液應(yīng)在配制后3h內(nèi)使用 關(guān)鍵在于判斷底物濃度S與Km的關(guān)系 pH值 H+能改變酶活性中心的解離狀況， 升高或降低酶的活性 空白和對照實驗18酶反應(yīng)進程曲線和酶濃度曲線酶反應(yīng)進程曲線和酶濃度曲線0123456051015反應(yīng)時間(min)產(chǎn)物00.10.20.30.40.50.60204060酶量反應(yīng)速度19

8、酶分析法酶分析法n動力學分析法動力學分析法酶的底物 當?shù)孜餄舛萐Km時，一級反應(yīng)性態(tài)輔酶 雙底物反應(yīng) 一類底物濃度足夠高 單底物反應(yīng)活化劑 注意：濃度超過一定水平后導致抑制 測定不專一，易受干擾抑制劑 不可逆抑制劑 濃度 抑制程度 線性 可逆抑制劑 低濃度范圍 濃度 抑制程度 20舉例舉例 抑肽酶的效價測定抑肽酶的效價測定底物溶液的制備 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽171.3mg 加水溶解并稀釋至25ml胰蛋白酶溶液的制備 胰蛋白酶對照品適量，精密稱定 加鹽酸滴定液（0.001 mol/L）制成每1ml 中約含0.8單位溶液（約每1ml中含1mg） 的溶液21胰蛋白酶稀釋溶液的制備 精密量

9、取上述胰蛋白酶溶液1ml 用硼砂-氯化鈣緩沖液（pH8.0）稀釋成20ml 室溫放置10分鐘，置冰浴中供試品溶液的制備 精密稱取本品適量 加硼砂-氯化鈣緩沖液制成每1ml中約含1.67單 位（約每1ml中含0.6mg）的溶液 精密量取0.5ml與胰蛋白酶溶液2ml 再用硼砂-氯化鈣緩沖液（pH8.0）稀釋成20ml 反應(yīng)10分鐘，置冰浴中（2小時內(nèi)使用） 22測定 供試品 硼砂-氯化鈣緩沖液9.0ml底物溶液1.0ml 250.5水浴35分鐘 滴加氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）調(diào)節(jié)pH8.0 精密加入供試品溶液1ml 用1ml微量滴定管以氫氧化鈉滴定液滴定 使溶液的pH值始終維持在7.98.1 每隔60秒讀取pH值恰為8.0 時所消耗的氫氧化 鈉滴定液的容積（ml），共6分鐘 對照品 精密量取胰蛋白酶稀釋液1ml，按上法操作23計算每1mg 抑肽酶的效價 (2n1n2)4000f 式中 4000為系數(shù) 為抑肽酶制成每1ml中約含1.67單位時的酶量 n1為對照測定時每秒消耗的NaOH滴定液容積 n2為供試品溶液每秒消耗NaOH滴定液容積 2為供試品溶液中所加入胰蛋白酶的量為