植物總DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1植物總植物總DNA的提取的提取(tq)及瓊脂糖凝膠電泳及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)檢測(cè)第一頁(yè)，共27頁(yè)。n脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸(h sun)(DNA)(h sun)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(h (h sun)(RNA) sun)(RNA) n與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白（與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白（DNPDNP）的形式存在。在）的形式存在。在制備核酸制備核酸(h sun)(h sun)時(shí)通常破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜來使核時(shí)通常破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜來使核蛋白釋放出來。蛋白釋放出來。n植物總植物總DNADNA包括細(xì)胞核包括細(xì)胞核DNADNA和細(xì)胞核外和細(xì)胞核外DNA,DNA,前者存在于前者存在于細(xì)

2、胞核內(nèi)，后者存在于細(xì)胞質(zhì)中有半自主性復(fù)制活性細(xì)胞核內(nèi)，后者存在于細(xì)胞質(zhì)中有半自主性復(fù)制活性的細(xì)胞器內(nèi)，例如線粒體的細(xì)胞器內(nèi)，例如線粒體DNA(mtDNA)DNA(mtDNA)和葉綠體和葉綠體DNA(ctDNA)DNA(ctDNA)。背景背景(bijng)知識(shí)知識(shí)核酸的存在核酸的存在(cnzi)形式形式第1頁(yè)/共27頁(yè)第二頁(yè)，共27頁(yè)。nDNADNA為白色類似石棉樣的纖維狀物為白色類似石棉樣的纖維狀物(zhun w)(zhun w)， RNA RNA的純品呈白色粉末或結(jié)晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。的純品呈白色粉末或結(jié)晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。 nDNADNA、RNARNA和核苷酸都是極性化合物

3、，一般都溶于水，和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。溶于水。n在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。穩(wěn)定。 核酸核酸(h sun)(h sun)的理化的理化性質(zhì)性質(zhì)第2頁(yè)/共27頁(yè)第三頁(yè)，共27頁(yè)。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)破碎破碎 抽提去蛋白質(zhì)抽提去蛋白質(zhì) 沉沉淀核酸淀核酸基本基本(jbn)過過程程第3頁(yè)/共27頁(yè)第四頁(yè)，共27頁(yè)。 機(jī)械方法：機(jī)械方法： 超聲波處理法、研磨法、勻漿法；超聲波處理法、研磨法、勻漿法； 化學(xué)試劑法

4、：用化學(xué)試劑法：用SDSSDS處理細(xì)胞處理細(xì)胞(xbo)(xbo)； 酶解法：酶解法： 加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細(xì)胞加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細(xì)胞(xbo)(xbo)壁。壁。 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)破碎破碎 第4頁(yè)/共27頁(yè)第五頁(yè)，共27頁(yè)。u SDSSDS法法 SDS SDS是有效是有效(yuxio)(yuxio)的陰離子去垢劑的陰離子去垢劑, , 細(xì)胞細(xì)胞中中DNADNA與蛋白質(zhì)之間與蛋白質(zhì)之間 常借靜電引力或配位鍵結(jié)合常借靜電引力或配位鍵結(jié)合, , SDSSDS能夠破壞這種價(jià)鍵。能夠破壞這種價(jià)鍵。u CTABCTAB法法 CTAB CTAB是一種陽(yáng)離子去垢劑，它可以溶解膜是一種陽(yáng)離子

5、去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細(xì)胞中的與脂膜，使細(xì)胞中的DNA-DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來，蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來，并使蛋白質(zhì)變性，使并使蛋白質(zhì)變性，使DNADNA與蛋白質(zhì)分離。與蛋白質(zhì)分離。DNADNA提取提取(tq)(tq)第5頁(yè)/共27頁(yè)第六頁(yè)，共27頁(yè)。u蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 常用苯酚：氯仿：異戊醇（常用苯酚：氯仿：異戊醇（2525：2424：1 1）或）或氯仿：異戊醇（氯仿：異戊醇（2424：1 1）抽提。）抽提。uRNA RNA 常選用常選用RNaseRNase消化消化 ，或是用，或是用LiClLiCl來消除大分子來消除大分子的的RNARNA。u酚類物質(zhì)酚類物質(zhì) 提取液中加少量巰基乙醇，選

6、取幼嫩提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩(yu (yu nn)nn)的材料。的材料。u多糖多糖 提取液中加提取液中加1 1PVPPVP。DNADNA純化純化(chn hu)(chn hu)（去雜質(zhì)）（去雜質(zhì)）第6頁(yè)/共27頁(yè)第七頁(yè)，共27頁(yè)。實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 新鮮蔬菜葉片新鮮蔬菜葉片(ypin)(ypin)(去葉去葉脈脈) )試劑試劑 2 2CTABCTAB抽提液抽提液 TE TE 緩沖液緩沖液(pH=8.0) (pH=8.0) 氯仿：異戊醇氯仿：異戊醇(24:1)(24:1) 材料材料(cilio)與試劑與試劑第7頁(yè)/共27頁(yè)第八頁(yè)，共27頁(yè)。離心機(jī)離心機(jī) 水浴鍋水浴鍋研缽研缽(yn b) (

7、yn b) 微量移液器微量移液器儀器儀器(yq)用具用具第8頁(yè)/共27頁(yè)第九頁(yè)，共27頁(yè)。移液器量程移液器量程(lingchng)的選擇的選擇第9頁(yè)/共27頁(yè)第十頁(yè)，共27頁(yè)。1取取 2g 清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加 1/3 藥匙石英砂和藥匙石英砂和 4mL 2 倍的倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。提取液，迅速研磨。2將將 1mL 研磨液轉(zhuǎn)入研磨液轉(zhuǎn)入 1.5mL 離心管中，置于離心管中，置于65水浴中保溫水浴中保溫 20min，其，其間顛倒混勻間顛倒混勻23次。破碎細(xì)胞次。破碎細(xì)胞(xbo)3. 12000r/min 離心離心 5min，取上清液，取上清液

8、700L轉(zhuǎn)到另一離心管中。加入等體轉(zhuǎn)到另一離心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（積氯仿：異戊醇（24:1）混合液，充分顛倒混勻。）混合液，充分顛倒混勻。12000r/min，離心，離心 5min。抽提去蛋白。抽提去蛋白4將上清液移入新的將上清液移入新的1.5mL離心管內(nèi)，加離心管內(nèi)，加 600L異丙醇。顛倒混勻，可見異丙醇。顛倒混勻，可見 DNA 絮狀沉淀。沉淀核酸絮狀沉淀。沉淀核酸512000r/min，離心，離心 1min，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。 將沉淀回將沉淀回溶于溶于20L TE 緩沖液待測(cè)。緩沖液待測(cè)。操作步驟操作步驟第10頁(yè)/共27頁(yè)第十一頁(yè)，共

9、27頁(yè)。1)選取新鮮材料，研磨迅速?gòu)氐?，研磨好的材料?yīng)與選取新鮮材料，研磨迅速?gòu)氐?，研磨好的材料?yīng)與 CTAB 抽提液充抽提液充分混勻；分混勻；2)若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰基乙醇（基乙醇（25），盡可能選取幼嫩的材料；），盡可能選取幼嫩的材料；3）收集）收集 CTAB 與核酸形成的復(fù)合物時(shí)不要離心過度，否則沉淀再溶與核酸形成的復(fù)合物時(shí)不要離心過度，否則沉淀再溶解難；解難；4）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫和的條件，避

10、免過酸過堿、劇烈地?cái)嚢韬偷臈l件，避免過酸過堿、劇烈地?cái)嚢?jiobn)，防止熱變性，防止熱變性，同時(shí)還要避免核酸降解酶類的降解。同時(shí)還要避免核酸降解酶類的降解。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)第11頁(yè)/共27頁(yè)第十二頁(yè)，共27頁(yè)。電泳電泳(din yn)原理原理第12頁(yè)/共27頁(yè)第十三頁(yè)，共27頁(yè)。第13頁(yè)/共27頁(yè)第十四頁(yè)，共27頁(yè)。儀器儀器(yq)和試劑和試劑儀器儀器(yq)電泳儀電泳儀電泳槽電泳槽灌膠模具等灌膠模具等第14頁(yè)/共27頁(yè)第十五頁(yè)，共27頁(yè)。Tris-硼酸（硼酸（TBE） Tris-乙酸乙酸(y sun)（TAE） Tris-磷酸（磷酸（TPE）常用常用(chn yn)(chn yn)電泳緩

11、沖液電泳緩沖液 第15頁(yè)/共27頁(yè)第十六頁(yè)，共27頁(yè)。上樣緩沖液上樣緩沖液第16頁(yè)/共27頁(yè)第十七頁(yè)，共27頁(yè)。核酸核酸(h sun)染色劑染色劑注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：EBEB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸(jich)(jich)，更不要污染環(huán)境。，更不要污染環(huán)境。第17頁(yè)/共27頁(yè)第十八頁(yè)，共27頁(yè)。DNADNA分子量標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)(biozhn)第18頁(yè)/共27頁(yè)第十九頁(yè)，共27頁(yè)。不同不同(b tn)種類種類DNA Marker第19頁(yè)/共27頁(yè)第二十頁(yè)，共27頁(yè)。1.1.凝膠制備凝膠制備 制備制備0.8%0.8%瓊脂糖凝膠。稱取適量瓊脂糖加入瓊脂糖凝膠。

12、稱取適量瓊脂糖加入 20mL 0.520mL 0.5TBETBE，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至50-60 50-60 時(shí)，加入時(shí)，加入 EB EB 至終濃度至終濃度 0.5 0.5g/mLg/mL。緩慢倒入膠板，待膠凝。緩慢倒入膠板，待膠凝固后拔出梳子。固后拔出梳子。2.2.加樣加樣 取取1010l DNAl DNA樣液與樣液與 2 2l l 上樣上樣 buffeer buffeer 混勻，用微混勻，用微量移液器小心加入樣品槽。量移液器小心加入樣品槽。3.3.電泳電泳 接通接通(ji tn)(ji tn)電源，切記靠近加樣孔的一端為負(fù)電源，切記靠近加樣孔的一端為負(fù)，電壓為，電壓為15V/cm15V/cm（長(zhǎng)度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算）（長(zhǎng)度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算）, ,待溴待溴酚蘭移動(dòng)到一定位置，停止電泳。酚蘭移動(dòng)到一定位置，停止電泳。4.4.觀察拍照觀察拍照四、操作步驟四、操作步驟第20頁(yè)/共27頁(yè)第二十一頁(yè)，共27頁(yè)。第21頁(yè)/共27頁(yè)第二十二頁(yè)，共27頁(yè)。第22頁(yè)/共27頁(yè)第二十三頁(yè)，共27頁(yè)。第23頁(yè)/共27頁(yè)第二十四頁(yè)，共27頁(yè)。第24頁(yè)/共27頁(yè)第二十五頁(yè)，共27頁(yè)。紫外儀上觀察電泳帶及其位置紫外儀上觀察電泳帶及其位置(wi zhi)(wi zhi)。繪制核酸電泳示意圖。繪制核酸電泳示意圖。 作業(yè)(zuy)第25頁(yè)/共27頁(yè)第二十六頁(yè)