植物總DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1植物總植物總DNA的提取的提取(tq)及瓊脂糖凝膠電泳及瓊脂糖凝膠電泳檢測檢測第一頁，共27頁。n脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸(h sun)(DNA)(h sun)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(h (h sun)(RNA) sun)(RNA) n與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白（與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白（DNPDNP）的形式存在。在）的形式存在。在制備核酸制備核酸(h sun)(h sun)時通常破壞細胞壁及細胞膜來使核時通常破壞細胞壁及細胞膜來使核蛋白釋放出來。蛋白釋放出來。n植物總植物總DNADNA包括細胞核包括細胞核DNADNA和細胞核外和細胞核外DNA,DNA,前者存在于前者存在于細

2、胞核內(nèi)，后者存在于細胞質(zhì)中有半自主性復(fù)制活性細胞核內(nèi)，后者存在于細胞質(zhì)中有半自主性復(fù)制活性的細胞器內(nèi)，例如線粒體的細胞器內(nèi)，例如線粒體DNA(mtDNA)DNA(mtDNA)和葉綠體和葉綠體DNA(ctDNA)DNA(ctDNA)。背景背景(bijng)知識知識核酸的存在核酸的存在(cnzi)形式形式第1頁/共27頁第二頁，共27頁。nDNADNA為白色類似石棉樣的纖維狀物為白色類似石棉樣的纖維狀物(zhun w)(zhun w)， RNA RNA的純品呈白色粉末或結(jié)晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。的純品呈白色粉末或結(jié)晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。 nDNADNA、RNARNA和核苷酸都是極性化合物

3、，一般都溶于水，和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。溶于水。n在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。穩(wěn)定。 核酸核酸(h sun)(h sun)的理化的理化性質(zhì)性質(zhì)第2頁/共27頁第三頁，共27頁。細胞細胞(xbo)(xbo)破碎破碎 抽提去蛋白質(zhì)抽提去蛋白質(zhì) 沉沉淀核酸淀核酸基本基本(jbn)過過程程第3頁/共27頁第四頁，共27頁。 機械方法：機械方法： 超聲波處理法、研磨法、勻漿法；超聲波處理法、研磨法、勻漿法； 化學(xué)試劑法

4、：用化學(xué)試劑法：用SDSSDS處理細胞處理細胞(xbo)(xbo)； 酶解法：酶解法： 加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細胞加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細胞(xbo)(xbo)壁。壁。 細胞細胞(xbo)(xbo)破碎破碎 第4頁/共27頁第五頁，共27頁。u SDSSDS法法 SDS SDS是有效是有效(yuxio)(yuxio)的陰離子去垢劑的陰離子去垢劑, , 細胞細胞中中DNADNA與蛋白質(zhì)之間與蛋白質(zhì)之間 常借靜電引力或配位鍵結(jié)合常借靜電引力或配位鍵結(jié)合, , SDSSDS能夠破壞這種價鍵。能夠破壞這種價鍵。u CTABCTAB法法 CTAB CTAB是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜是一種陽離子

5、去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細胞中的與脂膜，使細胞中的DNA-DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來，蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來，并使蛋白質(zhì)變性，使并使蛋白質(zhì)變性，使DNADNA與蛋白質(zhì)分離。與蛋白質(zhì)分離。DNADNA提取提取(tq)(tq)第5頁/共27頁第六頁，共27頁。u蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 常用苯酚：氯仿：異戊醇（常用苯酚：氯仿：異戊醇（2525：2424：1 1）或）或氯仿：異戊醇（氯仿：異戊醇（2424：1 1）抽提。）抽提。uRNA RNA 常選用常選用RNaseRNase消化消化 ，或是用，或是用LiClLiCl來消除大分子來消除大分子的的RNARNA。u酚類物質(zhì)酚類物質(zhì) 提取液中加少量巰基乙醇，選

6、取幼嫩提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩(yu (yu nn)nn)的材料。的材料。u多糖多糖 提取液中加提取液中加1 1PVPPVP。DNADNA純化純化(chn hu)(chn hu)（去雜質(zhì)）（去雜質(zhì)）第6頁/共27頁第七頁，共27頁。實驗材料實驗材料 新鮮蔬菜葉片新鮮蔬菜葉片(ypin)(ypin)(去葉去葉脈脈) )試劑試劑 2 2CTABCTAB抽提液抽提液 TE TE 緩沖液緩沖液(pH=8.0) (pH=8.0) 氯仿：異戊醇氯仿：異戊醇(24:1)(24:1) 材料材料(cilio)與試劑與試劑第7頁/共27頁第八頁，共27頁。離心機離心機 水浴鍋水浴鍋研缽研缽(yn b) (

7、yn b) 微量移液器微量移液器儀器儀器(yq)用具用具第8頁/共27頁第九頁，共27頁。移液器量程移液器量程(lingchng)的選擇的選擇第9頁/共27頁第十頁，共27頁。1取取 2g 清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加 1/3 藥匙石英砂和藥匙石英砂和 4mL 2 倍的倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。提取液，迅速研磨。2將將 1mL 研磨液轉(zhuǎn)入研磨液轉(zhuǎn)入 1.5mL 離心管中，置于離心管中，置于65水浴中保溫水浴中保溫 20min，其，其間顛倒混勻間顛倒混勻23次。破碎細胞次。破碎細胞(xbo)3. 12000r/min 離心離心 5min，取上清液，取上清液

8、700L轉(zhuǎn)到另一離心管中。加入等體轉(zhuǎn)到另一離心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（積氯仿：異戊醇（24:1）混合液，充分顛倒混勻。）混合液，充分顛倒混勻。12000r/min，離心，離心 5min。抽提去蛋白。抽提去蛋白4將上清液移入新的將上清液移入新的1.5mL離心管內(nèi)，加離心管內(nèi)，加 600L異丙醇。顛倒混勻，可見異丙醇。顛倒混勻，可見 DNA 絮狀沉淀。沉淀核酸絮狀沉淀。沉淀核酸512000r/min，離心，離心 1min，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。 將沉淀回將沉淀回溶于溶于20L TE 緩沖液待測。緩沖液待測。操作步驟操作步驟第10頁/共27頁第十一頁，共

9、27頁。1)選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應(yīng)與選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應(yīng)與 CTAB 抽提液充抽提液充分混勻；分混勻；2)若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰基乙醇（基乙醇（25），盡可能選取幼嫩的材料；），盡可能選取幼嫩的材料；3）收集）收集 CTAB 與核酸形成的復(fù)合物時不要離心過度，否則沉淀再溶與核酸形成的復(fù)合物時不要離心過度，否則沉淀再溶解難；解難；4）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫和的條件，避

10、免過酸過堿、劇烈地攪拌和的條件，避免過酸過堿、劇烈地攪拌(jiobn)，防止熱變性，防止熱變性，同時還要避免核酸降解酶類的降解。同時還要避免核酸降解酶類的降解。注意事項注意事項第11頁/共27頁第十二頁，共27頁。電泳電泳(din yn)原理原理第12頁/共27頁第十三頁，共27頁。第13頁/共27頁第十四頁，共27頁。儀器儀器(yq)和試劑和試劑儀器儀器(yq)電泳儀電泳儀電泳槽電泳槽灌膠模具等灌膠模具等第14頁/共27頁第十五頁，共27頁。Tris-硼酸（硼酸（TBE） Tris-乙酸乙酸(y sun)（TAE） Tris-磷酸（磷酸（TPE）常用常用(chn yn)(chn yn)電泳緩

11、沖液電泳緩沖液 第15頁/共27頁第十六頁，共27頁。上樣緩沖液上樣緩沖液第16頁/共27頁第十七頁，共27頁。核酸核酸(h sun)染色劑染色劑注意事項：注意事項：EBEB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸(jich)(jich)，更不要污染環(huán)境。，更不要污染環(huán)境。第17頁/共27頁第十八頁，共27頁。DNADNA分子量標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)(biozhn)第18頁/共27頁第十九頁，共27頁。不同不同(b tn)種類種類DNA Marker第19頁/共27頁第二十頁，共27頁。1.1.凝膠制備凝膠制備 制備制備0.8%0.8%瓊脂糖凝膠。稱取適量瓊脂糖加入瓊脂糖凝膠。

12、稱取適量瓊脂糖加入 20mL 0.520mL 0.5TBETBE，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至50-60 50-60 時，加入時，加入 EB EB 至終濃度至終濃度 0.5 0.5g/mLg/mL。緩慢倒入膠板，待膠凝。緩慢倒入膠板，待膠凝固后拔出梳子。固后拔出梳子。2.2.加樣加樣 取取1010l DNAl DNA樣液與樣液與 2 2l l 上樣上樣 buffeer buffeer 混勻，用微混勻，用微量移液器小心加入樣品槽。量移液器小心加入樣品槽。3.3.電泳電泳 接通接通(ji tn)(ji tn)電源，切記靠近加樣孔的一端為負電源，切記靠近加樣孔的一端為負，電壓為，電壓為15V/cm15V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算）（長度以兩個電極之間的距離計算）, ,待溴待溴酚蘭移動到一定位置，停止電泳。酚蘭移動到一定位置，停止電泳。4.4.觀察拍照觀察拍照四、操作步驟四、操作步驟第20頁/共27頁第二十一頁，共27頁。第21頁/共27頁第二十二頁，共27頁。第22頁/共27頁第二十三頁，共27頁。第23頁/共27頁第二十四頁，共27頁。第24頁/共27頁第二十五頁，共27頁。紫外儀上觀察電泳帶及其位置紫外儀上觀察電泳帶及其位置(wi zhi)(wi zhi)。繪制核酸電泳示意圖。繪制核酸電泳示意圖。 作業(yè)(zuy)第25頁/共27頁第二十六頁