醫(yī)藥生物技術(shù)

1、會(huì)計(jì)學(xué)1醫(yī)藥生物技術(shù)醫(yī)藥生物技術(shù)從西伯利亞永久凍結(jié)帶發(fā)現(xiàn)的兩具猛犸象殘骸上獲取的DNA。在這兩具猛犸象尸體中，一具已在地下埋了2萬年，另一具則至少埋了6萬年。通過仔細(xì)分析它們的DNA，研究小組已經(jīng)整理出80%的猛犸象基因組或遺傳密碼。 第一代-免疫血清免疫血清大多數(shù)抗原分子具有多個(gè)表位，每種表位均可刺激機(jī)體1個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生1種特異性抗體。因此，傳統(tǒng)制備的免疫血清被稱為多克隆抗體，特異性差，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，限制了在免疫化學(xué)試驗(yàn)以及疾病診斷和治療中的應(yīng)用。第二代-單克隆抗體單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的問世使產(chǎn)生僅識(shí)別1種表位的同源抗體成為可能，稱為單克隆抗體（mono-clonal antibody,

2、 McAb）。McAb具有特異性高、親和力強(qiáng)、效價(jià)高、血清交叉反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，與化學(xué)藥物、毒素或同位素等連接后，借助識(shí)別特異性，可有效地將治療性藥物運(yùn)送到靶細(xì)胞，這種稱為“魔彈”或“生物導(dǎo)彈”的導(dǎo)向藥物療法以為攻克癌癥帶來了希望。第三代-基因工程抗體基因工程抗體第三代抗體始于20世紀(jì)80年代中期，它是利用重組DNA和蛋白蛋工程技術(shù)，對抗體基因進(jìn)行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞所表達(dá)的抗體分子。其主要工作包括：一是一是運(yùn)用運(yùn)用DNA重組技術(shù)對已有的重組技術(shù)對已有的McAb進(jìn)行進(jìn)行“人源化人源化”和和“小型化小型化”的的改造；改造；二是二是用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選、克隆新的用噬菌體抗體庫技術(shù)

3、篩選、克隆新的McAb。免疫球蛋白（IgG）分子是腫瘤治療最常用的抗體。由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成，每條包含可變區(qū)和恒定區(qū)。可變區(qū)包含高變區(qū)或稱互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs）。這些短的，高度可變的氨基酸序列是試劑的主要作用位點(diǎn)。小分子抗體：小分子抗體：Ig可以被酶解為不同的片段，如F(ab)2、Fab和Fc含重鏈、輕鏈V區(qū)的Fv片段。這些小片段因相對分子質(zhì)量小、穿透力強(qiáng)、抗原性低、可在原核系統(tǒng)表達(dá)，以及易于進(jìn)行基因工程操作等優(yōu)點(diǎn)而逐漸受到重視。多肽藥物基因藥物產(chǎn)物多肽蛋白質(zhì)基因質(zhì)粒原核表達(dá)載體無信號(hào)肽真核表達(dá)載體信號(hào)肽宿主細(xì)胞大腸桿菌酵母（體外）人體細(xì)胞（體內(nèi)）轉(zhuǎn)染易難生產(chǎn)工藝復(fù)雜較簡單純化

4、復(fù)雜較簡單成本較昂貴較經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定性不穩(wěn)定穩(wěn)定保存難易半衰期短長用法長期注射一次性注射療效短持久副作用高低多肽藥物與基因藥物的比較多肽藥物與基因藥物的比較 傳統(tǒng)疫苗傳統(tǒng)疫苗高技術(shù)疫苗高技術(shù)疫苗減毒活疫苗減毒活疫苗滅活疫苗滅活疫苗亞單位疫苗亞單位疫苗核酸疫苗核酸疫苗重組疫苗重組疫苗基因工程疫苗基因工程疫苗微膠囊可控緩釋疫苗微膠囊可控緩釋疫苗抗獨(dú)特型抗體疫苗抗獨(dú)特型抗體疫苗基因工程亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗基因缺失活疫苗基因缺失活疫苗基因工程載體疫苗基因工程載體疫苗合成肽疫苗合成肽疫苗蛋白質(zhì)工程疫苗蛋白質(zhì)工程疫苗已用于人類疾病預(yù)防的主要疫苗已用于人類疾病預(yù)防的主要疫苗 疫苗類型國內(nèi)外生產(chǎn)狀況國內(nèi)國外

5、1小兒麻痹（OPV）減毒活疫苗（I-型聯(lián)合）+小兒麻痹（IVP）滅活疫苗（I-）-+2麻疹減毒活疫苗+3卡介苗（BCG）減毒活疫苗+4白喉-百日咳-破傷風(fēng)（DPT）亞單位疫苗（聯(lián)合）-+亞單位疫苗（基因工程P）+5乙型肝炎亞單位疫苗（血源）+亞單位疫苗（基因工程CHO）+（S）+（S2）亞單位疫苗（基因工程酵母）+）+6乙腦減毒活疫苗+-滅活疫苗+7流腦亞單位疫苗（多糖）+8甲肝減毒活疫苗+流感滅活疫苗10狂犬滅活疫苗+11風(fēng)疹減毒活疫苗+12腮腺炎減毒活疫苗+麻疹-風(fēng)疹-腮腺炎（MMR）減毒活疫苗（三種聯(lián)合）-+13出血熱滅活疫苗+14腺病毒（Ad4,Ad7）減毒活疫苗-+15水痘減毒活疫苗

6、-+16黃熱病減毒活疫苗+17輪狀病毒腹瀉減毒活疫苗（人-猴遺傳重配）-+減毒活疫苗（人-羊遺傳重配）+-20霍亂亞單位+滅活（CTB+WC）-亞單位+滅活（基因工程CTB+WC）減毒活疫苗（基因工程CDV-HgR）-+21鼠疫減毒活疫苗+22斑疹傷寒滅活疫苗+23布氏桿菌減毒活疫苗+24炭疽桿菌減毒活疫苗+25痢疾減毒活疫苗（基因工程FS）+-26鏈球菌肺炎亞單位疫苗（多糖）-+27嗜血桿菌流感亞單位疫苗（多糖）-+28痘苗（天花）減毒活疫苗+*+*基困工程亞單位疫苗基困工程亞單位疫苗（gene engineered subunit vaccine）主要是指將基因工程表達(dá)的蛋白抗原純化后制成

7、的疫苗。載體疫苗載體疫苗（vectored vaccine）是指利用微生物做載體，將保護(hù)性抗原基因重組到微生物體中，由能表達(dá)保護(hù)性抗原蛋白質(zhì)的重組微生物制成的疫苗。這種疫苗多為活疫苗，重組體用量少，抗原不需純化，免疫接種后靠重組體在機(jī)體內(nèi)繁殖產(chǎn)生大量保護(hù)性抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生特異免疫保護(hù)反應(yīng)，載體本身可發(fā)揮佐劑效應(yīng)增強(qiáng)免疫效果。DNA疫苗（疫苗（ DNA vaccine）基因缺失活疫苗（基因缺失活疫苗（gene deleted live vaccine）是最有效的一種疫苗，應(yīng)用傳統(tǒng)的活疫苗如痘苗已經(jīng)消滅了天花，應(yīng)用脊髓灰質(zhì)炎活疫苗正在全世界消滅脊髓灰質(zhì)炎（小兒麻痹）。蛋白工程疫苗（蛋白工程疫苗（p

8、rotein engineered vaccine）是指將抗原基因加以改造，使之發(fā)生點(diǎn)突變、插入、缺失、構(gòu)型改變，甚至進(jìn)行不同基因或部分結(jié)構(gòu)域的人工組合，以期達(dá)到增強(qiáng)其產(chǎn)物的免疫原性，擴(kuò)大反應(yīng)譜，去除有害作用或付反應(yīng)的一類疫苗。遺傳重組疫苗（遺傳重組疫苗（genetic recombinant vaccine）是指使用經(jīng)遺傳重組方法（genetic reassortment）獲得的重組微生物制成的疫苗。合成肽疫苗（合成肽疫苗（Synthetic peptide vaccine）是指使用化學(xué)方法合成能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)的多肽制成的疫苗。抗獨(dú)特型抗體疫苗（抗獨(dú)特型抗體疫苗（anti-idiot

9、ype vaccine）是指使用與特定抗原的免疫原性相近的抗抗體（ab2）做抗原制成的疫苗。微膠囊疫苗（微膠囊疫苗（micro-capsulized vaccine）也稱可控緩釋疫苗（controlled slow release vaccine），是指使用微膠囊技術(shù)將特定抗原包裹后制成的疫苗。DNA疫苗疫苗DNA用疫苗的優(yōu)越性與問題用疫苗的優(yōu)越性與問題急需研制的基因工程病毒疫苗及急需研制的基因工程病毒疫苗及研究進(jìn)展研究進(jìn)展1.艾滋病（AIDS）疫苗：多抗原疫苗設(shè)計(jì)2.乙肝（HBV）疫苗：含前S抗原的疫苗新佐劑3.丙肝（HCV）疫苗：4.戊肝（HEV）疫苗：5.呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗：品

10、名 來源適應(yīng)證蛇毒纖溶酶蛇毒血栓尿激酶人尿心肌梗死促皮質(zhì)毒腦垂體關(guān)節(jié)炎胰酶動(dòng)物胰臟消化不良硫酸軟骨素動(dòng)物軟骨偏頭痛、關(guān)節(jié)炎絨促性素孕婦尿不孕豬胰島素豬胰臟糖尿病熊膽粉熊膽汁肝膽疾患小檗堿黃連根莖感染銀杏黃酮銀杏葉血管硬化L-麻黃堿麻黃草哮喘、過敏喜樹堿喜樹腫瘤麥角堿麥角菌偏頭痛剌烏頭堿高烏頭疼痛奎寧金雞納樹皮瘧疾利血平蘿夫木高血壓延胡索乙素延胡索疼痛長春堿常春花腫瘤青蒿素黃花蒿瘧疾齊墩果酸齊墩果，女貞子黃疸性肝炎黃芩甙黃芩慢性肝炎地高辛毛花洋地黃心力衰竭靛玉紅木蘭腫瘤左旋多巴油麻藤帕金森病紫杉醇紫杉樹皮腫瘤部分生物物藥來源及其適應(yīng)證部分生物物藥來源及其適應(yīng)證 合成或以天然結(jié)構(gòu)為先導(dǎo)物合成的天然

11、藥物合成或以天然結(jié)構(gòu)為先導(dǎo)物合成的天然藥物 品名天然先導(dǎo)物作用阿司匹林水楊苷解熱、鎮(zhèn)痛色甘酸鈉凱琳抗過敏甲紅霉素紅霉素抗感染蒿甲醚青蒿素抗瘧疾普魯卡因可卡因局麻十烴雙胺d-筒箭毒堿肌肉松弛右甲嗎南嗎啡鎮(zhèn)痛特尼泊苷鬼臼毒素抗癌依托泊苷鬼臼毒素抗癌華法林雙香豆素抗凝血多西環(huán)素四環(huán)素抗感染多馬托品阿托品擴(kuò)瞳溴化甲基東茛菪堿東茛菪堿解痙氟氧頭孢菌素氧頭孢烯抗感染氨曲南單環(huán)-內(nèi)酰胺抗感染亞胺培南-內(nèi)酰胺抗感染米帕林奎寧抗瘧疾紫杉醇10-去乙酰巴可亭抗癌米格列醇脫氧野尻霉素降血糖藥薯喜樹堿抗直腸癌乙胺香豆素凱琳擴(kuò)張冠脈ii. 藥用植物與海洋生物資源成為開發(fā)的熱點(diǎn)藥用植物與海洋生物資源成為開發(fā)的熱點(diǎn)天然藥物

12、來源途徑甚多，不過今后將主要來源于藥用植物，據(jù)估計(jì)全球約有（4050）萬種植物，但僅有極少部分進(jìn)行過化學(xué)成分及其活性測試研究。海洋生物更是一個(gè)有待開發(fā)的寶庫我國也是植物資源最豐富的國家之一，迄今已發(fā)現(xiàn)3萬多種高植物，其數(shù)量僅次于巴西和哥倫比亞，居世界第3位，其中50%以上是特有品種，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)11000多種藥植物，其種類和數(shù)量之大均居世界首位，為我國研制新的天然藥物奠定的良好的資源基礎(chǔ)。天然藥物發(fā)展現(xiàn)狀與前景天然藥物發(fā)展現(xiàn)狀與前景i.天然藥物的開發(fā)成為新藥研發(fā)的重要策略天然藥物的開發(fā)成為新藥研發(fā)的重要策略獲取先導(dǎo)化合物；縮短研發(fā)周期；提高成功率iii.天然藥物發(fā)展前景廣闊天然藥物發(fā)展前景廣闊 1

13、.近近10多年來天然藥物研究與開發(fā)取得長足進(jìn)展多年來天然藥物研究與開發(fā)取得長足進(jìn)展 如免疫抑制藥環(huán)孢素、抗糖尿病新藥阿卡波糖和降血脂新藥洛伐他汀及其類似物等相繼面市。鎮(zhèn)痛藥河豚毒素及貝類毒素等海洋藥物也取得了良好的進(jìn)展。美國還從非洲真菌“偽黑團(tuán)殼”中分離出一種五環(huán)化合物，口服有胰島素樣作用。此外正在研制的卡麥角林（cabegoline）是麥角生物堿的類似物，為多巴胺D2的受體激動(dòng)藥，選擇性強(qiáng)，藥效持久，有望成為治療帕金森病的有效藥物。可直接殺傷腫瘤細(xì)胞和具有免疫調(diào)節(jié)作用的苦馬豆素也進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。其次具有防治腫瘤作用的番荔枝內(nèi)酯及白藜蘆醇的研究也引起了國內(nèi)外醫(yī)藥界的關(guān)注。19891995年F

14、DA批準(zhǔn)臨床使用的87種抗癌藥中，62%為天然產(chǎn)物。50多年來，我國以中草藥為源料也開發(fā)出了40多種特有新藥，如黃連素、四氫巴馬汀、東茛菪堿、丁公藤堿、茛菪堿、樟柳堿、石杉?jí)A甲、芫花酯甲、靛玉紅、天麻素、豆腐果苷、草烏甲素、蒿甲醚及丹參酮A等。2.各國政府開始放松對中藥制品的管制各國政府開始放松對中藥制品的管制 美國已開始對中藥復(fù)方與制劑的臨床試驗(yàn)， 2001年版美國藥典已正式收載銀杏、月見草油、卡瓦內(nèi)脂、金絲桃素、人參、鋸齒棕、雪花蓮及-葉皂苷等20多種暢銷的藥材及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，表明藥用植物及天然藥物已被美國官方認(rèn)可，德國則打算將中藥列入傳統(tǒng)療法范疇，俄國、瑞士等國看好中藥，東南亞等國早

15、已把中藥列入家庭必備之藥品。中藥真正走向世界當(dāng)不會(huì)太久。中藥發(fā)展的現(xiàn)代化戰(zhàn)略中藥發(fā)展的現(xiàn)代化戰(zhàn)略I.我國中藥發(fā)展的機(jī)遇與挑戰(zhàn)我國中藥發(fā)展的機(jī)遇與挑戰(zhàn) 我國藥用植物及中藥材種類繁多，新版中藥大辭典將收載12807種中藥材，其中藥用植物11146種，動(dòng)物1581種，礦物80種。此外其他民族地區(qū)尚有藏藥2294種，蒙藥1342種，傣藥1200種，苗藥1000種，維藥600種，彝藥及羌藥各百余種。目前人工種植的藥材200余種，600余萬畝，生產(chǎn)基地600多個(gè)，對具有藥用作用的野生動(dòng)物也進(jìn)行了人工飼養(yǎng)。 我國的中藥藥效不夠準(zhǔn)確、穩(wěn)定、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、重金屬在藥理、劑型、標(biāo)準(zhǔn)化等方面尚有很多問題：中藥制品落后的

16、外包裝，攜帶不便，藥汁味苦，這些都影響我國的中藥出口。n分子診斷分子診斷是采用分子生物學(xué)理論和方是采用分子生物學(xué)理論和方法對疾病進(jìn)行預(yù)測、鑒定和分析的技術(shù)法對疾病進(jìn)行預(yù)測、鑒定和分析的技術(shù)。n分子診斷的作用分子診斷的作用：產(chǎn)前檢測；產(chǎn)前檢測；潛病檢測；潛病檢測；先病檢測；先病檢測；病因的臨床檢測。病因的臨床檢測。 7.3.2 分子診斷方法分子診斷方法i. 酶聯(lián)免疫吸附測定酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA )利用抗原抗體分子高度特異結(jié)合而測定疾病相利用抗原抗體分子高度特異結(jié)合而測定疾病相關(guān)因子的診斷方法。關(guān)因子的診斷方法。一抗：與

17、目標(biāo)分子特異結(jié)合的抗體一抗：與目標(biāo)分子特異結(jié)合的抗體二抗：只與一抗特異結(jié)合的抗體，如：堿性磷二抗：只與一抗特異結(jié)合的抗體，如：堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲每等，可以催化無色底物酸酶、過氧化物酶、脲每等，可以催化無色底物變?yōu)橛猩铩Ｗ優(yōu)橛猩?。加入無色底物加入無色底物有色底物有色底物加入酶聯(lián)加入酶聯(lián)二抗二抗加入一抗加入一抗固定目標(biāo)分子固定目標(biāo)分子酶聯(lián)免疫吸附測定示意圖酶聯(lián)免疫吸附測定示意圖ii. 分子雜交分子雜交 利用遺傳疾病或致病微生物特異的核利用遺傳疾病或致病微生物特異的核酸序列設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行疾病的診斷。酸序列設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行疾病的診斷。Southern雜交，分子標(biāo)記等。雜交，分子標(biāo)記等。原位雜

18、交原位雜交(in situ hybridization)FISH: (Fluorescent In Situ Hybridization) iii. 基于基于PCR的分子診斷的分子診斷1) 套式套式PCR（nested PCR）病原微生物的病原微生物的檢測檢測2) 原位原位PCR (in situ PCR ) ：在細(xì)胞組織切在細(xì)胞組織切片上檢測低拷貝數(shù)基因片上檢測低拷貝數(shù)基因3) PCR-酶解鑒定：遺傳病有限制性內(nèi)切酶解鑒定：遺傳病有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的丟失，酶位點(diǎn)的丟失，如：鐮刀形細(xì)胞貧血癥，如：鐮刀形細(xì)胞貧血癥，CvnI4) PCROLA（oligo-nucleotide ligation

19、assay）5) LCR(ligase chain reaction)鑒定鑒定:較較PCROLA簡單，但靈敏度低些。簡單，但靈敏度低些。6) PCRELISE檢測：雙標(biāo)記寡聚核苷酸捕獲檢測：雙標(biāo)記寡聚核苷酸捕獲分析法分析法7) 特異性等位基因寡聚核苷酸雜交（特異性等位基因寡聚核苷酸雜交（allele-specific oligonucleotide hybridization, ASO）: 同一基因中多個(gè)不同位點(diǎn)的突變檢同一基因中多個(gè)不同位點(diǎn)的突變檢測測8) 擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）9)

20、人工引入酶切位點(diǎn)（人工引入酶切位點(diǎn)（artificial introduction of restriction site, AIRS）10)直接測序法（直接測序法（direct sequencing, DS ）11)引物延伸法（引物延伸法（primer extension, PEX）12) PCR-SSCP法法13)免疫免疫PCR原理：原理： 擴(kuò)增模板數(shù)擴(kuò)增模板數(shù)S=S0(1+Es)j (其中S0為初始模板數(shù), Es為平均擴(kuò)增效率, j為循環(huán)次數(shù))。利用這種線性關(guān)系, 通過S值可求解出初始模板數(shù)S0, 從而實(shí)現(xiàn)定量。 14)14)定量定量PCR技術(shù)技術(shù) 定量定量PCR主要建立在主要建立在競爭

21、性競爭性PCR基礎(chǔ)上基礎(chǔ)上：向樣本中加入一個(gè)作為內(nèi)標(biāo)的競爭性模板, 它與目的基因具有相同的引物結(jié)合位點(diǎn), 在擴(kuò)增中兩者的擴(kuò)增效率基本相同, 而且擴(kuò)增片段在擴(kuò)增后易于分離, 然后據(jù)內(nèi)標(biāo)的動(dòng)力學(xué)曲線求得目的基因的原始拷貝數(shù)。 以乙肝病為例,熒光定量可測到每微升血清中含有10100個(gè)病毒顆粒,乙肝表面抗原強(qiáng)陽性的患者血清中,可測得高達(dá)105106-1的病毒顆粒。隨著治療進(jìn)程,病毒復(fù)制逐漸減少。治愈后便測不出病毒顆粒。據(jù)此可建立乙肝治愈的分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。15)熒光定量熒光定量PCR熒光定量熒光定量融匯了技術(shù)的核酸高效擴(kuò)增高效擴(kuò)增, 探針技術(shù)的高高特異性特異性, 光譜技術(shù)的高敏感性高敏感性和高精確定量高精

22、確定量的優(yōu)點(diǎn), 直接探測過程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量的結(jié)果。完全封閉操作, 儀器直接讀數(shù),避免了因污染而導(dǎo)致的假陽性, 使結(jié)果準(zhǔn)確可靠,結(jié)果判斷更客觀真實(shí), 定量范圍寬(可包括0108個(gè)拷貝/), 且無需樣品梯度稀釋等特點(diǎn)。 -的酶酶不僅有延伸的引物的活性還有53外切核酸酶活性,可在鏈延伸過程中實(shí)現(xiàn)鏈替換,并將被替換的單鏈切斷,這就是-的酶學(xué)基礎(chǔ)。-反應(yīng)體系中不僅有兩條普通的引物,還有一條熒光標(biāo)記探針,這條探針的5端和3端分別標(biāo)記了熒光報(bào)告基團(tuán)()和熒光淬滅基團(tuán)()。當(dāng)這條探針保持完整時(shí)基團(tuán)的熒光信號(hào)被基因所淬滅;一旦探針被切斷,淬滅作用消失,產(chǎn)生熒光發(fā)射,通過熒光光譜分析儀檢測熒光強(qiáng)度,即

23、可測知擴(kuò)增產(chǎn)物的含量。 原理：原理：IV. IV. 基因芯片與分子診斷基因芯片與分子診斷什么是基因芯片什么是基因芯片 基因芯片指將大量不同的探針分子固定于支持物基因芯片指將大量不同的探針分子固定于支持物上后形成的微點(diǎn)陣載片，用他與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行上后形成的微點(diǎn)陣載片，用他與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度對樣品雜交，通過檢測每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度對樣品中不同基因的數(shù)量和序列信息進(jìn)行并行處理分析中不同基因的數(shù)量和序列信息進(jìn)行并行處理分析?；蛐酒琻直接往人體組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因的治病方法叫做體內(nèi)（in vivo）基因治療。n采用安全、無毒的載體導(dǎo)入工具安全、無毒的載

24、體導(dǎo)入工具攜帶外源基因穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞核與染色體整合，這是基因治療成敗的關(guān)鍵。n目前基因轉(zhuǎn)移的方法分為生物學(xué)方法、物理方法和化學(xué)方法。病毒載體是目前基因治療最為常用的病毒載體。n基因治療的靶細(xì)胞主要分為兩大類：體細(xì)胞和生殖細(xì)胞。n基因治療目前主要是治療那些對人類健康威脅嚴(yán)重的疾病。包括：遺傳?。ㄈ缪巡?、囊性纖維病、家庭性高膽固醇血癥等）、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病（如AIDS、類風(fēng)濕等）。7.4.2經(jīng)典基因治療的基本操作步驟經(jīng)典基因治療的基本操作步驟 在大多數(shù)基因治療的臨床試驗(yàn)中，來自患者血液或骨髓的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)。這些細(xì)胞被暴露在帶有目的基因的病毒中轉(zhuǎn)化。病毒進(jìn)入細(xì)胞后，目的

25、基因就成為宿主細(xì)胞DNA的一部分。這些細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后，通過靜脈注射重新回到患者體內(nèi)。在患者體內(nèi)繁殖，形成正常的功能。7.4.3導(dǎo)入載體研究進(jìn)展導(dǎo)入載體研究進(jìn)展病毒細(xì)菌質(zhì)粒哺乳動(dòng)物人工染色體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)類固醇介導(dǎo)脂質(zhì)體多聚賴氨酸納米顆粒非病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒腺病毒腺相關(guān)病毒慢病毒重組痘疫苗病毒單純皰疹病毒7.4.5基因治療的安全問題基因治療的安全問題v病毒通常能感染改變非目標(biāo)細(xì)胞。病毒通常能感染改變非目標(biāo)細(xì)胞。v新基因插入新基因插入DNADNA的位置可能出現(xiàn)錯(cuò)誤，導(dǎo)致癌癥和其他損傷的產(chǎn)生。的位置可能出現(xiàn)錯(cuò)誤，導(dǎo)致癌癥和其他損傷的產(chǎn)生。 v基因表達(dá)的控制，轉(zhuǎn)化基因基因表達(dá)的控制，轉(zhuǎn)化基因“過度表達(dá)過度

26、表達(dá)”，產(chǎn)生過多的缺失蛋白，導(dǎo)致，產(chǎn)生過多的缺失蛋白，導(dǎo)致?lián)p害；損害；v病毒載體產(chǎn)生炎癥或免疫響應(yīng)；病毒載體產(chǎn)生炎癥或免疫響應(yīng)；v患者可能將病毒傳播給其他個(gè)體或傳播到環(huán)境中?；颊呖赡軐⒉《緜鞑ソo其他個(gè)體或傳播到環(huán)境中。 干細(xì)胞的概念： 干細(xì)胞是一類能復(fù)制自身并產(chǎn)生特化細(xì)胞的細(xì)胞類型。 在受精后的第一小時(shí)內(nèi)受精卵經(jīng)幾次分裂發(fā)育成相同的全能細(xì)胞（totipotentcells）, 受精9天后這些細(xì)胞經(jīng)數(shù)次分裂發(fā)育成囊胚，囊胚具有外層細(xì)胞和內(nèi)層細(xì)胞（inner cell mass），外層細(xì)胞形成胎盤和支持組織，內(nèi)層細(xì)胞將形成各器官系統(tǒng)。這類內(nèi)層細(xì)胞即胚胎干細(xì)胞又稱為全能干細(xì)胞（pluripotent

27、）全能干細(xì)胞進(jìn)一步特化產(chǎn)生具有特殊功能的細(xì)胞群體。如造血干細(xì)胞分裂分化產(chǎn)生紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板，皮膚干細(xì)胞產(chǎn)生各種類型的皮膚細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞具有 4個(gè)特點(diǎn)個(gè)特點(diǎn) :v能大量繁殖并保持未分化狀態(tài)能大量繁殖并保持未分化狀態(tài) ;v在一定條件下能向內(nèi)、中、外在一定條件下能向內(nèi)、中、外 3個(gè)胚層個(gè)胚層組織和細(xì)胞分化組織和細(xì)胞分化 ;v具有全能性具有全能性 ,易于進(jìn)行基因改造操作易于進(jìn)行基因改造操作 ;v能夠形成嵌合體動(dòng)物能夠形成嵌合體動(dòng)物 ,從而成為聯(lián)系細(xì)從而成為聯(lián)系細(xì)胞和個(gè)體之間的橋梁胞和個(gè)體之間的橋梁成體干細(xì)胞成體干細(xì)胞 成年動(dòng)物的許多組織和器官，如表皮和造血系統(tǒng)，具有修復(fù)和再生的能

28、力。成體干細(xì)胞在其中起著關(guān)鍵的作用。 在特定條件下，成體干細(xì)胞或者產(chǎn)生新的干細(xì)胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能細(xì)胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動(dòng)態(tài)平衡。 成體干細(xì)胞普遍存在。 微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生一系列生長因子或配體，與干細(xì)胞相互作用，控制干細(xì)胞的更新和分化。成體干細(xì)胞可分化為特定組織 ,當(dāng)組織受到外傷、老化、疾病等損傷時(shí) ,這些干細(xì)胞就增殖分化 ,產(chǎn)生新的組織來代替它們 ,以保持機(jī)體的動(dòng)態(tài)平衡。成體干細(xì)胞還可橫向分化為其它組織。 在成體干細(xì)胞中 ,目前研究較多的是：造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞(Hematopoitic Stem Cell, HSC)間質(zhì)干細(xì)胞間質(zhì)干細(xì)胞 (Mese

29、nchymal Stem Cell, MSC)神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞 (Nural Stem Cell, NSC)干細(xì)胞的可塑性干細(xì)胞的可塑性 當(dāng)成體干細(xì)胞被移植入受體中 ,它們表現(xiàn)出很強(qiáng)的可塑性。從一種組織分離出的干細(xì)胞可以分化為各種不相關(guān)的細(xì)胞類型。例如 , 神經(jīng)干細(xì)胞可分化成為造血細(xì)胞系。與之相似 ,源于骨髓的干細(xì)胞可分化為某些非造血細(xì)胞類型 ,如包括骨骼肌、大腦的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和肝細(xì)胞。這些結(jié)果增加了采用骨髓移植治療各種疾病如肌營養(yǎng)不良、帕金森病、卒中和肝衰竭的可能性。i. 具有特定的分化表型或定向分化潛能具有特定的分化表型或定向分化潛能 ;ii. 可靠的細(xì)胞來源可靠的

30、細(xì)胞來源 ;iii.不引發(fā)移植排斥反應(yīng)。不引發(fā)移植排斥反應(yīng)。體外構(gòu)建工程組織、器官的細(xì)胞體外構(gòu)建工程組織、器官的細(xì)胞需滿足以下三個(gè)基本前提需滿足以下三個(gè)基本前提 :支架材料支架材料 支架材料為細(xì)胞的停泊、生長、繁殖、新陳代謝、形成新組織提供支持。目前研究較多的有以下幾種:I.I.可降解高分子材料可降解高分子材料 研究較多的是聚羥基乙酸、聚乳酸、聚羥基乙酸與聚乳酸的共聚物等。這些材料具有可標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、可降解、細(xì)胞相容性好等優(yōu)點(diǎn),但其酸性降解產(chǎn)物有可能對細(xì)胞的活性產(chǎn)生不利影響;同時(shí)其親水性、細(xì)胞相容性、力學(xué)強(qiáng)度等均尚待改進(jìn)。采用多種改性技術(shù)有可能滿足組織工程對支架材料的要求。II. 陶瓷類材料陶瓷

31、類材料 目前研究較成熟的是多孔羥基磷灰石(HA)、磷酸三鈣等。這類材料生物相容性好,有一定強(qiáng)度,是骨的無機(jī)鹽成分,常用作骨組織工程的支架材料。但由于它們降解慢,脆性大,降低了這類材料的實(shí)用性。 III.復(fù)合材料復(fù)合材料 將有機(jī)材料與無機(jī)材料復(fù)合, 可克服單純材料的缺點(diǎn),并能綜合其優(yōu)點(diǎn)。近幾年對納米材料或納米復(fù)合材料的研究有了新的突破,這已成為組織工程支架材料研究的方向之一。 IV.生物衍生材料生物衍生材料 生物組織經(jīng)過處理后獲得的材料稱為生物衍生材料。來源于人體的生物衍生材料保留了正常的網(wǎng)架結(jié)構(gòu),組織相容性好,是較為理想的組織工程支架材料。如膠原凝膠、脫細(xì)胞真皮構(gòu)建組織工程皮膚,纖維蛋白凝膠構(gòu)

32、建組織工程軟骨等。脫細(xì)胞、去抗原處理的生物衍生骨支架構(gòu)建的組織工程骨已有臨床應(yīng)用報(bào)道.組織構(gòu)建組織構(gòu)建a.組織工程骨的構(gòu)建組織工程骨的構(gòu)建a.1單純構(gòu)建a.2復(fù)合構(gòu)建Isogai(1999)將可降解高分子材料預(yù)制成人指骨形狀,分別接種成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞,植入裸鼠體內(nèi),20周后形成了含有軟骨及軟骨下骨的指骨和關(guān)節(jié)。Casabona(1998)將MSCs與在體外聯(lián)合培養(yǎng)后,植入裸鼠預(yù)先制備的帶血管蒂背闊肌肌皮瓣中,8周后有豐富的新骨形成,新骨血循環(huán)豐富。組織工程骨的復(fù)合構(gòu)建方式為臨床修復(fù)帶關(guān)節(jié)端的骨缺損、應(yīng)用顯微外科技術(shù)形成組織工程骨提供了新思路、新方法。a.3血管化構(gòu)建采用在管狀組織工程骨中植入

33、血管束、帶血管蒂筋膜包裹組織工程骨,或在體外培養(yǎng)中,應(yīng)用成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng),或加入血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等,均可使組織工程骨建立良好的血液循環(huán)。b.1無支架離心管培養(yǎng)采用高密度軟骨細(xì)胞,在離心管內(nèi)經(jīng)離心應(yīng)力作用后培養(yǎng),在沒有支架材料的條件下也能形成新的軟骨組織。b.2軟骨細(xì)胞與支架材料復(fù)合構(gòu)建曹誼林首先將軟骨細(xì)胞與可降解支架材料復(fù)合培養(yǎng),在體外形成了具有人耳形狀的耳軟骨組織。b.3雙層支架構(gòu)建b.組織工程軟骨的構(gòu)建組織工程軟骨的構(gòu)建c.1肌腱細(xì)胞與支架材料復(fù)合構(gòu)建肌腱細(xì)胞與支架材料復(fù)合構(gòu)建 將肌腱細(xì)胞接種在可降解支架材料上,體外培養(yǎng)710天后,植入動(dòng)物體內(nèi),在體內(nèi)營養(yǎng)環(huán)境及力學(xué)因素作

34、用下完成腱化過程,已被證明是一種有效的構(gòu)建方法。c.2應(yīng)力場三維培養(yǎng)應(yīng)力場三維培養(yǎng)組織修復(fù)與應(yīng)力的關(guān)系十分明確,在組織工程肌腱構(gòu)建中,體外模擬體內(nèi)肌腱的拉應(yīng)力,對形成組織工程肌腱是有利的。秦廷武在拉應(yīng)力條件下進(jìn)行組織工程構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)肌腱細(xì)胞沿應(yīng)力方向延展,增殖能力增強(qiáng),羥脯氨酸含量增加。但最合適的應(yīng)力條件還需進(jìn)一步研究。c. 組織工程肌腱的構(gòu)建組織工程肌腱的構(gòu)建d.1在導(dǎo)管中接種雪旺細(xì)胞 將神經(jīng)導(dǎo)管與神經(jīng)連接后,向?qū)Ч軆?nèi)注入雪旺細(xì)胞懸液或雪旺細(xì)胞凝膠,有促進(jìn)神經(jīng)再生作用,但效果并不十分滿意,原因是沒有為雪旺細(xì)胞提供可生存的三維空間。d.2雪旺細(xì)胞與三維支架復(fù)合構(gòu)建王光林等將高密度純化的雪旺細(xì)胞與市售專用混合后,接種在纖維絲上,再將此復(fù)合物植入中空、多孔、可降解纖維管中,橋接大鼠坐骨神經(jīng)缺損,組織學(xué)、電生理檢查證明其修復(fù)效果與自體神經(jīng)移植相當(dāng)。d.3在支架材料上分次接種雪旺細(xì)胞戴傳昌等將高密度雪旺細(xì)胞分次接種在纖維絲上,發(fā)現(xiàn)雪旺細(xì)胞能很好地黏附在材料上,并能形成細(xì)胞鏈。d. 組織工程周圍神經(jīng)的構(gòu)建組織工程周圍神經(jīng)的構(gòu)建e.1組織工程表皮表皮角朊細(xì)胞培養(yǎng)