米糠多糖的提取研究及米糠中水溶性維生素的測定

1、 米糠多糖的提取研究及米糠中水溶性維生素的測定 （江南大學化學與材料工程學院，江蘇無錫214122）摘要：微波浸提法研究了米糠多糖的提取，HPLC法同時測定了米糠中4種水溶性維生素。料液比為1：8在50微波火力條件下浸提30min，三氯乙酸去蛋白，兩步去淀粉，30醇沉，米糠多糖得率達1.41%。以體積比為88:12的0.1磷酸水溶液-甲醇為流動相，以0.6 mL/min流速等度洗脫，在266nm波長下檢測。各組分在8min能基線分離。米糠中VB1、VB6、煙酸和煙酰胺的含量分別為7.710-6 g/g、1.310-6g/g、14.910-6 g/g、16.210-6 g/g。關鍵詞：米糠；多糖

2、；微波浸提；水溶性維生素；高效液相色譜Study on Microwave Assistant Extraction of Rice Bran Polysaccharides and Determination of Water-Soluble Vitamins in Rice BranAbstract: Microwave assistant extraction has been applied for polysaccharides in rice bran samples. The best technology were that the material-water ratio w

3、as 1:8, the time of microwave assistant extraction was 30 min under 50% firepower. It was proved that -amylase could wipe off amylum effectively by two steps, and trichloroacetic acid method was the best way to wipe off albuminoid. And the ethanol concentration was 30%, the extraction rate of the wa

4、ter-soluble polysaccharides of rice bran was 1.41%.High performance liquid chromatography (HPLC) has been applied for the simultaneous determination of four kinds of water-soluble vitamins including vitamin B1, vitamin B6, nicotinic acid, and nicotinamide in rice bran. The separation was performed o

5、n a Hypersil C18 column (250 cm4.6mm i.d., 5.0 m) with a mobile phase of 0.1% H3PO4- methanol (88:12, V/V) at flow rate of 0.6 mL /min, and detection wavelength was 266 nm. Baseline separation of four vitamins can be achieved within 8 minutes.The content of 7.710-6 g/g、1.310-6g/g、14.910-6 g/g、16.210

6、-6 g/g for vitamin B1, nicotinic acid ,vitamin B6 and nicotinamide.Key words: rice bran; polysaccharides; microwave assistant extraction; water-soluble vitamins; high performance liquid chromatography米糠是一類具有廣泛開發(fā)潛力的高附加值資源，含有稻米的64營養(yǎng)物質及90人體所需要的各種營養(yǎng)元素1，包括維生素、米糠多糖、氨基酸、脂肪酸、礦物質，還有二十八碳烷醇、神經酰胺等生理功能卓越的活性物質2。米

7、糠多糖（Rice Brain polysaccharide，RBP）存在于稻谷的穎果皮層里，主要是指分子量不等的一類非淀粉多糖。采用不同的提取工藝會得到不同的米糠多糖組分。米糠多糖具有廣泛的生理活性，在抗腫瘤，增強免疫力，降血糖，降脂方面有顯著效果；水溶性維生素是一類重要的營養(yǎng)成分，在各種保健品3，功能型飲料中得到應用。煙酸和煙酰胺能夠促進頭皮血液循環(huán)，防止脫發(fā)；VB6具有美發(fā)功效；VB1具有滋養(yǎng)與深層清潔的作用，因此化妝品中也常添加微量的維生素4。因此，本實驗對這兩種活性成分進行了研究。多糖提取的方法有微波浸提法，熱水蒸煮法，超聲波提取法等。實驗中考察了米糠多糖的提取方法及去除雜質方法。選取

8、較優(yōu)的微波提取法，并對其提取工藝參數(shù)進行了進一步優(yōu)化。測定維生素的方法有紫外分光光度法5、熒光法6和高效液相色譜法（HPLC）7。但HPLC技術用于米糠中水溶性維生素的測定還未見報道。實驗采用HPLC建立了米糠中的水溶性維生素的測定方法，對樣品前處理方法進行了研究，對測定體系各影響因素進行了優(yōu)化。方法簡便快速，準確可靠，對復雜體系中水溶性維生素的測定具有重要的參考價值。一 米糠多糖的提取研究1. 米糠多糖的提取1.1 實驗材料米糠：無錫秦良商貿有限公司耐高溫-淀粉酶：無錫酶制劑廠，20000IU/g試劑：無水乙醇、石油醚、三氯乙酸、鹽酸均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。1.2儀器722

9、型可見光分光光度計；LD4-2A型臺式離心機；Panasonic微波爐；真空冷凍干燥機。1.3實驗方法1.3.1 米糠樣品的前處理將米糠用石油醚按1：3比例脫脂1小時，重復3次，自然干燥。1.3.2 用改進的硫酸-苯酚法測米糠多糖含量1.3.2.1 顯色劑的制備將50 mL濃硫酸緩緩加入10 mL水中，冷卻至室溫，加入0.6 g苯酚晶體攪拌使其溶解配成顯色液。 硫酸-苯酚法測米糠多糖含量取1.00 mL稀釋一定倍數(shù)的糖液于試管中加入5.00 mL顯色液振蕩混勻；取1.00 mL蒸餾水于試管中加入5.00 mL顯色液振蕩混勻，得到參比溶液。將標準溶液和參比溶液置于沸水浴中保溫3035 min，取

10、出后放在冷水浴中冷卻至室溫，于490 nm波長處測定其吸光值。傳統(tǒng)的硫酸-苯酚測糖法的操作過程是：取1.00 mL樣品加1.00 mL水，加1.00 mL 6 %苯酚搖勻后再加入5 mL濃硫酸，振蕩顯色，靜置30 min后，于490 nm處檢測其吸光度。加入硫酸時系統(tǒng)顯色溫度相差較大，而造成相應的偶然偏差。而改進后的方法，由于先把水和硫酸混合，對濃硫酸起到了稀釋作用，用冰水冷卻最后加入苯酚晶體，配成顯色液。通過沸水浴加熱來使其顯色，保證了反應系統(tǒng)溫度一致，很好地解決了檢測重現(xiàn)性與準確度的問題。1.3.3去除雜質方法的比較在多糖提取的過程中，蛋白與淀粉的去除會影響到多糖的純度與得率。因此本實驗采

11、用50%微波火力浸提30min，重復兩次提取?？疾炝薙evage法與三氯乙酸法去蛋白法；同時也考察了淀粉一步消化法與兩步消化法。正交實驗見表1。實驗結果見圖 1。Sevage法三氯乙酸法一步消化法兩步消化法30%醇沉 由此可以看出：淀粉一步消化所得多糖略高于兩步消化所得，可能是由于在較短的時間內淀粉未去盡，而淀粉本身就是一種多糖物質，為了得到較純的米糠多糖，實驗優(yōu)先考慮采用兩步消化法；在去蛋白的方法中，比較、得知，采用Sevage法與三氯乙酸法所得米糠多糖含量差別不大，考慮到Sevage法毒性較大，耗時較長，實驗優(yōu)先考慮三氯乙酸法。圖 1 正交實驗結果1.3.4 米糠多糖提取方法選擇1.3.4

12、.1 微波浸提法脫脂米糠與pH=5的鹽酸水溶液以料液比為1：10混合置于50微波火力下浸提30min，冷卻，離心得上層液，重復提取兩次，合并上層液。在上層液中加入0.5的耐高溫-淀粉酶于70oC的水浴鍋中保溫消化2小時后，再加入0.25的0.5的耐高溫-淀粉酶，在相同的條件下保溫消化15小時，離心得上清液。用30的三氯乙酸調節(jié)上述得到的上清液的pH4.5（即米糠蛋白等電點，pI），置于4oC冰箱中靜置過夜，使得米糠蛋白得以充分沉淀。離心得上清液。在上述得到的上清液中，加入無水乙醇，使其含量為30（V/V），置于4oC冰箱中靜置過夜，離心，得到米糠粗多糖RBPa溶液。用722型分光光度計測其吸光

13、值，計算米糠多糖含量。1.3.4.2熱水蒸煮浸提法脫脂米糠與pH=5的鹽酸水溶液以料液比為1：10混合置于110oC水浴鍋中，使其保持沸騰狀態(tài)2小時，期間不斷攪拌，定時補入損失的水分，冷卻，離心得上層液，重復提取兩次，合并上層液。下續(xù)步驟同1.3.4.1。1.3.4.3 超聲波浸提法 脫脂米糠與pH=5的鹽酸水溶液以料液比為1：10混合，在80oC條件下超聲提取30min，冷卻，離心得上層液，重復提取兩次，合并上層液。下續(xù)步驟同1.3.4.1。1.3.5比較結果 上述方法均是參考了有關文獻報道，采用的提取率相對較高的實驗條件。通過722型分光光計對兩種糖含量的測定，見圖2?？梢姡⒉ǚú粌H在提

14、取時間而且在糖的浸出率方面更具有優(yōu)勢。因此實驗采用微波浸提法，并對提取時間，提取火力進行了研究。 圖 2 3種提取方法所得米糠多糖含量1.3.5 微波浸提工藝1.3.5.1 微波提取 脫脂米糠與pH=5的鹽酸水溶液以料液比為1：8混合，分別在50微波火力條件下浸提30min（），50min（）；100微波火力條件下浸提30min（）、50min（）。冷卻，離心。各重復兩次提取，合并上層液。1.3.5.2 兩步消化法去除淀粉 在上層液中加入0.5的耐高溫-淀粉酶于70oC的水浴鍋中保溫消化2小時后，再加入0.25的0.5的耐高溫-淀粉酶，在相同的條件下保溫消化15小時，離心得上清液。1.3.5.

15、3 三氯乙酸去除蛋白質 用30的三氯乙酸調節(jié)上述得到的上清液的pH值4.5（即米糠蛋白等電點，pI），置于4oC冰箱中靜置過夜，使得米糠蛋白得以充分沉淀。離心得上清液。1.3.5.4乙醇沉淀米糠多糖在上述得到的上清液中，加入無水乙醇，使其含量為30（V/V），置于4oC冰箱中靜置過夜，離心，得到米糠粗多糖RBPa。1.3.5.5 不同提取條件下米糠多糖含量比較 圖 3 微波提取4種條件所得米糠多糖含量 由圖 3得知，微波提取條件，可見微波火力增大會對多糖造成一定的破壞；提取時間過長也存在同樣的情況。當微波輻射時間一定時，微波火力越高，物系吸收微波能越多，物系溫度升的越快，固液傳質速度亦越快；且

16、溫度越高，對物料細胞破壞作用越大，有利于物料有效成分浸出。但當微波火力增加到一定程度時，微波有可能促使米糠多糖分解，反而使米糠多糖提取率下降。1.3.5.6 真空冷凍干燥將微波方法所得的米糠多糖RBPa透析48小時后，冷凍干燥得到RBPa的固體粉末。2討論因此，脫脂米糠與pH=5的鹽酸水溶液以料液比為1：8混合，三氯乙酸法去除蛋白，兩步法去除淀粉，在50微波火力條件下浸提30min（）為最佳米糠多糖提取方法。米糠得率為1.41。RBPa為淡黃色絮狀固體，無味。苯酚硫酸試劑反應均呈棕紅色，與碘反應不顯藍色；易溶于水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮，無甜味，無揮發(fā)性，水溶液為淺黃色。二、高效液相色譜法測定

17、米糠中的水溶性維生素1 實驗部分1.1 儀器、試劑與樣品儀器： Waters505高效液相色譜儀（包括2487紫外檢測器）， Empower色譜工作站。色譜柱：Hypersil C18（250 cm4.6mm i.d., 5.0m）。超聲波振蕩器（BRANSON SB 3200T，上海）；固相萃取柱（固相PT-系列，河北省津楊濾材廠）等。試劑： VB6（純度 99）、煙酰胺（純度 99）、煙酸（純度99.5）、VB1（純度98）。均購自國藥集團化學試劑有限公司（上海）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。米糠樣品來源于無錫秦良商貿有限公司。1.2 色譜條件色譜柱：Hypersil C1

18、8 柱（250 cm4.6mm i.d., 5.0m）, 流動相：A: 0.1 %磷酸水溶液, B:甲醇，以體積比 A:B=88:12等度洗脫；流速為0.6 mL/min。檢測波長：266nm；進樣量 20 L。1.3試液的制備標準溶液的制備精確稱取約0.05g的四種維生素標準品，用0.01mol/L鹽酸溶解并稀釋到50 mL，搖勻，分別得到1.3610-3 g/mL，1.1810-3 g/mL，1.0410-3g/mL和1.00 10-3.g/mL的 VB1，VB6，煙酸和煙酰胺的標準儲備液，于4冰箱中保存。儲備液用流動相稀釋得所需濃度的標準溶液。1.3.2 米糠供試品溶液的制備取10.00

19、g米糠于100mL錐形瓶中，加入20mL混合溶劑（體積比為80:20的甲醇0.01mol/L鹽酸溶液）超聲提取30min，過濾，濾渣用相同的條件重復提取兩次，合并提取液。用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，濃縮液用無水乙醚萃取兩次脫脂，水相經0.45m濾膜過濾，再過固相萃取柱，定容至10mL容量瓶中，即得米糠供試品溶液。2結果與討論在上述色譜條件下，四種維生素在8min內達到基線分離，得到4種維生素的標樣圖，見圖1t/min圖1 水溶性維生素混合標準溶液色譜圖 峰標：1.VB1； 2.煙酰胺；3.煙酸；4.VB62.3方法學評價2.3.1 重現(xiàn)性試驗取4種維生素的標準儲備液等體積混和，然后稀釋16倍，在上述

20、優(yōu)化實驗條件下連續(xù)5次進樣，測得其峰面積及保留時間的相對標準偏差（RSD）均小于2，結果表明其重現(xiàn)性較好。如表1所示表1 重現(xiàn)性試驗組分RSD（%） (n=5)保留時間峰面積VB10.040.70煙酸0.050.50VB60.122.0煙酰胺0.040.792.3.2標準曲線及檢出限配置了一系列不同濃度的 VB1、VB6、煙酸和煙酰胺的混合標準溶液，在優(yōu)化的實驗條件下，進行了測定，得出各組分的線性回歸方程、線性范圍，并以3倍信噪比得到檢測限，結果如表2所示。結果顯示線性范圍寬，檢測限低。表2 回歸方程及檢測限組分線性范圍/（g/mL）回歸方程R2 檢測限/ (g/mL）VB18.510-78.510-5Y=5.84107X+28.420.99994.310-7煙酸9.310-76.510-5Y=4.91107X+7.070.99993.210-7VB61.010-67.410-5Y=1.45107X+65.270.99993.410-7煙酰胺6.010-76.210-5Y=6.06107X5.910.99993.010-72.4 樣品的測定及回收率實驗按