實(shí)驗(yàn)10雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)十實(shí)驗(yàn)十 雙縮脲法測定雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)常見蛋白質(zhì)含量測定的原理和方法2. 掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的方法二、原理一、分光光度法的根本原理及方法一、分光光度法的根本原理及方法一利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)展定性分析一利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)展定性分析維生素維生素B12溶液的吸收光譜溶液的吸收光譜主要方法：主要方法：1比較吸收光譜曲線比較吸收光譜曲線2比較最大吸收波長比較最大吸收波長蛋白質(zhì)的最大吸收波長為蛋白質(zhì)的最大吸收波長為280nm；核酸的最大吸收波長為核酸的最大吸收波長為260nm。3比較吸光度的比值比較吸光度的比值 純純DNA：8 . 1280260nmnm

2、AA二利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)展定量分析二利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)展定量分析1原理原理Beer-Lambert比爾定律：比爾定律：T=I/I0A=lg1/T=lgI0/IA=cl 其中：其中：T為透光率；為透光率；A為吸光率；為吸光率；I0為入射光強(qiáng)為入射光強(qiáng)度；度；I為透射光強(qiáng)度；為透射光強(qiáng)度；為摩爾消光系數(shù)；為摩爾消光系數(shù)；C為溶液濃度；為溶液濃度；L為溶液光為溶液光程的厚度程的厚度 2常用方法1規(guī)范曲線法規(guī)范曲線與樣品的測定條件必需一致。2規(guī)范管法規(guī)范管法 CX/AX=CS/AS，知，知CS，測定，測定AS、AX可求得可求得CX。3摩爾吸光系數(shù)法摩爾吸光系數(shù)法C=A/為為L=1cm，C為為1 m

3、ol/L時(shí)的吸光系時(shí)的吸光系數(shù)，也稱為摩爾吸光系數(shù)。數(shù)，也稱為摩爾吸光系數(shù)。 微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)總含量微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)總含量 被測的天然含氮化合物與濃硫酸共熱時(shí)分解出被測的天然含氮化合物與濃硫酸共熱時(shí)分解出氨，氨與硫酸反響生成硫酸銨。在凱氏定氮儀中參氨，氨與硫酸反響生成硫酸銨。在凱氏定氮儀中參與強(qiáng)堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸汽與強(qiáng)堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸汽蒸餾法將氨蒸入無機(jī)酸溶液中，然后再用規(guī)范酸溶蒸餾法將氨蒸入無機(jī)酸溶液中，然后再用規(guī)范酸溶液進(jìn)展滴定，滴定所用無機(jī)酸的量液進(jìn)展滴定，滴定所用無機(jī)酸的量(mol)相當(dāng)于被測相當(dāng)于被測樣品中氨的量樣品中氨的量m

4、ol，根據(jù)所測得的氨量即可計(jì)，根據(jù)所測得的氨量即可計(jì)算樣品的含氮量。算樣品的含氮量。 由于蛋白質(zhì)含氮量通常在由于蛋白質(zhì)含氮量通常在16 %左右，所以將凱左右，所以將凱氏定氮法測得的含氮量乘上系數(shù)氏定氮法測得的含氮量乘上系數(shù)6.25，便得到該樣，便得到該樣品的蛋白質(zhì)含量。品的蛋白質(zhì)含量。 Folin-酚試劑法酚試劑法(Lowry法法)測定蛋白質(zhì)濃度測定蛋白質(zhì)濃度 蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵(CONH)，因此有雙縮脲反響，在堿性溶液中，能與因此有雙縮脲反響，在堿性溶液中，能與Cu2+構(gòu)成構(gòu)成絡(luò)合物。絡(luò)合物。Folin酚反響是在雙縮脲反響的根底上，引酚反響是在雙縮脲反響的根底上

5、，引進(jìn)進(jìn)Folin試劑試劑(磷鉬酸磷鉬酸磷鎢酸試劑磷鎢酸試劑)，蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)銅絡(luò)銅絡(luò)合物能復(fù)原磷鉬酸合物能復(fù)原磷鉬酸磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比例。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比例。本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、靈敏度高、較紫外吸收法本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、靈敏度高、較紫外吸收法靈敏靈敏1020倍，較雙縮脲法靈敏倍，較雙縮脲法靈敏100倍。其缺乏之倍。其缺乏之處是此反響受多種要素干擾。處是此反響受多種要素干擾。Tris緩沖劑、蔗糖、緩沖劑、蔗糖、硫酸銨、巰基化合物、酚、檸檬酸。硫酸銨、巰基化合物、酚、檸檬酸。 紫外分光光度法測定

6、蛋白質(zhì)濃度紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度 由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收頂峰在吸收頂峰在280 nm波優(yōu)點(diǎn)。在此波長范圍內(nèi)，蛋白波優(yōu)點(diǎn)。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值質(zhì)溶液的光吸收值(OD280)與其含量呈正比關(guān)系，可與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。用作定量測定。 利用紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速、利用紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡便、不耗費(fèi)樣品、可回收利用、低濃度鹽類不干簡便、不耗費(fèi)樣品、可回收利用、低濃度鹽類不干擾測定。

7、擾測定。 含有核酸的樣品：含有核酸的樣品：蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45A2800.74A260 總蛋白定量分析總蛋白定量分析BCABicinchoninic acid，二辛可寧酸、二羧基二喹啉二辛可寧酸、二羧基二喹啉 準(zhǔn)確靈敏：準(zhǔn)確靈敏：BCA試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是202000g/ml；Micro BCA試劑測定范圍是試劑測定范圍是0.5-20g/ml 快速：快速：45分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典的分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典的Lowry法快法快4倍而且更加方便倍而且更加方便 經(jīng)濟(jì)適用：除試管外，測定可在微孔板中進(jìn)展，大經(jīng)濟(jì)適用：除試管外，測定可在微孔板中進(jìn)展，大大節(jié)

8、約樣品和試劑用量大節(jié)約樣品和試劑用量 不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響 檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)小于考馬斯亮藍(lán)檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)小于考馬斯亮藍(lán)根本原理：根本原理： 堿性條件下，蛋白將堿性條件下，蛋白將Cu2+復(fù)原為復(fù)原為Cu+，Cu+與與BCA試劑構(gòu)成紫顏色的絡(luò)合物，測定其在試劑構(gòu)成紫顏色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的處的吸收值，并與規(guī)范曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測蛋白的濃吸收值，并與規(guī)范曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測蛋白的濃度。度?？捡R斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)濃度考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)濃度 考馬斯亮藍(lán)在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋考馬斯亮藍(lán)在一定蛋白質(zhì)

9、濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律 ，因此可以，因此可以經(jīng)過測定染料在經(jīng)過測定染料在595nm595nm處光吸收的添加量得處光吸收的添加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。該法簡單、迅速、到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。該法簡單、迅速、干擾物質(zhì)少、靈敏度高比干擾物質(zhì)少、靈敏度高比LowryLowry法靈敏法靈敏4 4倍。倍。 Coomassie Dye-Based 蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH

10、2CH3SO3Na+雙縮脲法測定蛋白質(zhì)雙縮脲法測定蛋白質(zhì)* * 雙縮脲反響：雙縮脲在堿性條件下雙縮脲反響：雙縮脲在堿性條件下與銅離子結(jié)合生成紫紅色化合物，與銅離子結(jié)合生成紫紅色化合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。本顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。本法測定蛋白質(zhì)范圍法測定蛋白質(zhì)范圍1-10mg1-10mg H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3NH3 雙縮脲雙縮脲 三、操作步驟三、操作步驟1.取取15支試管，按下表編號(hào)、加試劑支試管，按下表編號(hào)、加試劑2.各管混勻后，參

11、與雙縮脲試劑各管混勻后，參與雙縮脲試劑3.0mL,37oC反響反響30min。3.以以0號(hào)管調(diào)零，測定各管號(hào)管調(diào)零，測定各管540nm光吸收值。光吸收值。四、結(jié)果處置四、結(jié)果處置1.繪制規(guī)范曲線繪制規(guī)范曲線 以牛血潔白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以牛血潔白蛋白含量為橫坐標(biāo)，OD540為縱為縱坐標(biāo)，繪制規(guī)范曲線。坐標(biāo)，繪制規(guī)范曲線。2.樣品的計(jì)算樣品的計(jì)算 根據(jù)樣品的根據(jù)樣品的OD540從規(guī)范曲線上查得樣品的從規(guī)范曲線上查得樣品的蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量mg/mL，再根據(jù)樣品的體積，再根據(jù)樣品的體積算出樣品的濃度。算出樣品的濃度。五、本卷須知五、本卷須知1. 須于顯色后須于顯色后30min內(nèi)測定，且各管由顯色

12、到比內(nèi)測定，且各管由顯色到比色時(shí)間應(yīng)盡能夠一致。色時(shí)間應(yīng)盡能夠一致。2.*樣品蛋白質(zhì)含量應(yīng)在規(guī)范曲線范圍內(nèi)。樣品蛋白質(zhì)含量應(yīng)在規(guī)范曲線范圍內(nèi)。3. 比色杯的運(yùn)用比色杯的運(yùn)用微量表達(dá)法10-3 (g, m, L) milligram 毫克 mg10-6 microgram 微克 g10-9 nanogram 納克 ng10-12 picogram 皮 克 pg10-15 femtogram 飛克 fg10-18 attogram 阿、渺克 ag 10-24 zepto仄普托 沙克 zgppm: parts per million 1 g/ml 1ppmppb: parts per billion

13、 1 ng/ml 1ppbppt: parts per trillion 1 pg/ml 1ppt五、分光光度計(jì)的運(yùn)用五、分光光度計(jì)的運(yùn)用儀器操作鍵引見儀器操作鍵引見“方式設(shè)定鍵方式設(shè)定鍵MODE：用于設(shè)置測：用于設(shè)置測試方式試方式“100%T/0ABS鍵：用于自動(dòng)調(diào)整鍵：用于自動(dòng)調(diào)整100.0%T(100.0透射比透射比)或或0ABS(零吸光度零吸光度)“0%T鍵：用于自動(dòng)調(diào)整零透射比鍵：用于自動(dòng)調(diào)整零透射比“波長設(shè)置旋鈕：用于設(shè)置分析波長波長設(shè)置旋鈕：用于設(shè)置分析波長3.樣品測試操作樣品測試操作 翻開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱翻開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘分鐘 用用“波長設(shè)置按鈕將波長設(shè)置在您將要運(yùn)用的分析波長波長設(shè)置按鈕將波長設(shè)置在您將要運(yùn)用的分析波長位置上位置上 翻開樣品室蓋，將擋光體插入比色皿架，并將其推或拉翻開樣品室蓋，將擋光體插入比色皿架，并將其推或拉入光路入光路 蓋好樣品室蓋，按蓋好樣品室蓋，按“0%T鍵調(diào)透射比零鍵調(diào)透射比零 取出擋光體，蓋好樣品室蓋，按取出擋光體，蓋好樣品室蓋，按“100%T調(diào)調(diào)100%透射透射比比 按按“方式鍵方式鍵MODE將測試方式設(shè)置為吸光度方式將測試方式設(shè)置為吸光度方式(A) 將參比溶液和被測溶液分別倒入比色皿中將參比溶液和被測溶液分別倒入比色皿中 翻開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比