熒光原位雜交(FISH)

1、（Fluorescence in situ hybridization,FISH）主講：張奎學(xué)院：生物技術(shù)學(xué)院學(xué)號(hào)：222007331212003原位雜交（原位雜交（ISH）v原位雜交 (in situ hybridization, ISH) 將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交。v原位雜交技術(shù)(ISH)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20世紀(jì)60年代。v使用DNA或者RNA探針來檢測(cè)與其互補(bǔ)的另一條鏈在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置?；驹砘驹韛根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA兩條單鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。

2、用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA、RNA或與mRNA互補(bǔ)的cDNA作探針，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸(RNA或DNA）片段進(jìn)行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DAN 的存在與定位。v3H、35S、125I、32P等 放射性同位素12熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)2v同位素原位雜交的不足之處：v1、不穩(wěn)定v2、高背景v3、曝光時(shí)間長(zhǎng)v4、結(jié)果統(tǒng)計(jì)處理繁瑣v5、同位素的使用和處理幾種原位雜交技術(shù)幾種原位雜交技術(shù)v1 基因組原位雜交技術(shù)v2 熒光原位雜交技術(shù)v3 多彩色熒光原位雜交技術(shù)v4 原位PCR熒光原位雜交熒光原位雜交v熒光原位雜交（Fluor

3、escence in situ hybridization， FISH）是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù),以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導(dǎo)分子(reporter molecule)結(jié)合,雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料。FISH的基本原理的基本原理vFISH基本原理是利用同源互補(bǔ)的待檢染色體與用生物素、地高辛標(biāo)記過的核酸探針,經(jīng)變性- 退火- 復(fù)性,形成待檢DNA與核酸探針的雜交體。使探針與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間發(fā)生免疫化學(xué)反應(yīng),最后用熒光顯微鏡對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析

4、。發(fā)展歷史發(fā)展歷史v1974年Evans首次將染色體顯帶技術(shù)和染色體原位雜交聯(lián)合應(yīng)用，提高了定位的準(zhǔn)確性。v20世紀(jì)70年代后期人們開始探討熒光標(biāo)記的原位雜交，即FISH技術(shù)。v1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標(biāo)本上，標(biāo)志著染色體定位技術(shù)取得了重要進(jìn)展。v1969 年Gall 和Pardue 以及Pardue 等人利用放射性同位素標(biāo)記的核酸探針對(duì)DNA進(jìn)行了雜交,開創(chuàng)了RNA-DNA 的同位素原位雜交技術(shù)。v他們都是采用放射性同位素標(biāo)記探針,需要采用放射自顯影進(jìn)行檢測(cè),這種檢測(cè)上的限制及當(dāng)時(shí)分子克隆方法的缺乏使得DNA原位雜交技術(shù)不能很快得到廣泛應(yīng)用。v1974 年

5、，Evans第一次將染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來,提高了基因定位的準(zhǔn)確性。v1975 年,Manning 等最先在溶液的分子雜交中,使用非放射性標(biāo)記,通過細(xì)胞色素C 將生物素與RNA 分子連接起來。v1977 年Rudkin發(fā)明了用間接免疫熒光法檢測(cè)目的DNA 的非同位素原位雜交(NISH)。v1981 年，Langer 等首次采用生物素標(biāo)記的核苷酸探針成功地進(jìn)行了染色體原位雜交,建立了非放射性原位雜交技術(shù) 。至此,以熒光標(biāo)記的探針在細(xì)胞制片上進(jìn)行基因原位雜交的技術(shù)建立起來。v1985 年，原位雜交技術(shù)被引進(jìn)到植物。v1986 年，Cremer 與Licher 等分別證實(shí)了熒光原位雜交

6、技術(shù)應(yīng)用于間期核檢測(cè)染色體非整倍體的可行性,從而開辟了間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究。v20世紀(jì)90年代，隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)行，由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要，F(xiàn)ISH技術(shù)得到了迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。FISH樣本的樣本的制備制備探針的制備探針的制備探針標(biāo)記探針標(biāo)記雜雜 交交（染色體顯帶）（染色體顯帶）熒光顯微鏡檢測(cè)熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果分析結(jié)果分析DNARNAPNA將探針置于載玻片上雜交加蓋玻片變性檢測(cè)在熒光顯微鏡下觀察探針的制備v探針（probe)是指用于檢測(cè)特定基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在或表達(dá)的DNA、RNA或寡核苷酸序列。v雜交實(shí)驗(yàn)所選擇的核酸探針可以分為三種：化學(xué)合成、克隆和PCR。探針的分類探針的分

7、類v根據(jù)化學(xué)組成，可以將探針分為DNA、RNA、PNA及寡核苷酸探針。vDNA探針 這類探針應(yīng)用最廣，可以通過化學(xué)合成、克隆或PCR技術(shù)獲得。vRNA探針 一般用RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄克隆的DNA序列獲得。RNA-RNA雜交分子在所有可能的雜交分子中最穩(wěn)定，但RNA探針容易被RNase降解。v肽核苷酸（PNA）探針 PNA寡聚物是一類新分子，其結(jié)構(gòu)與DNA相似。但在PNA中，沒有核糖-磷酸基骨架，其骨架是不帶電的肽鏈(聚酰胺）。PNA與DNA雜交時(shí)也遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則v與DNA相比，PNA對(duì)熱穩(wěn)定、與DNA的結(jié)合不依賴于離子強(qiáng)度，因此雜交時(shí)，受探針變性溫度和溶液PH的影響較小，鑒于這些特點(diǎn)和優(yōu)

8、點(diǎn)，PNA有望取代DNA或RNA作為FISH的探針。但由于PNA探針只能通過化學(xué)方法進(jìn)行合成，而且合成費(fèi)用高，因此迄今所用的PNA探針還僅限于染色體的泛著絲粒和泛端粒探針。v寡核苷酸探針 它是根據(jù)探針靶序列的堿基順序用化學(xué)方法合成的單鏈DNA，其長(zhǎng)度為15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易滲透到細(xì)胞的目標(biāo)區(qū)域；但也正由于分子小，限制了其所能攜帶的熒光基團(tuán)或報(bào)告分子數(shù)目，并最終導(dǎo)致雜交后熒光信號(hào)較弱。因此這類探針僅實(shí)用于對(duì)重復(fù)單位較短的高度重復(fù)序列的熒光原位雜交分析。探針標(biāo)記探針標(biāo)記v為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào)。v熒光原位雜交

9、得探針常用熒光素或地高辛進(jìn)行標(biāo)記。v探針標(biāo)記可以采用均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記的方法。v對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，可復(fù)制合成一段新探針分子，在復(fù)制合成過程滲入標(biāo)記核苷酸，從而使整個(gè)新分子被均勻地標(biāo)記。其顯著的特點(diǎn)是標(biāo)記不局限一個(gè)位點(diǎn)，而是均勻地滲入，探針的信號(hào)強(qiáng)。v均勻標(biāo)記有切口平移法、隨機(jī)引物法和PCR擴(kuò)增等方法。均勻標(biāo)記均勻標(biāo)記 切口平移法可對(duì)環(huán)狀或線性雙鏈DNA進(jìn)行標(biāo)記。一般對(duì)克隆的DNA片段用這種方法標(biāo)記的效果較好。 該方法使用時(shí)應(yīng)注意： A.只能標(biāo)記雙鏈DNA 使用探針時(shí)要預(yù)先變性后再使用，而且標(biāo)記時(shí)DNA片段不太小 B. DNA酶I使用的量要合適 太多會(huì)將DNA模板切碎，不能進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)；太少則不

10、能有效地打開缺口，使標(biāo)記物不能進(jìn)入缺口 C. 標(biāo)記時(shí)間不能太短 太短時(shí)間會(huì)造成標(biāo)記量不足，影響雜交的進(jìn)行 v1、不但可用于雙連DNA的標(biāo)記，而且可用于單連DNA和RNA的標(biāo)記v2、操作簡(jiǎn)單v3、標(biāo)記率高末端標(biāo)記末端標(biāo)記v直接將探針分子的某個(gè)原子替換為放射性同位素原子，或直接在探針分子上加上標(biāo)記的原子或復(fù)合物，這種直接標(biāo)記一般是在探針分子的末端進(jìn)行，所以稱之為末端標(biāo)記。v經(jīng)過末端標(biāo)記的核酸分子除作為雜交探針外，更多的用于RNA S1作圖以及引物延伸反應(yīng)中的標(biāo)記引物。染色體顯帶染色體顯帶v顯帶染色是將染色體經(jīng)過一定程序的處理,并用特定的染料染色后,使染色體在其長(zhǎng)軸上顯示出一個(gè)個(gè)明暗交替或深淺不同的

11、橫紋,這樣的橫紋就叫做染色體的帶。食管癌細(xì)胞系24色染色體mFISH核型分析v每條染色體都含有一定數(shù)量、一定排列順序、一定寬窄和染色深淺或明暗不同的帶,這就構(gòu)成了每條染色體的帶型。顯示染色體帶的過程稱為染色體顯帶。v染色體顯帶為染色體的研究提供了一個(gè)十分有效的方法。v染色體的顯帶技術(shù)分為兩大類:一類為整條染色體的顯帶技術(shù)；另一類為染色體局部的顯帶技術(shù)。奧芬蘭海水硝化細(xì)菌熒光原位雜交奧芬蘭海水硝化細(xì)菌熒光原位雜交全菌（采用EUB MIX型探針）氨氧化細(xì)菌（采用NSO1225型探針）全菌（采用EUB MIX型探針）亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（采用NIT3型探針） 熒光原位雜交熒光原位雜交特點(diǎn)特點(diǎn)v 優(yōu)點(diǎn)v1

12、、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；v2、探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；v3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；v4、FISH可定位長(zhǎng)度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；v5、多色FISH通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列；v6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。v 缺點(diǎn)v1、不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。v2、必須在已知探針的情況下方可進(jìn)行。FISH技術(shù)新進(jìn)展技術(shù)新進(jìn)展v隨著FISH的廣泛應(yīng)用，F(xiàn)ISH本身也得到長(zhǎng)足進(jìn)步。這主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：v探針 由最初的每次雜交用一種探針發(fā)展為每次雜交用多種探針，即由單色熒光原位雜交發(fā)展為多色熒光原位雜交v標(biāo)記物質(zhì) 由單一的幾種發(fā)展為現(xiàn)在的幾十種v雜交步驟和過程 分別由20多步、15h縮減為不到10步、2hv v一、基因定位v二、物理圖譜的構(gòu)建v三、染色體結(jié)構(gòu)分析與數(shù)目測(cè)定v四、物種起源、進(jìn)化和親緣關(guān)系研究v五、轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞學(xué)鑒定v六、基因表達(dá)分析和臨床病毒學(xué)檢測(cè)熒光原位雜交熒光原位雜交的