第二章 菌種擴大培養(yǎng)修改

1、第二章第二章 菌種的擴大培養(yǎng)菌種的擴大培養(yǎng)食品與生物工程學(xué)院張志才Tel:-mail: 緒論n發(fā)酵的定義：利用微生物、動物和植物細胞的酶酶合成目的產(chǎn)物目的產(chǎn)物的過程。n發(fā)酵工程的兩個里程碑：顯微鏡顯微鏡和通氣通氣發(fā)酵罐發(fā)酵罐第一節(jié)、概述第二節(jié)、種子制備的一般流程第三節(jié)、菌種生物活性檢測第四節(jié)、實驗室種子擴大培養(yǎng)第五節(jié)、種子質(zhì)量控制措施第一節(jié)、概述第一節(jié)、概述1、定義：菌種的擴大培養(yǎng)就是把保藏的菌種，即砂土管，冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化，再經(jīng)過茄氏瓶和種子罐逐級擴大培養(yǎng)，滿足發(fā)酵所需種子的數(shù)量和質(zhì)量的純種培養(yǎng)過程。這些純種的培養(yǎng)物稱為種子。 2、

2、目前的發(fā)展趨勢菌種的擴大培養(yǎng)與發(fā)酵相分離種子生產(chǎn)形成工業(yè)化： 酒精工業(yè) 釀造工業(yè) 生物轉(zhuǎn)化 某些特除代謝物 菌體細胞固定化發(fā)酵 無細胞發(fā)酵體系 目的：1）.生理適應(yīng)：讓菌種從固體試管、液體試管，逐步適應(yīng)發(fā)酵罐的要求。如：啤酒酵母 n 2）. 質(zhì)量滿足：提供大量而新鮮的、具有較高活力的菌種。 na、縮短發(fā)酵周期、降低能耗、減少染菌的機會n b、為了使培養(yǎng)菌在數(shù)量上取得絕對的優(yōu)勢，n抑制雜菌的生長。n 3).可以提高生產(chǎn)的成功率，減少“倒罐”現(xiàn)象。n要求：純種。作為種子必備的條件作為種子必備的條件：1）生命旺盛有活力，移種后，能迅速生長，縮短延滯期。2）菌體總量適宜，保證發(fā)酵罐的接種量。3）遺傳表

3、現(xiàn)性要穩(wěn)定；4）菌種要純。無雜菌污染。5）保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力第二節(jié)、 從保存菌種到生產(chǎn)用種子的一般流程確定流程的原則確定流程的原則：1、保證發(fā)酵罐的菌種質(zhì)和量；2、盡量縮短流程、以防治染菌?？紤]因素：考慮因素：1、發(fā)酵罐的體積2、菌種的特性3、工藝上菌種量的要求主要步驟n菌種生物活性檢測n實驗室種子制備階段：瓊脂斜面至固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)（如茄子瓶斜面培養(yǎng)等或液體搖瓶培養(yǎng)） n生產(chǎn)車間種子制備階段：種子罐擴大培養(yǎng) 返 回第二節(jié)、菌種生物活性檢測第三節(jié)、實驗室種子擴大培養(yǎng)一、固體種子制備二、液體種子制備概念：概念：種子罐的級數(shù)：種子在種子罐中擴大培養(yǎng)的次數(shù)。發(fā)酵罐的級數(shù)：種子罐數(shù)加一。接種量：是指

4、移入的種子液體體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。 或移入的種子液體積占接種前培養(yǎng)液體積的百分?jǐn)?shù)。種齡：生產(chǎn)種子時的培養(yǎng)時間。孢子制備：用固體培養(yǎng)的種子叫孢子制備。種子制備：用液體培養(yǎng)的種子叫種子制備。種子制備的工藝流程種子制備的工藝流程通常有兩種方法：固體法：用于釀造業(yè)（醬油、白酒等），也是源于釀造業(yè)， 有霉菌的純培養(yǎng)，也有混合培養(yǎng)如：大曲液體法：液體深層培養(yǎng)，適合于眾多發(fā)酵行業(yè) 液體培養(yǎng)為主導(dǎo)方式。 斜面孢子 孢子 米粒孢子 種曲 菌體 一、固體菌種（一）固體菌種制備1、斜面菌種的制備定義： 在試管或扁瓶（茄子瓶）內(nèi)，以瓊脂固化的培養(yǎng)基表面生長的菌種培養(yǎng)物。斜面種子制備流程： 培養(yǎng)基 分裝 滅菌

5、冷卻擺斜面接種恒溫培養(yǎng)斜面種子制備中應(yīng)注意的問題：1、瓊脂的用量 2、裝量 3、減少冷凝水4、不含有沉淀的固體物，用蒸餾水或去離子水5、微量元素先配成一定的，用移液管定量加入2、米粒孢子（米孢子） 米孢子：霉菌的孢子培養(yǎng)，接種到滅菌后的大米或小米顆粒上，恒溫培養(yǎng)一段時間后所產(chǎn)生的孢子。優(yōu)點：保存期較長，可用半年以上。 孢子量大，107-108個孢子/g米粒。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：1.無雜菌污染，每500瓶抽樣檢查1-2瓶；2.足夠孢子數(shù)，發(fā)芽率80%；3.生產(chǎn)能力高；4.真空干燥后含水率小于8%；大米或小米水洗瀝干分裝混勻滅菌接種（搖勻）培養(yǎng)米孢子制備工藝流程制備工藝流程：斜放，且搖翻動注意事項：1、浸泡

6、時間及加營養(yǎng)液的量應(yīng)掌握在滅菌后米粒熟透而不粘連。2、分裝量2-3厘米厚度3、米粒不要碰在瓶口4、前期搖動，后期不要再動5、米?？纱娣虐肽?，冰箱4、真空干燥蠟封。無菌蒸餾水斜面孢子孢子懸浮液3、種曲、種曲培養(yǎng)材料：培養(yǎng)材料：麩皮、米糠、木屑、稻殼等 檸檬酸、醬油、醋、糖化酶放線菌孢子的制備放線菌孢子的制備：瓊脂斜面培養(yǎng)基，碳源和氮源不要太豐富，干燥和限制營養(yǎng)可誘發(fā)孢子形成。培養(yǎng)溫度28 ，少數(shù)37 ；培養(yǎng)時間5-14天。霉菌孢子的制備霉菌孢子的制備：一般采用米孢子或種曲，培養(yǎng)溫度25 -28 ，培養(yǎng)時間4-14天。細菌孢子的制備細菌孢子的制備：瓊脂斜面培養(yǎng)基，碳源限量而氮源豐富的配方，牛肉膏、

7、蛋白胨。培養(yǎng)溫度37 ，少數(shù)28 ；培養(yǎng)時間一般1-2天，產(chǎn)芽孢的細菌5-10天。（二）、固體種子質(zhì)量控制措施影響孢子質(zhì)量的因素通常有：n原材料的質(zhì)量n滅菌條件n培養(yǎng)條件n培養(yǎng)時間n冷藏時間n接種量n有害氣體和揮發(fā)物1、原材料的質(zhì)量n麩皮：n蛋白胨：n無機離子含量不同： 微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。n水質(zhì)的影響n菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。解決措施解決措施n（1）培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗合格才可使用；n（2）嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量；n（3）斜面培養(yǎng)

8、基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時間；n（4）供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機氮源。2、培養(yǎng)條件n（1）溫度n（2）濕度（培養(yǎng)基內(nèi)濕度，培養(yǎng)基外濕度）n不同相對濕度對龜裂鏈霉菌斜面生長的影響 3、培養(yǎng)時間和冷藏時間n（1）培養(yǎng)時間n解決措施：n孢子培養(yǎng)的時間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。n（2）冷藏時間n冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如慶大霉素生產(chǎn)中，孢子4 冷藏15天，發(fā)酵單位比不冷藏的提高1214，孢子在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。n接種量

9、大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進而影響菌體的生理狀況。二次生長 孢子斜面制備過程中由于營養(yǎng)過于豐富，或者濕度過大引起斜面上剛長出的孢子萌發(fā)形成菌絲體。同步生長(synchronous culture) ：n同步培養(yǎng)是一種培養(yǎng)方法，它能使群體中不同步的細胞轉(zhuǎn)變成能同時進行生長或分裂的群體細胞。以同步培養(yǎng)方法使群體細胞能處于同一生長階段，并同時進行分裂的生長方式稱為同步生長。通過同步培養(yǎng)方法獲得的細胞被稱為同步細胞或同步培養(yǎng)物。二、液體種子制備二、液體種子制備好氧培養(yǎng)好氧培養(yǎng)n 對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S. griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S. Ka

10、namuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。其過程如下：n 試管三角瓶搖床種子罐 液體種子培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)n對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其種子的制備過程如下：n試管三角瓶卡式罐種子罐制備過程中注意事項：制備過程中注意事項：營養(yǎng)比斜面要豐富，保持pH穩(wěn)定裝量要適當(dāng)，保持良好的通氣；好氧培養(yǎng)三角瓶 40-50mL/250mL、6080mL/500mL、 90-110mL/750mL、120-150mL/1000mL。 厭氧培養(yǎng)時裝液量增加一倍。滅菌時要注意棉塞不要被打濕。搖床轉(zhuǎn)速。注意搖床上下、邊緣、中心的溫差。三

11、、實驗室菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)n無污染,菌落形態(tài)一致。n性能穩(wěn)定實例：生產(chǎn)啤酒的酵母菌制作n實驗室制備的孢子斜面或搖瓶種子移接到種子罐進行擴大培養(yǎng)n種子罐培養(yǎng)作用n、使菌種獲得足夠的數(shù)量，n、種子罐中的培養(yǎng)基更接近發(fā)酵罐培養(yǎng)的醪液成分和培養(yǎng)條件，譬如通無菌空氣，攪拌形式等等，以使菌體適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境 n、使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長。 第四節(jié)、生產(chǎn)車間種子制備第四節(jié)、生產(chǎn)車間種子制備1、種子罐接種常用接種方法n火圈保護法n壓差法接種2、種子罐級數(shù)n確定種子罐級數(shù)的因素： （1）菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度； （2）所采用發(fā)酵罐的容積。n確定種子罐級數(shù)需注意的問題n（1）種子

12、級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會n（2）種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會n（3）雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)n細菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。n 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 n霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵 n 孢子懸浮液一級種子罐（27,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲 ）二級種子罐（27，1024小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）發(fā)酵罐n放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵n酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用二級種

13、子 3、影響種子罐種子質(zhì)量的因素1、培養(yǎng)基：逐步接近發(fā)酵培養(yǎng)基2、培養(yǎng)條件：溫度、溶氧3、種齡：對數(shù)生長期的菌絲 細菌 霉菌 放線菌 7-24h 16-50h 21-64h.4、接種量；接種種齡的影響 接種量的影響通常采用的接種量n細菌15%n酵母菌510%n霉菌715%，有時2025%n植物細胞：3050接種量n影響接種量的因素：菌種生長速度 一般情況下：以大接種量較為適合n適合的接種量的重要性： 過大：菌絲生長過快，粘稠，營養(yǎng)基質(zhì)缺乏， 溶氧不足 過?。壕z體生長緩慢，發(fā)酵周期延長，產(chǎn)生菌絲團培養(yǎng)基的影響種子培養(yǎng)基成分要滿足以下要求：n（1）營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要 n（2）選擇有利于孢

14、子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基； n（3）營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用； n（4）營養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高 ，并且成分盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基成分一致。n（5）營養(yǎng)成分、液體環(huán)境（滲透壓、氧化還原電極電位、pH、水的離子活度等）要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。 培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的pH的影響的影響圖：原核生物細胞膜上的電子傳遞鏈圖：與膜結(jié)合的ATP合成酶的結(jié)構(gòu)和功能培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的pH的影響的影響培養(yǎng)的工藝條件的影響培養(yǎng)溫度 攪拌溶氧 通氣溫度對微生物生長的影響具體表現(xiàn)在：n影響酶活性，微生物生長過程中所發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)絕大多數(shù)是在特定酶催化下完成的，每種酶都有最適的酶促反應(yīng)溫度，溫度

15、變化影響酶促反應(yīng)速率，最終影響細胞物質(zhì)合成。n影響細胞質(zhì)膜的流動性，溫度高流動性大，有利于物質(zhì)的運輸，溫度低流動性降低，不利于物質(zhì)運輸，囤此溫度變化影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌。 n影響物質(zhì)的溶解度，物質(zhì)只有溶于水才能被機體吸收或分泌，除氣體物質(zhì)以外，溫度升高，物質(zhì)的溶解度增加，溫度降低物質(zhì)的溶解度降低，最終影響微生物的生長。 第五節(jié)、第五節(jié)、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的控制措施 n菌種穩(wěn)定性的檢查菌種穩(wěn)定性的檢查 ：將保藏菌株溶于無菌的生理鹽水中，逐級稀釋，然后在培養(yǎng)皿瓊脂固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，長出菌落，選擇形態(tài)優(yōu)良的菌落接入三角瓶進行液體搖瓶培養(yǎng)，檢測出生產(chǎn)率高的菌種備用 n種子液生化分析項目種子液生化分析項目：營養(yǎng)消耗的速度，pH變化，溶氧利用情況，色澤、氣