酶工程3 第三章：酶的分離純化

1、酶工程酶工程3 3 第三章：酶的分離純化第三章：酶的分離純化要點(diǎn)：l酶主要還是蛋白質(zhì)，能用于蛋白質(zhì)的分酶主要還是蛋白質(zhì)，能用于蛋白質(zhì)的分離純化方法通常可用于酶。離純化方法通?？捎糜诿?。l要盡量減少酶活損失。要盡量減少酶活損失。l要分清是胞內(nèi)酶還是胞外酶要分清是胞內(nèi)酶還是胞外酶l根據(jù)酶的用途采用不同的方法根據(jù)酶的用途采用不同的方法3.1 酶分離純化流程酶原液否胞內(nèi)酶細(xì)胞破碎提取分離濃縮干燥預(yù)處理細(xì)胞分離3.2 酶純度的評價(jià)l總活力的回收率總活力的回收率l比活力提高的倍數(shù)比活力提高的倍數(shù)l酶的純度酶的純度實(shí)用價(jià)值側(cè)重科研3.2.1 酶總活力回收率與提純倍數(shù)1 總活力的回收率：反映提純過程酶活總活力

2、的回收率：反映提純過程酶活力的損失情況。力的損失情況?？偦盍Φ幕厥章士偦盍Φ幕厥章始兓罂偦盍兓罂偦盍?純化前總活純化前總活力力*100%2 提純倍數(shù)：反映純化方法的效率提純倍數(shù)：反映純化方法的效率純化倍數(shù)純化后的比活純化倍數(shù)純化后的比活/純化前的比活純化前的比活示例：腺苷酸激酶純化表（6kg豬肉）純化步驟 總體積 總蛋白 總活力 比活力 純化倍數(shù) 回收率 抽提 16600 43500 0.0413 0.95 1 100ml mg katal katal/kg %調(diào)pH 15700 11200 3.25層析 1380 1716 13.02凝膠過濾 211 462 43.17 結(jié)晶 - 34

3、4 46.53.2.2 酶的純度檢驗(yàn)l注意標(biāo)明使用何種方法檢驗(yàn)的注意標(biāo)明使用何種方法檢驗(yàn)的.l 不同方法檢驗(yàn)的純度可能不一致。如電泳純、層析不同方法檢驗(yàn)的純度可能不一致。如電泳純、層析純、純、HPLC純。純。常用的檢驗(yàn)酶純度的方法方法特點(diǎn)超速離心 檢測雜質(zhì)檢測雜質(zhì)5%時(shí)不太滿意，不適合絡(luò)合解離體系時(shí)不太滿意，不適合絡(luò)合解離體系電泳 必須在多種必須在多種pH值下進(jìn)行，單一值下進(jìn)行，單一pH兩種酶可能一兩種酶可能一起移動起移動SDS電泳 可測出分子量，多亞基時(shí)會出現(xiàn)多條區(qū)帶可測出分子量，多亞基時(shí)會出現(xiàn)多條區(qū)帶等電聚焦 檢測雜的極靈敏方法，有時(shí)會出現(xiàn)表觀異質(zhì)現(xiàn)象檢測雜的極靈敏方法，有時(shí)會出現(xiàn)表觀異質(zhì)

4、現(xiàn)象N末端分析 只適用于一條肽鏈只適用于一條肽鏈免疫技術(shù) 高度的專一性，但抗血清制備較為麻煩高度的專一性，但抗血清制備較為麻煩3.3分離與純化l分離（提?。悍蛛x（提?。涸谝欢l件下，用適當(dāng)?shù)脑谝欢l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┲?。溶劑處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑中。l純化：純化：通常先根據(jù)溶解度性質(zhì)用沉淀的方法通常先根據(jù)溶解度性質(zhì)用沉淀的方法（如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等），制得粗酶，（如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等），制得粗酶，再根據(jù)酶分子的大小、電荷性質(zhì)、親和專一再根據(jù)酶分子的大小、電荷性質(zhì)、親和專一性，將酶純化。性，將酶純化。3.3.1 細(xì)胞破碎的方法l機(jī)械破碎法機(jī)械破碎

5、法l物理破碎法物理破碎法l化學(xué)破碎法化學(xué)破碎法l酶促破碎法酶促破碎法P72-733.3.2酶提取的方法l鹽溶液提取法鹽溶液提取法l酸溶液提取法酸溶液提取法l堿溶液提取法堿溶液提取法l有機(jī)溶劑提取法有機(jī)溶劑提取法p76根據(jù)酶的溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。根?jù)酶的溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?.3.3影響酶提取的主要因素1提取目標(biāo)提取目標(biāo):提高提取率減少酶活損失。提高提取率減少酶活損失。1)溫度：溫度過高易導(dǎo)至酶失活，應(yīng)控制在溫度：溫度過高易導(dǎo)至酶失活，應(yīng)控制在010，對于穩(wěn)定性高的酶提高溫度有利于提，對于穩(wěn)定性高的酶提高溫度有利于提取。取。2）pH:pH應(yīng)遠(yuǎn)離等電點(diǎn)以提高溶解度，但應(yīng)遠(yuǎn)離等電點(diǎn)以提高

6、溶解度，但pH不宜過高或過低，防止酶失活。不宜過高或過低，防止酶失活。3) 提取液用量：用量增加，提取率增加但分離提取液用量：用量增加，提取率增加但分離成本提高。一般為原液的成本提高。一般為原液的3-5倍倍4) 添加保護(hù)劑：加入適量的酶作用底物、輔酶添加保護(hù)劑：加入適量的酶作用底物、輔酶或抗氧化劑可以提高酶穩(wěn)定性，減少酶活損或抗氧化劑可以提高酶穩(wěn)定性，減少酶活損失。失。1分離過程中新設(shè)備、新技術(shù)的應(yīng)用會取得分離過程中新設(shè)備、新技術(shù)的應(yīng)用會取得事半功倍的效果。如離心機(jī)、過濾機(jī)的選擇。事半功倍的效果。如離心機(jī)、過濾機(jī)的選擇。采用膜分離技術(shù)等。采用膜分離技術(shù)等。2. 濃縮與干燥過程盡量使用低溫過程減

7、少酶失濃縮與干燥過程盡量使用低溫過程減少酶失活，同時(shí)可添加一些保護(hù)劑以減少酶失活?；?，同時(shí)可添加一些保護(hù)劑以減少酶失活。提取時(shí)的注意事項(xiàng)提取時(shí)的注意事項(xiàng)3.4 沉淀分離沉淀分離方法：沉淀分離方法：l鹽析沉淀鹽析沉淀l等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀l有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀l復(fù)合沉淀復(fù)合沉淀l選擇性變性劑沉淀選擇性變性劑沉淀收集沉淀過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì) 膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì) 3.5 離心分離l借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小密度的物質(zhì)分離的技術(shù)

8、。不同大小密度的物質(zhì)分離的技術(shù)。常用于：細(xì)胞收集、細(xì)胞碎片和沉淀的常用于：細(xì)胞收集、細(xì)胞碎片和沉淀的分離及酶的純化。分離及酶的純化。選擇離心分離注意選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、選擇離心分離注意選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法離心條件。離心方法離心條件。3.5.1 離心機(jī)的種類和用途常速離心機(jī)常速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速在8000r/min內(nèi)高速離心機(jī)高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速在1x1042.5x104r/min內(nèi),高速離心會導(dǎo)致溫度升高因?yàn)榉乐姑傅仁Щ?，有的裝有冷凍裝置。超速離心機(jī)超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速在2.5x1048x104 r/min內(nèi)，都裝有冷凍裝置，和其它一些控制系統(tǒng)。常速離心機(jī)高速離心機(jī)超速離心機(jī)l超速離心機(jī)又可分為制備用超

9、速離心機(jī)，超速離心機(jī)又可分為制備用超速離心機(jī)，分析用超速離心機(jī)，分析制備兩用超速分析用超速離心機(jī)，分析制備兩用超速離心機(jī)。離心機(jī)。分析用超速離心機(jī)可用于樣品純度的檢分析用超速離心機(jī)可用于樣品純度的檢測、沉降系數(shù)和分子量的測定。分析用測、沉降系數(shù)和分子量的測定。分析用超速離心機(jī)一般都裝有光學(xué)檢測系統(tǒng)，超速離心機(jī)一般都裝有光學(xué)檢測系統(tǒng)，自動記錄儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等自動記錄儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等。沉降系數(shù)l單位離心力作用下，粒子的沉降速度。單位離心力作用下，粒子的沉降速度。Svedberg,S=1x10-13s21221lnlnXXStt角速度，t2-t1離心時(shí)間，X1,X2粒子距中心軸的距離3.5.2

10、離心方法的選擇p82l常速和高速離心機(jī)只要選擇合適的速度常速和高速離心機(jī)只要選擇合適的速度和時(shí)間就可以了而對于超速離心機(jī)離心和時(shí)間就可以了而對于超速離心機(jī)離心方法可分為方法可分為差速離心差速離心、密度梯度離心密度梯度離心和和等密度梯度離心等密度梯度離心。1、差速離心l采用不同的采用不同的離心速度離心速度和和離心時(shí)間離心時(shí)間，使沉，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。降速度不同的顆粒分批分離的方法。主要用于分離大小和密度差異較大的顆主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。操作簡單方便，但分離效果較差，粒。操作簡單方便，但分離效果較差，并使沉降的顆粒受到擠壓。并使沉降的顆粒受到擠壓。2、密度梯度離心

11、p82l是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心的方是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心的方法。能使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以法。能使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離。分離。01n01。n線性梯度離心還有凹形梯度和凸形梯度。不同大小和形狀的顆粒在密度梯度溶夜中形成若干條界面清楚的區(qū)帶密度梯度系統(tǒng)l可在溶劑中加入一定的溶質(zhì)制成密度梯可在溶劑中加入一定的溶質(zhì)制成密度梯度系統(tǒng)。要求介質(zhì)有足夠大的溶解度，度系統(tǒng)。要求介質(zhì)有足夠大的溶解度，不與組分反應(yīng)，且不會引起分離組分的不與組分反應(yīng)，且不會引起分離組分的凝集、變性或失活。常用的介質(zhì)有蔗糖凝集、變性或失活。常用的介質(zhì)有蔗糖和甘油。蔗糖的梯度范圍為：濃度和甘油。蔗糖的梯度

12、范圍為：濃度5%60%，密度為，密度為1.021.30g/cm33、等密度梯度離心p83l當(dāng)分離組分的密度當(dāng)分離組分的密度i時(shí)下沉，而=i顆粒停留在該處形成區(qū)帶。使得待分離的物質(zhì)處于離心介質(zhì)等密度處i形成區(qū)帶的離心方法。要求溶液的密度比較大要等于分離組分的密度，因此常用銫鹽如CsCl、Cs2SO4、CsBr等l當(dāng)分離組分的密度已知?jiǎng)t可直接用等密度離心而不用梯度。3.5.3 離心條件的確定l離心力離心力l離心時(shí)間離心時(shí)間l溫度和溫度和pH：防止酶凝集、變性和失活。：防止酶凝集、變性和失活。溫度通常在低溫下進(jìn)行，高速和超速離溫度通常在低溫下進(jìn)行，高速和超速離心必須采用冷凍系統(tǒng)，防止發(fā)熱。心必須采用

13、冷凍系統(tǒng)，防止發(fā)熱。 pH應(yīng)控制在酶穩(wěn)定的范圍內(nèi)，同時(shí)要盡量應(yīng)控制在酶穩(wěn)定的范圍內(nèi)，同時(shí)要盡量不采用過酸或過堿溶液，避免對轉(zhuǎn)子或不采用過酸或過堿溶液，避免對轉(zhuǎn)子或離心機(jī)腐蝕。離心機(jī)腐蝕。3.6 電泳l 主要用于酶的純度鑒定、酶分子量測定、主要用于酶的純度鑒定、酶分子量測定、酶等電點(diǎn)測定及小批量酶的分離純化。酶等電點(diǎn)測定及小批量酶的分離純化。常用的是凝膠電泳和等電聚焦電泳。常用的是凝膠電泳和等電聚焦電泳。電泳儀3.6.1 凝膠電泳l以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支持體的電泳技術(shù)。同時(shí)具有電泳和分子持體的電泳技術(shù)。同時(shí)具有電泳和分子篩的雙重作用。篩的雙重作用。常

14、用的支持體是聚丙烯酰胺凝膠常用的支持體是聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)連續(xù)凝膠電泳連續(xù)凝膠電泳不連續(xù)凝膠電泳不連續(xù)凝膠電泳：具濃縮作用濃度梯度凝膠電泳濃度梯度凝膠電泳: 用于測定球蛋白的分子量SDS-凝膠電泳凝膠電泳1 不連續(xù)凝膠電泳l分成三層：樣品膠、濃縮膠、分離膠。分成三層：樣品膠、濃縮膠、分離膠。特別適用于稀溶液的分離。特別適用于稀溶液的分離。-+樣品膠濃縮膠分離膠2、SDS-凝膠電泳l制備凝膠時(shí)加入制備凝膠時(shí)加入12%的十二烷基硫酸的十二烷基硫酸鈉，制成鈉，制成SDS-凝膠。凝膠。3.6.2 等電聚焦電泳l在電泳系統(tǒng)中加入兩性電解質(zhì)載體在電泳系統(tǒng)中加入兩性電解質(zhì)載體,通通電后在電場中形成一

15、個(gè)由陽極到陰極連電后在電場中形成一個(gè)由陽極到陰極連續(xù)增高的續(xù)增高的pH梯度。待分離組分在電場梯度。待分離組分在電場作用下移動到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)淖饔孟乱苿拥脚c其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位位置上，使不同等電點(diǎn)的物質(zhì)分離。置上，使不同等電點(diǎn)的物質(zhì)分離。特點(diǎn)l分辨率高：可分開等電點(diǎn)相差分辨率高：可分開等電點(diǎn)相差0.010.02pH的蛋白質(zhì)。的蛋白質(zhì)。l克服了電泳的擴(kuò)散作用：時(shí)間越長區(qū)帶克服了電泳的擴(kuò)散作用：時(shí)間越長區(qū)帶越窄。越窄。l與點(diǎn)樣位置關(guān)系不大：不論點(diǎn)在何處都與點(diǎn)樣位置關(guān)系不大：不論點(diǎn)在何處都可以聚焦到等電點(diǎn)位置。可以聚焦到等電點(diǎn)位置。l重現(xiàn)性好重現(xiàn)性好l可分離很稀的樣品可分離很稀的樣品l可準(zhǔn)確測定蛋白

16、質(zhì)或多肽的等電點(diǎn)?？蓽?zhǔn)確測定蛋白質(zhì)或多肽的等電點(diǎn)。對等電點(diǎn)處不溶解或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)不適用對等電點(diǎn)處不溶解或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)不適用載體兩性電解質(zhì)要求p107l 在等電點(diǎn)狀態(tài)下有足夠的緩沖能力，以便控在等電點(diǎn)狀態(tài)下有足夠的緩沖能力，以便控制好制好pH梯度。梯度。l 在等電點(diǎn)狀態(tài)下有足夠的導(dǎo)電能力，以便使在等電點(diǎn)狀態(tài)下有足夠的導(dǎo)電能力，以便使一定的電流通過。而且要求各個(gè)等電點(diǎn)不同一定的電流通過。而且要求各個(gè)等電點(diǎn)不同的兩性電解質(zhì)有相同的導(dǎo)電系數(shù)，使整個(gè)體的兩性電解質(zhì)有相同的導(dǎo)電系數(shù)，使整個(gè)體系導(dǎo)電均勻。系導(dǎo)電均勻。l 比待分離組分的分子量小，以便在等電聚焦比待分離組分的分子量小，以便在等電聚焦后易

17、于分離。后易于分離。l 化學(xué)組分與待分離組分不同，且與樣品中各化學(xué)組分與待分離組分不同，且與樣品中各組分不相互作用組分不相互作用 。等電聚焦電泳槽3.6.3 毛細(xì)管電泳主要優(yōu)點(diǎn)分析條件選擇簡便及分離的高效性。分析條件選擇簡便及分離的高效性。當(dāng)改變當(dāng)改變2或或3個(gè)數(shù)據(jù)時(shí)個(gè)數(shù)據(jù)時(shí),(例如緩沖劑的例如緩沖劑的pH值值,或濃度或濃度值值)可以在很大程度上提高分離的效率和選擇性?？梢栽诤艽蟪潭壬咸岣叻蛛x的效率和選擇性。在強(qiáng)電場的作用下在強(qiáng)電場的作用下,毛細(xì)管內(nèi)液體分離的效率可達(dá)毛細(xì)管內(nèi)液體分離的效率可達(dá)到到2,000,000理論的塔板數(shù)理論的塔板數(shù)(同液相色譜法相比同液相色譜法相比,色色譜柱的分離不超過

18、譜柱的分離不超過60,000-100,000理論的塔板數(shù)理論的塔板數(shù))?？煽啃钥煽啃?由于此方法不使用固體物質(zhì)由于此方法不使用固體物質(zhì),排除了毛排除了毛細(xì)管細(xì)管老化老化的可能性的可能性,同時(shí)不與樣品發(fā)生任何物理同時(shí)不與樣品發(fā)生任何物理化學(xué)反應(yīng)化學(xué)反應(yīng),從而避免了毛細(xì)管的經(jīng)常性損耗從而避免了毛細(xì)管的經(jīng)常性損耗,降低降低了毛細(xì)管電泳儀的成本。了毛細(xì)管電泳儀的成本。 時(shí)間短時(shí)間短,價(jià)格低廉。價(jià)格低廉。毛細(xì)電泳的高效分離毛細(xì)電泳的高效分離,使使樣品的準(zhǔn)備工作降到最低程度樣品的準(zhǔn)備工作降到最低程度,節(jié)省了試劑的消耗。節(jié)省了試劑的消耗。同時(shí)同時(shí),由于在毛細(xì)管中直接進(jìn)行檢測由于在毛細(xì)管中直接進(jìn)行檢測,致使分

19、析時(shí)致使分析時(shí)間縮短為間縮短為10-15分鐘。分鐘。3.7 酶的結(jié)晶l結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體的形式從溶液中解析結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體的形式從溶液中解析出的過程出的過程.結(jié)晶意義結(jié)晶意義:可以提高純度可以提高純度,獲得較高純度的獲得較高純度的酶酶 ;同時(shí)有些物理性質(zhì)的研究需要結(jié)晶同時(shí)有些物理性質(zhì)的研究需要結(jié)晶的酶。如的酶。如X射線晶體衍射測結(jié)構(gòu)。射線晶體衍射測結(jié)構(gòu)。結(jié)晶條件：通常要求酶的純度足夠，且結(jié)晶條件：通常要求酶的純度足夠，且不同的酶對純度的要求不一樣；酶的濃不同的酶對純度的要求不一樣；酶的濃度合適，太低不產(chǎn)生結(jié)晶、太高晶體小度合適，太低不產(chǎn)生結(jié)晶、太高晶體小不易長大。還要控制好溫度、不易長大。還要控制好溫度、pH、離、離子強(qiáng)度等。子強(qiáng)度等。常用的結(jié)晶方法：鹽析結(jié)晶法：加鹽降低溶解度