蛋白質定量及脂蛋白電泳學生用ppt

1、實驗報告要求實驗報告要求題目，組號題目，組號實驗目的實驗目的實驗原理實驗原理實驗操作：如實記錄實驗操作：如實記錄實驗結果及結果分析：實事求是實驗結果及結果分析：實事求是討論或小結：認真分析，仔細思考討論或小結：認真分析，仔細思考實驗目的實驗目的1. 掌握雙縮脲法測定蛋白濃度的原理掌握雙縮脲法測定蛋白濃度的原理;2. 掌握掌握Lowry氏法測定蛋白濃度的原理氏法測定蛋白濃度的原理;3. 學會使用分光光度計學會使用分光光度計; 4. 了解蛋白質定量的基本方法。了解蛋白質定量的基本方法。操作一操作一 Lowry氏法測定蛋白質含量氏法測定蛋白質含量u 實驗原理實驗原理u 操作步驟操作步驟u 計算方法計

2、算方法u 試劑及器材試劑及器材Folin-酚試劑法（酚試劑法（Lowry法）原理法）原理u在堿性條件下蛋白質的肽鍵與在堿性條件下蛋白質的肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質螯合，形成蛋白質-銅復合物。銅復合物。（雙縮脲反應）（雙縮脲反應）u蛋白質分子中帶有酚基的酪氨酸極易使酚試劑中的磷蛋白質分子中帶有酚基的酪氨酸極易使酚試劑中的磷鉬酸鉬酸-磷鎢酸還原，生成藍色化合物，藍色深淺與蛋白磷鎢酸還原，生成藍色化合物，藍色深淺與蛋白質含量成正比。質含量成正比。（還原反應）（還原反應）u利用藍色深淺與蛋白質濃度成正比的關系可繪制標準利用藍色深淺與蛋白質濃度成正比的關系可繪制標準曲線，測定樣品中蛋白質含量。曲線，

3、測定樣品中蛋白質含量。Folin-酚試劑法優(yōu)缺點酚試劑法優(yōu)缺點u優(yōu)點優(yōu)點:靈敏度高。靈敏度高。 靈敏度比雙縮脲法高靈敏度比雙縮脲法高100 倍，定量范圍為倍，定量范圍為25250g蛋白質蛋白質u缺點缺點:干擾物質較多。干擾物質較多。 1)對雙縮脲反應發(fā)生干擾的離子對雙縮脲反應發(fā)生干擾的離子; 2)Folin 試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸 引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物 均有干擾作用。均有干擾作用。 3)此外，不同蛋白質因酪氨酸、色氨酸含量不同而使此外，不同蛋白質因酪氨酸、色氨酸含量不同

4、而使 顯色強度稍有不同。顯色強度稍有不同。Folin-酚試劑法測定蛋白質含量為什么比雙縮脲法酚試劑法測定蛋白質含量為什么比雙縮脲法靈敏靈敏? uFolin酚試劑法最早是由酚試劑法最早是由Lowry確定的測定蛋白質濃度的基本方法。確定的測定蛋白質濃度的基本方法。uFolin酚試劑由酚試劑由甲試劑和乙試劑甲試劑和乙試劑組成。組成。 甲試劑甲試劑: 碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉 乙試劑乙試劑: 磷鉬酸、磷鎢酸、硫酸、溴磷鉬酸、磷鎢酸、硫酸、溴u此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即二種試

5、劑，即Folin酚試劑，以增加顯色量，從而提高酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。了檢測蛋白質的靈敏度。 實 驗 操 作試劑（ml）123456待測管標準蛋白液00.20.40.60.81.0待測蛋白液1.00.9%NaCl1.00.80.60.40.200堿性硫酸銅5.05.05.05.05.05.05.0取取7 7支試管，編號，按下表操作支試管，編號，按下表操作混勻，放置混勻，放置1010分鐘。分鐘。酚試劑0.50.50.50.50.50.50.5放置放置3030分鐘后，以第分鐘后，以第1 1管為空白管調節(jié)零點，然后測量管為空白管調節(jié)零點，然后測量各管各管750nm750n

6、m波長的光密度。波長的光密度。標準曲線繪制標準曲線繪制u用用坐標紙以坐標紙以1-6管光密度值為縱坐標，各管加管光密度值為縱坐標，各管加0.9% NaCl稀釋后的蛋白質濃度為橫坐標，繪成標準曲稀釋后的蛋白質濃度為橫坐標，繪成標準曲線。線。u根據(jù)待測溶液（第根據(jù)待測溶液（第7管）的光密度值，從標準曲線管）的光密度值，從標準曲線中查出其濃度。若待測溶液已經(jīng)稀釋，可根據(jù)稀中查出其濃度。若待測溶液已經(jīng)稀釋，可根據(jù)稀釋倍數(shù)推算出其標準溶液的濃度。釋倍數(shù)推算出其標準溶液的濃度。標準曲線法722分光光度計使用方法分光光度計使用方法該機的光譜范圍在該機的光譜范圍在360nm-800nm360nm-800nm。

7、接通電源，打開機器開關，使儀器通電，接通電源，打開機器開關，使儀器通電，打開箱蓋打開箱蓋，預熱，預熱1010分鐘。分鐘。 將空白液或對照液及測定液分別裝入比色杯將空白液或對照液及測定液分別裝入比色杯3/43/4體積并用體積并用軟紙軟紙擦清外壁，擦清外壁， 放入樣品室。放入樣品室。 調節(jié)電流計上零點調節(jié)器，使讀數(shù)盤上指針的吸光度為調節(jié)電流計上零點調節(jié)器，使讀數(shù)盤上指針的吸光度為A A或透光率為或透光率為0 0。 調節(jié)測定所用波長。調節(jié)測定所用波長。 蓋上箱蓋，光徑開關自動打開。轉動光量調節(jié)器使空白或對照管的吸光蓋上箱蓋，光徑開關自動打開。轉動光量調節(jié)器使空白或對照管的吸光 度為度為0 0，或透光

8、率為，或透光率為100100，待讀數(shù)指針穩(wěn)定后，逐步拉出樣品盒滑干，待讀數(shù)指針穩(wěn)定后，逐步拉出樣品盒滑干， 通過讀數(shù)指針，讀取測定管上的吸光度。有時需調節(jié)靈敏度開關，才能通過讀數(shù)指針，讀取測定管上的吸光度。有時需調節(jié)靈敏度開關，才能 正確讀得吸光度。此時應重新轉動零點調節(jié)器至吸光度為正確讀得吸光度。此時應重新轉動零點調節(jié)器至吸光度為A A。 讀數(shù)完畢，打開儀器蓋板，關閉開關，將比色杯沖洗干凈。讀數(shù)完畢，打開儀器蓋板，關閉開關，將比色杯沖洗干凈。 溶液定量測定時，應注意吸光度在溶液定量測定時，應注意吸光度在0.10.11.01.0范圍，濃度太大時應適當稀范圍，濃度太大時應適當稀 釋。釋。 * *

9、注意事項：注意事項： 1 1）用手拿比色杯的磨砂面。）用手拿比色杯的磨砂面。 2 2）液體的體積裝滿比色杯的）液體的體積裝滿比色杯的3/43/4。 3 3）不要將比色杯放在分光光度計上）不要將比色杯放在分光光度計上。操作二操作二 雙縮脲法測定血清總蛋白雙縮脲法測定血清總蛋白u雙縮脲反應原理雙縮脲反應原理u實驗步驟實驗步驟u計算方法計算方法u所需試劑及器材所需試劑及器材原理原理實 驗 操 作管別管別試劑試劑( (ml) )空白管空白管標準管標準管測定管測定管血血清清0.1蛋白標準液蛋白標準液1.00.9%0.9%氯化鈉氯化鈉2.01.01.9雙縮脲試劑雙縮脲試劑3.03.03.0搖勻后放入搖勻后

10、放入37水浴中，水浴中，20分鐘后分鐘后540nm比色，以空白管調零點測得各管光密度。比色，以空白管調零點測得各管光密度。 注意事項注意事項 1 1）須于顯色后）須于顯色后3030分鐘內比色，分鐘內比色，3030分鐘后可有霧狀沉淀。分鐘后可有霧狀沉淀。2 2）雙縮脲反應并非蛋白質特有的顏色反應，凡有肽鍵的物質均干擾此反應。）雙縮脲反應并非蛋白質特有的顏色反應，凡有肽鍵的物質均干擾此反應。3 3）避免硫酸銅過量、否則生成氫氧化銅，其藍色將掩蓋紫色影響測定結果。）避免硫酸銅過量、否則生成氫氧化銅，其藍色將掩蓋紫色影響測定結果。4 4、脂蛋白電泳的基本原理、脂蛋白電泳的基本原理 各種脂蛋白中所含各種

11、脂蛋白中所含載脂蛋白載脂蛋白的種的種類及數(shù)量不同，各種脂蛋白類及數(shù)量不同，各種脂蛋白顆粒大小顆粒大小、帶帶電荷的數(shù)量電荷的數(shù)量相差也很大，因此以瓊相差也很大，因此以瓊脂糖凝膠為支持物，在電場中可使各脂糖凝膠為支持物，在電場中可使各種脂蛋白顆粒分離開來。種脂蛋白顆粒分離開來。 實實 驗驗 操操 作作1、預染血清預染血清用微量移液器取血清用微量移液器取血清0.2ml，加蘇丹黑染色液，加蘇丹黑染色液0.02ml于小試管中，混合后置于小試管中，混合后置37水浴中染色水浴中染色30分分鐘，然后離心（鐘，然后離心（4000轉分）約轉分）約5分鐘。分鐘。2、制備瓊脂糖凝膠板、制備瓊脂糖凝膠板 將將0.5%瓊

12、脂糖凝膠于微波爐中加熱融化。澆注瓊脂糖凝膠于微波爐中加熱融化。澆注到電泳槽內，靜止待其凝固。到電泳槽內，靜止待其凝固。實實 驗驗 操操 作作3、點加血清、點加血清 加樣品時，用微量移液器（槍）吸取經(jīng)預染過的血清加樣品時，用微量移液器（槍）吸取經(jīng)預染過的血清20微升微升(注意注意: :不要吸取底部的染料顆粒不要吸取底部的染料顆粒)，注入凝膠板上的，注入凝膠板上的樣品槽內。樣品槽內。4、電泳、電泳 將加過血清的凝膠板平放于電泳槽中，樣品放于陰極將加過血清的凝膠板平放于電泳槽中，樣品放于陰極一端。接通電源，穩(wěn)流，電壓一端。接通電源，穩(wěn)流，電壓100V（電流約（電流約260-270MA），），經(jīng)電泳經(jīng)電泳50分鐘，即可見到分離的區(qū)帶。分鐘，即可見到分離的區(qū)帶。5、觀察并記錄電泳結果觀察并記錄電泳結果 CM 前前 血漿脂蛋白的電泳圖譜血漿脂蛋白的電泳圖譜正常參考值（百分比）：-脂蛋白 25.74.1%前-脂蛋白21.04.4%-脂蛋白 53.35.3%人有了知識，就會具備各種分析能力，人有了知識，就會具備各種分析能力，明辨是非的能力。明辨是非的能力。所以我們要勤懇讀書，廣泛閱讀，所以我們要勤懇讀書，廣泛閱讀，古人說古人說“書中自有黃金屋。書中自有黃金屋?！蓖ㄟ^閱讀科技書籍，我們能豐富知識，通過閱讀科技