動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)助教總結(jié)報(bào)告課件

1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)助教總結(jié)報(bào)告 李 驥 3009213008一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概念與分類2、熟悉無菌操作的步驟以及技巧二、實(shí)驗(yàn)原理1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) animal cell culture動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞（使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶）然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。2.原代培養(yǎng) primary culture原代培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代

2、細(xì)胞培養(yǎng)。最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。3.傳代培養(yǎng) subculture 當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止；另一方面也會(huì)因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長(zhǎng)或發(fā)生中毒。此時(shí)就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個(gè)過程就稱為傳代或者再培養(yǎng)。對(duì)單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。4.培養(yǎng)基 Medium培養(yǎng)基是供微生物、植物和動(dòng)物組織生長(zhǎng)和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機(jī)鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。有的培養(yǎng)

3、基還含有抗菌素和色素，用于單種微生物培養(yǎng)和鑒定。5.無菌操作 接種是細(xì)胞培養(yǎng)中極其重要的一環(huán)。接種過程是一個(gè)嚴(yán)格的無菌操作過程，操作不慎很容易引起污染。接種通常在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，由于空氣的高效過濾和一定的氣流速度吹動(dòng)，工作臺(tái)面上能保持一完全無菌的環(huán)境。如沒有超凈工作臺(tái)，可在接種箱內(nèi)進(jìn)行。三、儀器和藥品儀器：酒精燈，培養(yǎng)皿x2x，手術(shù)剪，手術(shù)鑷x2，漏斗，玻璃離心管，培養(yǎng)瓶，膠頭滴管x2，一次性注射器，燒杯x2，37恒溫箱，離心機(jī)試劑：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（pH約為7.4），DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（含血清），胰蛋白酶 *DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，是在MEM培養(yǎng)基的

4、基礎(chǔ)上研制的。與MEM比較增加了各種成分用量，同時(shí)又分為高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適于生長(zhǎng)較快、附著較困難腫瘤細(xì)胞等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、剪碎從雞蛋內(nèi)取出雞胚，在培養(yǎng)皿中去掉頭和四肢，將軀體剪成3-4塊，用不含血清的培養(yǎng)液清洗，然后轉(zhuǎn)移至另一個(gè)培養(yǎng)皿，剪碎至1mm2的小塊，再清洗，轉(zhuǎn)移至玻璃離心管 2、離心將剪碎的組織和無血清培養(yǎng)液加入玻璃離心管后，用相同的離心管裝入自來水進(jìn)行質(zhì)量配平，供離心用。配平標(biāo)準(zhǔn)為天平的指針穩(wěn)定在標(biāo)盤某刻度，并非必須要在正中間。此次離心時(shí)間約為3分鐘，速度為2000/min 左右3、消化離心后，倒出上層

5、清夜（無菌操作）。加入胰蛋白酶約5ml，在37度恒溫箱內(nèi)進(jìn)行消化。消化時(shí)長(zhǎng)約為15min，每5分鐘振搖一次，發(fā)現(xiàn)試管內(nèi)組織微微泛白，即可停止，然后直接進(jìn)行離心。3000/min,3mins 4、過濾裝瓶離心后，棄去上層清夜（可留部分），加入2-3ml含血清的培養(yǎng)液，吹打，后加入含血清培養(yǎng)液至5-6ml，進(jìn)行過濾（無菌操作）。貼標(biāo)簽，恒溫培養(yǎng)五、預(yù)實(shí)驗(yàn)情況1、熟悉實(shí)驗(yàn)具體內(nèi)容 我組提前兩周進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，在李老師簡(jiǎn)單介紹并進(jìn)行了操作演示后我們開始查閱資料，了解細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟，操作方法，以及所需的儀器和藥品，并開始著手配制培養(yǎng)基和準(zhǔn)備儀器。2、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 賣雞蛋，送恒溫箱保存；清洗儀器(

6、離心管，剪刀鑷子等)，10遍自來水洗，后5遍蒸餾水洗烘干高溫高壓滅菌(蒸)1h左右超凈臺(tái)紫外線照射20min開始實(shí)驗(yàn)3、遇到的問題(1)配液時(shí)胰蛋白酶不溶解決過程：咨詢學(xué)長(zhǎng)學(xué)姐，發(fā)現(xiàn)超聲助溶效果并不好。我們嘗試攪拌子攪拌助溶，經(jīng)過一夜的攪拌，出現(xiàn)白色絮狀沉積，振搖后散開，沒有溶解。咨詢李老師后嘗試緩慢加入胰蛋白酶粉末，溶解效果有所提高，但胰蛋白酶的活性很不好。最終解決辦法：李老師直接購買了液體胰蛋白酶，方便實(shí)用且活性很好。這個(gè)故事告訴我們，光花錢是做不好實(shí)驗(yàn)的，但是不花錢更是做不好實(shí)驗(yàn)的。(2)培養(yǎng)基問題培養(yǎng)基在配置前是粉末狀的，第一次使用的培養(yǎng)基是含酚紅的1640，但由于量不夠，又補(bǔ)充了一些

7、不含酚紅的1640。最后培養(yǎng)基的顏色成橘紅色。而第二次配液時(shí)，1640已全部用完，我組改用不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基。鑒于二班組按照理論值加入酚紅后培養(yǎng)基過紅影響觀察，且考慮到酚紅是用來鑒別酸堿性的，定性不定量，所以我組酚紅并未定量加入，而是采取邊觀察邊加入的方法，保證培養(yǎng)基成色最好。(3)消化時(shí)長(zhǎng)預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)用胰蛋白酶消化組織并離心后剩余的液體常成鼻涕狀，不易分離上清液。查找資料后得知，這是消化過度造成的影響。而后我組在做實(shí)驗(yàn)時(shí)，精確控制消化時(shí)長(zhǎng)，靜置為15分鐘，開搖床為10分鐘。并同時(shí)目視監(jiān)控，一旦發(fā)現(xiàn)組織已泛白即停止消化，保證后續(xù)操作的順利進(jìn)行。效果較好。PS：在后期的實(shí)驗(yàn)中，我發(fā)現(xiàn)胰蛋白

8、酶的活性隨著購買時(shí)間的增長(zhǎng)有明顯的降低，所以對(duì)胰蛋白酶的活性的探究應(yīng)該注明購買時(shí)長(zhǎng)。(4)關(guān)于吹打的操作由于開始做實(shí)驗(yàn)時(shí)很多操作很不熟悉，吹打時(shí)多使用滅菌槍頭。但后來發(fā)現(xiàn)用滅菌槍頭的兩個(gè)弊端。吸培養(yǎng)液時(shí)，培養(yǎng)液容易因吸取過快或傾斜槍體而接觸槍口導(dǎo)致污染。槍頭嘴太小，無法吸入組織塊，吹打很不順利。因此我們分兩次改進(jìn)了儀器，第一次將1000L的槍改為5000L的槍，并用剪刀剪去槍頭尖端，使槍嘴粗大，保證在不出現(xiàn)錯(cuò)誤操作的前提下不會(huì)有污染的發(fā)生。第二次將無菌槍頭徹底改為帶棉塞的膠頭滴管，效果較好。膠頭滴管滅菌徹底，吸收順暢，便于吹打。唯一的缺點(diǎn)就是準(zhǔn)備時(shí)較麻煩，且使用時(shí)要先上膠頭，對(duì)操作者要求較高。

9、 4、錄制視頻我和小麗分別錄制了實(shí)驗(yàn)操作全過程的視頻，但是后來因?yàn)橛X得視頻太過抽象，而且印象不深，沒有重點(diǎn)，經(jīng)商議，我們決定現(xiàn)場(chǎng)演示。5、預(yù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)預(yù)實(shí)驗(yàn)階段共買蛋1次，配制培養(yǎng)基2次，取雞胚4只。每次實(shí)驗(yàn)均可以成功地觀察到細(xì)胞貼壁現(xiàn)象，其中，最后一次實(shí)驗(yàn)由高曉麗同學(xué)觀察到了組織塊貼壁生長(zhǎng)的現(xiàn)象，并以此來對(duì)大家進(jìn)行要求（后來證明其實(shí)并不是組織塊貼壁）。六、帶實(shí)驗(yàn)情況1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 買蛋（感謝李老師），灌裝酒精燈12個(gè)，清洗并滅菌儀器12套，配制充足培養(yǎng)基并過濾，倒置相差顯微鏡的連接，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天早晨紫外殺菌2、實(shí)驗(yàn)時(shí)情況 情況眾多，比較順利 由于條件限制，我們的操作環(huán)境無法保證絕對(duì)無菌，不過因?yàn)榕?/p>

10、養(yǎng)基中加入了雙抗的緣故，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中如果沒有重大的操作失誤是很難長(zhǎng)菌的。但是由于小雞出殼的畫面比較限制級(jí)，還是有很多女生沒有忍住發(fā)出了“啊”和“呃”一類的呼喊，其實(shí)在無菌操作的時(shí)候是不允許說話的 另外因?yàn)樗腥硕际堑谝淮谓佑|活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而且主刀的大部分是男生，力氣比較大，又有些激動(dòng)導(dǎo)致有些雞胚在還沒有出殼時(shí)就被分尸了，之后出殼過程花了很長(zhǎng)時(shí)間?？諝庵斜┞稌r(shí)間越長(zhǎng)，就越容易染菌，還望大家以后注意。 這個(gè)故事告訴我們，人生無論遇到什么事情，都要保證內(nèi)心的平靜，安詳，與矜持3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察 由于我和小麗是一步一步帶著大家做的，所以除了極個(gè)別組出現(xiàn)了一些小問題外，大部分組的細(xì)胞都順利貼壁，且長(zhǎng)勢(shì)良好

11、。 然而絕大部分組的組織塊體積都過大，很少有人按要求剪碎至1mm³后放入培養(yǎng)瓶。導(dǎo)致觀察時(shí)出現(xiàn)了大片的陰影，很難尋找細(xì)胞。 不過我還是順利幫大家找到了組織塊爬出來的細(xì)胞，雖然后來證明那些并不是細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)囧七、創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)初期1、創(chuàng)新本組認(rèn)為，依靠本科生實(shí)驗(yàn)室的條件和我們的自身實(shí)力所能做到的創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)大致上可以分為幾類：對(duì)于既有實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)（如攪拌溶解改為超聲溶解等）對(duì)實(shí)驗(yàn)原理的優(yōu)化（如合成阿司匹林時(shí)反應(yīng)路線的調(diào)整）對(duì)現(xiàn)有高新技術(shù)的重現(xiàn)（如質(zhì)粒DNA的提取等）2、思考過程怎樣制造創(chuàng)新點(diǎn)回想組織塊培養(yǎng)并未成功，希望可以完善本次實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞比較混雜，希望可以提純提純后想要發(fā)揮純化細(xì)胞的作用

12、，進(jìn)行細(xì)胞合成制成單克隆抗體從培養(yǎng)普通細(xì)胞發(fā)展到特殊細(xì)胞，如癌細(xì)胞癌細(xì)胞很好養(yǎng)，既然要研究癌細(xì)胞主要是研究殺滅癌細(xì)胞的有效藥養(yǎng)過二倍體后嘗試單倍體3、創(chuàng)新內(nèi)容因此，我組從中選取了兩項(xiàng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新，即原理優(yōu)化：組織塊培養(yǎng)法的優(yōu)化高新技術(shù)細(xì)胞的無限稀釋克隆細(xì)胞融合癌細(xì)胞的抗藥性實(shí)驗(yàn)純探究性實(shí)驗(yàn)單倍體的體外培養(yǎng)*由我完成的部分用紅色標(biāo)出八、創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中期（一）組織塊培養(yǎng)法的優(yōu)化1、前期思考過程：為了探究原來的方法是否有效，我們選擇在剛接種組織塊時(shí)作對(duì)比觀察。一天后再觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：剛接種后即可觀察到所謂的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，一天后再觀察保持原樣。推測(cè)那些爬出的“細(xì)胞”應(yīng)為組織塊的肌肉纖維，并非真正的組織

13、塊貼壁生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)：如何使固定并牢固接觸培養(yǎng)瓶底部實(shí)驗(yàn)時(shí)經(jīng)常和細(xì)菌組的同學(xué)聊天，偶然的機(jī)會(huì)想到了細(xì)菌組劃板時(shí)使用的瓊脂培養(yǎng)基。由于瓊脂有粘性，又可以溶有養(yǎng)料，適于細(xì)胞培養(yǎng)，故嘗試使用細(xì)菌培養(yǎng)基。2、實(shí)驗(yàn)過程（1）實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：雞蛋儀器等準(zhǔn)備配制不含其它成分的純瓊脂，經(jīng)蒸煮消毒后待用。實(shí)驗(yàn)過程：前期操作同原實(shí)驗(yàn)，將雞胚剪碎并清洗后，準(zhǔn)備培養(yǎng)瓶。瓶預(yù)先加入一層薄薄的瓊脂，以恰好覆蓋住瓶底為合適，瓶不做任何預(yù)處理。當(dāng)瓶中的瓊脂基本晾干凝固后，向兩瓶?jī)?nèi)加入4塊組織塊，同時(shí)向瓶中加入液體瓊脂，使組織塊懸浮于瓊脂中。待兩瓶中的瓊脂全部凝固后，加入適量培養(yǎng)基，培養(yǎng)36小時(shí)后觀察。區(qū)分：瓶：先加瓊脂，再加

14、組織塊，最后加培養(yǎng)基 瓶：先加組織塊，再加瓊脂，最后加培養(yǎng)基 目的：無論哪種做法目的都是使組織塊可以固定在瓶底，使組織塊更好地貼壁生長(zhǎng)結(jié)果觀察：兩瓶中的組織塊均已固定，其中瓶的組織塊嵌在瓊脂表面，瓶的組織塊嵌入瓊脂中，類似細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的位置。但兩瓶組織塊均未貼壁生長(zhǎng)。推測(cè)原因：瓶：接觸面不夠硬，若要組織塊貼壁生長(zhǎng)，則需要堅(jiān)硬平滑的平面為依靠。瓶：接觸不到任何面，沒有生長(zhǎng)空間結(jié)果：瓊脂培養(yǎng)法失?。?）實(shí)驗(yàn)二新的設(shè)計(jì)：根據(jù)失敗的教訓(xùn)我們有了新的想法，既然目的是使組織塊貼在培養(yǎng)瓶底部，那我們就讓它直接貼上好了。新的實(shí)驗(yàn)：前期操作同原實(shí)驗(yàn)，將雞胚剪碎并清洗后，同時(shí)向瓶和瓶?jī)?nèi)加入4塊組織塊，要求組織塊

15、之間要有一定距離。同時(shí)向瓶中加入極少量培養(yǎng)基。將兩瓶放入37恒溫箱保存5小時(shí)后再進(jìn)行處理。五小時(shí)后，組織塊都已粘附在培養(yǎng)瓶底部，此時(shí)加入適量培養(yǎng)基，緩慢將培養(yǎng)瓶放入恒溫箱，36小時(shí)后觀察。（此方法靈感來源于上圖的反轉(zhuǎn)干固法）結(jié)果觀察：兩瓶中的組織塊均已固定，且均已貼壁生長(zhǎng)瓶（加入少量培養(yǎng)基）的操作是避免細(xì)胞失水，但發(fā)現(xiàn)如果時(shí)間控制較好，瓶（未加入培養(yǎng)基）也可避免失水現(xiàn)象發(fā)生?？梢园l(fā)現(xiàn)此時(shí)的組織塊貼壁生長(zhǎng)和之前的有明顯的不同（二）癌細(xì)胞的抗藥性實(shí)驗(yàn)1、前期思考實(shí)驗(yàn)構(gòu)想：個(gè)人覺得細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)很成熟的生物技術(shù)，糾結(jié)于研究培養(yǎng)基不加血清的影響或者改變培養(yǎng)基pH等的影響已經(jīng)意義不大，其結(jié)果顯而易見，勢(shì)

16、必要劣于原來的方案，因?yàn)樵桨概c人體體內(nèi)環(huán)境最為相似。 因此我想嘗試一些新的想法，或者說想做一些結(jié)果出來后真的對(duì)其他人有幫助的實(shí)驗(yàn)。而非執(zhí)著于優(yōu)化某一流程。所以想到了癌細(xì)胞培養(yǎng)，和癌細(xì)胞抗藥性的實(shí)驗(yàn)。2、實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：癌細(xì)胞（人體肺癌細(xì)胞、來自常志靜） 植物藥粗提物與精提物各11種（來自張文靜學(xué)姐陳海霞老師實(shí)驗(yàn)室96孔板（李振莉老師提供）一次性塑料培養(yǎng)瓶（來自常志靜學(xué)姐）其他實(shí)驗(yàn)器材，如微量移液器和槍頭等（公用實(shí)驗(yàn)室、自己準(zhǔn)備） MTT試劑（常志靜學(xué)姐小組友情提供）（1）前期 拿到癌細(xì)胞后培養(yǎng)24h更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24h傳代至三瓶培養(yǎng)24h更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24h上板遇到問題 1、消化問

17、題 貼壁后的癌細(xì)胞消化時(shí)間相當(dāng)長(zhǎng)，與對(duì)面實(shí)驗(yàn)室的半分鐘相比，本實(shí)驗(yàn)消化五分鐘后才可見癌細(xì)胞脫落?？紤]是由于胰蛋白酶放置時(shí)間過長(zhǎng)，活性降低導(dǎo)致。 目前沒有較好的解決辦法。圖為同樣消化半分鐘，不同實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞的對(duì)比（上圖為本實(shí)驗(yàn)，下圖為常志靜學(xué)姐的實(shí)驗(yàn)）。可以看出，同一株癌細(xì)胞分化出的細(xì)胞消化差別如此之大，可以說明應(yīng)該是胰蛋白酶的問題2、癌細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì) 雖同時(shí)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期傳代，但傳代后長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)差異較大，傳代36h后，四瓶瓶底已鋪滿，兩瓶還正在貼壁生長(zhǎng)。 考慮加入細(xì)胞的量不同會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期造成影響。例如加入過少細(xì)胞不利于成活，加入過多細(xì)胞不利于貼壁等。 解決辦法，消化離心后，充分吹打，并等量加至各個(gè)培養(yǎng)

18、瓶。（2）中期選取長(zhǎng)勢(shì)良好的培養(yǎng)瓶消化離心棄去上清液加入新鮮培養(yǎng)基充分吹打，混勻取40L進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)其余上板（96孔板，上60孔）恒溫培養(yǎng)24h更換新鮮培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)24h上藥上藥：我們共有11個(gè)樣品，其中包含黃酮，皂苷等抗癌成分。為了可以充分了解最適藥物濃度。我們初期設(shè)想為每種藥品設(shè)置5個(gè)濃度梯度，3個(gè)時(shí)間梯度，和2個(gè)平行組。共11x5x3x3=495孔。鑒于數(shù)量太大，我們將濃度梯度改為三個(gè)。分別是0.1g/mL，1g/mL，10g/mL遇到問題1、藥物溶解樣品中的大部分中藥有效成分的都是不溶于水的，一般我們用乙醇或DMSO溶解。但在溶解過程中發(fā)現(xiàn)加入適量DMSO助溶且藥物完全溶解后，再加入

19、培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，推測(cè)為藥物析出，此時(shí)進(jìn)行無菌過濾勢(shì)必要造成藥物的損失。這時(shí)我們分別采用了微熱，超聲助溶等方法，由于藥物儲(chǔ)備液（而非稀釋后的待用藥液）濃度較高，均沒有很好的效果。最后決定加過量DMSO，其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響我們會(huì)同步記錄在其中。另一種想法是在配置儲(chǔ)備液時(shí)并不進(jìn)行無菌過濾，而當(dāng)加藥品時(shí)經(jīng)稀釋后再進(jìn)行過濾。但由于不能確定目視不可見的藥物析出是否存在于藥液中，為了避免風(fēng)險(xiǎn)，并沒有采納這一方法。2、細(xì)胞染菌由于是公共實(shí)驗(yàn)室，所以37恒溫箱是很多人共用的。以至于出現(xiàn)了細(xì)菌和細(xì)胞養(yǎng)在同一個(gè)箱子里的神奇一幕。當(dāng)時(shí)一個(gè)學(xué)長(zhǎng)聽說我們之前的細(xì)胞沒染過菌之后說，這簡(jiǎn)直就是個(gè)奇跡！不過由于以前使用的儀器都

20、是密封的如離心管、培養(yǎng)瓶等，隔絕細(xì)菌的能力很強(qiáng)。但這次使用的96孔板板蓋只是輕輕覆在上面，非常容易飛進(jìn)細(xì)菌。為了避免染菌我們已經(jīng)舍棄了周圍一圈孔，并在上板后用封口紙密封，但是我們上的前兩塊板，一塊全部染菌，一塊僅正中間5個(gè)孔幸免于難。 解決辦法：經(jīng)過跟李老師商討后，得到了用滅菌后的飯盒創(chuàng)造一個(gè)無菌小環(huán)境的建議，頗為可行，這也是目前階段最好的辦法了。（3）后期上藥后恒溫培養(yǎng)24h后MTT檢測(cè)48h后MTT檢測(cè)72h后MTT檢測(cè)繪圖得出結(jié)果該實(shí)驗(yàn)在還差最后一步時(shí)由于種種原因提前宣告結(jié)束，但是我在八月份重啟了一個(gè)類似的課題，下文將詳細(xì)講解（三）單倍體（精子）的體外培養(yǎng)前言：看了前面的文字大家應(yīng)該已經(jīng)

21、了解我的實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)就在癌細(xì)胞的植物藥拮抗作用上了，精子的體外培養(yǎng)對(duì)于我來說完全是一個(gè)實(shí)驗(yàn)之余自娛自樂的事情。不過，由于沒有查到關(guān)于精子體外培養(yǎng)的資料（一般都是凍存），所以這是一個(gè)完全自己探索的領(lǐng)域。 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：新鮮活性精子（自備）顯微鏡 載玻片 各種濃度酸堿及生理鹽水 細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)儀器活性判別標(biāo)準(zhǔn)： 流動(dòng)性（自定） 由于精細(xì)胞實(shí)在太小，無法判別形態(tài)特征，因此以其流動(dòng)性為判別標(biāo)準(zhǔn)。精細(xì)胞由視野左移動(dòng)到視野右，在最具活力時(shí)需要2秒左右，這個(gè)時(shí)間隨著體外放置時(shí)間的延長(zhǎng)而延長(zhǎng)。標(biāo)尺：加入精子后，培養(yǎng)瓶恒溫培養(yǎng)，48h后失去活性。實(shí)驗(yàn)過程：分離，加入離心試管后加少量生理鹽水，3000r/min離心5分鐘

22、，棄去上清液，加五毫升生理鹽水，分裝3瓶。其中一瓶加入1MHCL，10%，一瓶加入1MNaOH,10%,一瓶空白。三瓶均恒溫培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)，酸堿組在10分鐘后即出現(xiàn)反應(yīng)，精子活力明顯下降，30后完全喪失活動(dòng)能力。生理鹽水組可以存活15-20小時(shí)左右。分為兩組，一組分離后分裝2瓶，分別加入帶血清和不帶血清的培養(yǎng)基，另有一組不做離心進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，帶血清組存活72h，無血清組存活40h，原裝組存活48h。由此知，精子在體外存活也需要攝取養(yǎng)分。而最大限度模擬人體內(nèi)環(huán)境還是有利于精子存活的。上網(wǎng)查資料知，精子在女性體內(nèi)（微堿性）可存活三至四天，因此通過在培養(yǎng)基中加入NaHCO3調(diào)節(jié)pH獲得了pH為

23、7.5，7.7,8.0三組培養(yǎng)基。培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，存活時(shí)間幾乎都為72小時(shí)，很難再延長(zhǎng)。由此知人體內(nèi)環(huán)境有很多成分和影響因素還不為人所知，如果想百分之百模擬還需要大量的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)實(shí)驗(yàn)可知，精子在體外長(zhǎng)時(shí)間存活幾乎不可能，最可靠的方法就是凍存。若是想要體外存活，原封不動(dòng)或加入培養(yǎng)基是最好的方法，當(dāng)然要保證溫度和濕度。不過由于不同批次的精子活力略有差異，所以不同實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果沒有橫向可比性。九、創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)后期我很有幸地在暑假來到了天津中醫(yī)藥大學(xué)科研中心進(jìn)行實(shí)習(xí)。在做了數(shù)天藥分實(shí)驗(yàn)后，被分到了生化組，兩天后領(lǐng)到了一個(gè)課題。由于這個(gè)課題和我之前做的實(shí)驗(yàn)非常類似，可以說是之前實(shí)驗(yàn)的一個(gè)延續(xù)。所以我參與其

24、中進(jìn)行了課題中的部分相關(guān)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好并得到了老師的肯定。附相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容續(xù)斷屬基于雌激素受體通路的活性篩選目的：從雌激素受體（ER）的作用途徑進(jìn)行續(xù)斷的活性篩選。方法：將中藥材續(xù)斷中分離得到的單體配成不同濃度的溶液作用于MCF-7細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖率；將含有ERE原件的外源基因通過脂質(zhì)體導(dǎo)入Hela細(xì)胞，加藥作用后通過檢測(cè)Firefly luciferase/ Renila luciferase的比值來判斷藥物是否激活了ERs。實(shí)驗(yàn)提取物共有4種，我負(fù)責(zé)了其中兩種的活性測(cè)定材料與方法1 實(shí)驗(yàn)材料1.1 細(xì)胞株來源Hela細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）購自上海細(xì)胞生物研究所。MCF-7(ERa+, E

25、Rb+)乳腺癌細(xì)胞株購自上海細(xì)胞生物研究所。1.2 主要試劑試劑名稱來源雌二醇胎牛血清（FBS）活性炭處理胎牛血清（CS-FBS）ICI 182,780（ICI）DMEM 和無酚紅DMEM二甲基亞砜（DMSO）LB培養(yǎng)基二硫蘇糖醇（DTT）ATPCoelentrazineBeetle Luciferin Potassium SaltPassive Lysis 5X BufferLipofectamine 2000 Reagent質(zhì)粒提試劑盒MTT 250mg粉末Sigma公司Hyclone公司Kibbutz belt haemek公司Tocris公司Sigma公司Amresco公司上海生工生物

26、科技公司美國Invitrogen公司美國Invitrogen公司Promega公司Promega公司Promega公司Promega公司TIANGEN公司Sigma公司1.3 受試藥物（前期系統(tǒng)分離得到的單體成分）表2-1 從續(xù)斷中分離得到的單體成分化合物類型化合物中文名稱化合物英文名稱三萜皂苷木通皂苷D次苷1次苷2常春藤皂苷元Akebia saponin DTimes glycosides1Times glycosides2Ivy sapogenin以上單體成分純度均為95%以上。紅色為我負(fù)責(zé)的化合物1.4 主要儀器多功能讀板機(jī) Felex station 3 美國MD 公司 小型臺(tái)式離心機(jī)

27、 Microfuge 22R 美國Beckman公司臺(tái)式冷凍離心機(jī) 64R 美國Beckman公司小型離心機(jī) Minispin 德國Eppendorf公司CO2培養(yǎng)箱 3111型 美國Thermo公司-80低溫冰箱 MDF-382E 日本Sanyo公司-40低溫冰箱 MDF-U5410 日本Sanyo公司2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞從液氮中取出后，直接放入3740溫水中，迅速搖動(dòng)并不斷觀察融化情況，避免溫度過高使細(xì)胞損傷。然后在無菌條件下，吸出細(xì)胞凍存液，移至離心管并加入DMEM全培養(yǎng)液。8001000rpm離心，去除上清液，再重復(fù)用培養(yǎng)液洗滌一次。加入足量培養(yǎng)液輕輕吹打成為細(xì)胞懸液，移入培養(yǎng)瓶（接種密度為5×105/ml），置于5%CO2、95%空氣、37、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)已有的細(xì)胞倍增時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞消化和傳代，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或接近鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底面后，吸棄瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，加入0.25的胰蛋白酶液和0.02的EDTA液，之后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液浸過細(xì)胞表面，置于37培養(yǎng)箱，消化1分鐘后將培養(yǎng)瓶放置在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化，吸棄