生物制品檢驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)

1、本科生課程實(shí)驗(yàn)（ 生物工程 專業(yè) 10年級 1班 ）實(shí)驗(yàn)名稱生物制品基本成分測定姓名：王帆同組人姓名：王兆、莊琳、盧揚(yáng)、梁美蘭二一二年十一月 目錄一、緒論1二、實(shí)驗(yàn)92-1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?92-2實(shí)驗(yàn)原理92-3儀器藥品102-4實(shí)驗(yàn)步驟102-5數(shù)據(jù)記錄與處理132-6結(jié)果與討論142-7結(jié)束語15三、參考文獻(xiàn)15 一、緒論生物制品中文名稱：生物制品英文名稱：biological product定義：一類用于疾病診斷或防治的制劑。生物制品是應(yīng)用普通的或以基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及各種動(dòng)物和人源的組織和液體等生物材料制備的，用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥

2、品。 生物制品不同于一般醫(yī)用藥品，它是通過刺激機(jī)體免疫系統(tǒng),產(chǎn)生免疫物質(zhì)（如抗體）才發(fā)揮其功效，在人體內(nèi)出現(xiàn)體液免疫、細(xì)胞免疫或細(xì)胞介導(dǎo)免疫。生物制品的種類：根據(jù)采用的材料、制法或用途不同，可分為六類：疫苗類藥物、抗毒素及抗血清類藥物、血液制品、重組DNA制品、診斷制品以及其他制品。生物制品是藥品的一大類別，但生物制品的其實(shí)材料都具有生物活性、其制備過程是無菌操作的生物學(xué)過程，并以生物學(xué)技術(shù)和分析技術(shù)來控制其原料，中間品及成品的質(zhì)量。因此，應(yīng)根據(jù)生物制品生產(chǎn)和質(zhì)量管理的固有特性，對生物制品的特殊要求進(jìn)行規(guī)定。藥品：指用于預(yù)防、治療、診斷人的疾病，有目的地調(diào)節(jié)人的生理機(jī)能并規(guī)定有適應(yīng)癥，用法和用

3、量的物質(zhì)。（包括材料、重要飲片、中成藥、化學(xué)原料及其制劑、抗生素、生化藥品、放射性藥品、血清制品和診斷藥品等）生物制品檢驗(yàn)技術(shù)生物制品檢驗(yàn)的性質(zhì)和任務(wù)性質(zhì)：用化學(xué)、物理化學(xué)或生物化學(xué)的方法和技術(shù)來研究生物制品的質(zhì)量及其控制方法，是一門研究和開發(fā)生物制品及其質(zhì)量控制的“技術(shù)學(xué)科”。主要包括：生物制品形狀的檢測、生物制品化學(xué)組成的檢測、物制品雜質(zhì)限量的檢測、生物制品含量的檢測等。 任務(wù)：生物制品的常規(guī)檢驗(yàn)：以“生物制品質(zhì)量全面監(jiān)控”為中心，開展生物制品質(zhì)量檢驗(yàn) 成品檢驗(yàn)(原料,制劑) 生產(chǎn)過種種質(zhì)量控制(中間體),優(yōu)化工藝 貯藏過程中的質(zhì)量控制(穩(wěn)定性考察) 為新制品研究開發(fā)提供科學(xué)的質(zhì)量控制方法

4、 新制品開發(fā)及新劑型質(zhì)量及穩(wěn)定性研究 天然產(chǎn)物活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)確證 現(xiàn)代生物計(jì)數(shù)所研制的生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究由于生物制品具有：分子量不是定值、生化法結(jié)構(gòu)確證、需檢查生物活性、要求安全性檢查、需做效價(jià)測定的特點(diǎn)。其化學(xué)性質(zhì)與生物學(xué)性質(zhì)都很不穩(wěn)定，又易受微生物污染，故對生物制品的均一性、有效性、安全性和穩(wěn)定性等應(yīng)有嚴(yán)格要求，以生產(chǎn)出具有藥理活性高、針對性強(qiáng)、毒性低、副作用小，療效可靠及營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)的安全、高效的生物制品。為此，必須進(jìn)行原材料、生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品的全程質(zhì)量檢驗(yàn)、控制，以確保產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。分子量不是定值：大部分生物制品的活性組分均為大分子的生命物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、

5、多糖類等）。組分相同，但相對分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性，因此常需進(jìn)行相對分子量的測定。生化法結(jié)構(gòu)確證：由于有效結(jié)構(gòu)或分子量不確定，其結(jié)構(gòu)的確證很難沿用化學(xué)藥物或結(jié)構(gòu)已知的生化藥物所常用的方法，還需要生物化學(xué)分析如：氨基酸組成、N末端氨基酸序列、肽圖等需檢查生物活性：生物制品對熱、酸、堿、重金屬及pH等變化敏感，各種理化因素的變化易對生物活性產(chǎn)生影響。特別是多肽和蛋白質(zhì)。除理化分析，還需生物檢定，防止蛋白質(zhì)失活要求安全性檢查：物制品組分復(fù)雜，有效成分濃度很低，生物大分子雜質(zhì)含量比較高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，易引入特殊雜質(zhì)和污染物。如重組乙型肝炎疫苗涉及的安全性檢查包括：細(xì)胞外源因子檢查、原液、半成品

6、、成品中有關(guān)血清白蛋白殘留量、CHO細(xì)胞DNA殘留量檢查、熱原檢查、過敏試驗(yàn)、異常毒性檢查等。需做效價(jià)測定 ：對于生物制品有效成分的檢測，除應(yīng)有一般化學(xué)方法或理化分心進(jìn)行有效成分含量測定外，更應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的特異生理效應(yīng)或?qū)Ｒ换磻?yīng)擬定其專屬性的生物效價(jià)測定方法，以表征其所含生物活性成分的含量。生物制品批簽發(fā)管理辦法規(guī)定：對每一批次的疫苗類制品、血液制品、用于血源篩查的體外生物診斷試劑以及國家食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定的其他生物制品，在出廠上市或者進(jìn)口時(shí)進(jìn)行強(qiáng)制性檢驗(yàn)、審核。檢驗(yàn)不合格或者審核不被批準(zhǔn)者，不得上市或者進(jìn)口。課程實(shí)驗(yàn)此次生物制品檢驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)主要包括生物制品中水分的測定、生物制品中蛋白質(zhì)含

7、量的測定、氨基酸的分離鑒定。生物制品中水分、蛋白質(zhì)、氨基酸的基本研究水分測定：水分：干燥制品中水分含量的高低，直接會影響凍干制品的質(zhì)量和保存效期。凍干血漿水分含量越低越好，能使保存期延長，不易變性?；罹绾窟^高，易造成活菌死亡或蛋白質(zhì)變性使制品失效。但含水量過低，能使菌體脫水，同樣會造成活菌死亡，降低效力。直接干燥法：基于生物制品中的水分受熱后，產(chǎn)生的蒸汽壓高于空氣在電熱干燥箱中的分壓，使制品中的水分蒸發(fā)出來，同時(shí)，由于不斷的加熱和排走水蒸氣，而達(dá)到完全干燥的目的，制品干燥速度取決于整個(gè)壓差的大小。 測定時(shí)樣品必須磨碎，全部經(jīng)過2040目篩，混勻。在磨碎過程中，要防止樣品水分含量變化。一般

8、水分在14%以下時(shí)稱為安全水分，即在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行粉碎過篩等處理，水分含量一般不會發(fā)生變化。但要求動(dòng)作迅速。制備好的樣品存于干燥潔凈的磨口瓶中備用。測定時(shí)，要精確稱取上述樣品210 g（視樣品性質(zhì)和水分含量而定），置于已干燥、冷卻并稱至恒重的有蓋稱量瓶中，移入95105常壓烘箱中，開蓋24小時(shí)后取出，加蓋置干燥內(nèi)冷卻0.5小時(shí)后稱重。再烘1小時(shí)左右，又冷卻0.5小時(shí)后稱重。重復(fù)此操作，直至前后兩次質(zhì)量差不超過2mg即算恒重。本實(shí)驗(yàn)采用直接干燥法！卡爾費(fèi)休法：1935年由卡爾費(fèi)休提出，采用I2、SO2、吡啶、無水CH3OH（含水量在0.05%以下）配制成試劑，測定出試劑的水當(dāng)量，在試劑與樣品中

9、的水進(jìn)行反應(yīng)后，通過計(jì)算試劑消耗量而計(jì)算出樣品中水含量，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織把這個(gè)方法定為測微量水分國際標(biāo)準(zhǔn)，我們國家也把這個(gè)方法定為國家標(biāo)準(zhǔn)測微量水分。 1、 原理：在水存在時(shí)，即樣品中的水與卡爾費(fèi)休試劑中的SO2與I2產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)。 I2 + SO2 + 2H2O 2HI + H2SO4 此反應(yīng)是可逆反應(yīng)，當(dāng)硫酸濃度達(dá)到0.05%以上時(shí)，即能發(fā)生逆反應(yīng)。若要讓反應(yīng)按照一個(gè)正方向進(jìn)行，需要加入適當(dāng)?shù)膲A性物質(zhì)以中和反應(yīng)過程中生成的酸。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，在體系中加入吡啶，這樣就可使反應(yīng)向右進(jìn)行。 2、 3 C5H5N+H2O+I2+SO2 2氫碘酸吡啶 + 硫酸酐吡啶 生成硫酸酐吡啶不穩(wěn)定，能與水發(fā)生反

10、應(yīng)，消耗一部分水而干擾測定，為了使它穩(wěn)定，可加無水甲醇。 3、 硫酸酐吡啶 + CH3OH（無水） 甲基硫酸吡啶 4、 上面三步反應(yīng)寫成總反應(yīng)式為：I2+SO2+H2O+3吡啶+CH3OH 2氫碘酸吡啶+甲基硫酸吡啶 5、 從反應(yīng)式可以看出1mol水需要1mol碘，1mol二氧化硫和3mol吡啶及1mol甲醇而產(chǎn)生2mol氫碘酸吡啶、1mol甲基硫酸吡啶。這是理論上的數(shù)據(jù)，但實(shí)際上，SO2、吡啶、CH3OH的用量都是過量的，反應(yīng)完畢后多余的游離碘呈現(xiàn)紅棕色，即可確定為到達(dá)終點(diǎn)。 6、 I2SO2C5H5N = 1310 卡爾費(fèi)休試劑的配制與標(biāo)定 若以甲醇作溶劑，則試劑中I2、SO2、C5H5N

11、（含水量在0.05%以下）三者的克分子數(shù)比例為：I2SO2C5H5N = 1310 這種試劑有效濃度取決于碘的濃度。新配制的試劑其有效濃度不斷降低，其原因是由于試劑中各組分本身也含有一些水分，但試劑濃度降低的主要原因是由一些副反應(yīng)引起的，較高消耗了一部分碘。 這也說明了配制這種試劑要單獨(dú)配，分甲乙兩種試劑并且分別貯存，臨用時(shí)再混合，而且要標(biāo)定。但目前我國市場上使用的卡爾費(fèi)休水份測定試劑，無論是單組份的，還是雙組份的一般都由廠家已經(jīng)調(diào)配好的可直接使用產(chǎn)品，但由于卡爾費(fèi)休試劑是一種很不穩(wěn)定的混合物質(zhì)，因此用戶在使用時(shí)都必須進(jìn)行標(biāo)定，以測定其真實(shí)的水當(dāng)量數(shù)據(jù)?？栙M(fèi)休法測定水份，需要注意如下幾點(diǎn)：

12、此法適用于多數(shù)有機(jī)樣品，包括食品中糖果、巧克力、油脂、乳糖和脫水果蔬類等樣品； 樣品中有強(qiáng)還原性物料，包括維生素C的樣品不能測定；樣品中含有酮、醛類物質(zhì)的，會與試劑發(fā)生縮酮、縮醛反應(yīng)，必須采用專用的醛酮類試劑測試。對于部分在甲醇中不溶解的樣品，需要另尋合適的溶劑溶解后檢測，或者采用卡氏加熱爐將水份汽化后測定。 卡爾費(fèi)休法不僅可測得樣品中的自由水，而且可測出結(jié)合水，即此法測得結(jié)果更客觀地反映出樣品中總水分含量。 固體樣品細(xì)度以40目為宜，最好用粉碎機(jī)而不用研磨，防止水分損失。蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)是含氮有機(jī)物，自然界中的蛋白質(zhì)含氮比較穩(wěn)定，平均含量約為36%，即，100克蛋白質(zhì)平均含氮16克。因此在測定

13、生物樣品的蛋白質(zhì)含量時(shí)，可先測定樣品中的含氮量，再乘以系數(shù)6.25，便可以換算成蛋白質(zhì)含量。目前測定蛋白質(zhì)含量常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法(Biuret)、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法（ Bradford）、Folin酚試劑法。這五種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)。各種蛋白質(zhì)含量測定方法比較 方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說明凱氏定氮法靈敏度低，使用于0.2-1.0mg氮，誤差為±2%費(fèi)時(shí)，8-10小時(shí)，但如果采用凱氏定氮儀，縮短時(shí)間至4個(gè)小時(shí)將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨氣，然后用酸吸收滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測定，干擾

14、少，費(fèi)時(shí)，如果采用凱氏定氮儀，就會大大縮短定氮時(shí)間雙縮脲法靈敏度低，1-20mg中速20-30分鐘多肽鍵+堿性Cu2+紫色絡(luò)合物硫酸銨：Tris緩沖液，某些氨基酸用于快速測定，但不靈敏，不同蛋白質(zhì)顯色相似紫外吸收光法較為靈敏，50-100微克快速5-10分鐘蛋白質(zhì)中的絡(luò)氨酸和色氨酸殘基在280nm處德光吸收各種嘌呤和各種核苷酸用于層析柱流出液的檢測，核酸的吸收可以校正考馬斯亮藍(lán)法靈敏度最高，1-5微克快速5-15分鐘考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其max由465nm變?yōu)?95nm強(qiáng)堿性緩沖液，TritonX-100SDS最好的方法，干擾物質(zhì)少，顏色穩(wěn)定，靈敏度高顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化Foli

15、n酚試劑法靈敏度高，<5微克慢速40-60分鐘雙縮尿反應(yīng)，磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸銨，Tris緩沖液，甘氨酸，各種硫醇耗費(fèi)時(shí)間長；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化雙縮脲法：實(shí)驗(yàn)操作簡便迅速,但其缺點(diǎn)是靈敏度較低,蛋白質(zhì)量須在120mgPmL 時(shí)測定結(jié)果較準(zhǔn)確。雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。紫外吸收法：簡便、靈敏、快速,不消耗樣品,測定后仍能回收使用。此法測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差,干擾物質(zhì)較多,在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時(shí),對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差,故本法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋

16、白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì),會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表,再進(jìn)行計(jì)算的方法加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經(jīng)過校正,測定的結(jié)果還是存在一定的誤差?？捡R斯亮藍(lán)法：該法方法簡便,易于操作,所用試劑較少,顯色劑易于配制。干擾物質(zhì)少,如糖、緩沖液、還原劑和絡(luò)合劑等均不影響顯色。此法的缺點(diǎn)是由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此Bradford 法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用- 球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),以減少這方面的偏差。Folin法：優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多。缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間

17、較長，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。而且，耗費(fèi)時(shí)間長，操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)，顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。凱氏定氮法：適用范圍廣泛，測定結(jié)果準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí),試劑消耗量大。凱氏定氮法：蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。 （1）有機(jī)物中的胺根在強(qiáng)熱和CuSO4，濃H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4 反應(yīng)式為： CuSO4 +2NH2+H2S04+2H+(NH4)

18、2S04 （2）在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中 反應(yīng)式為: (NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O （3）用已知濃度的H2SO4（或HCI）標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)HCI消耗的量計(jì)算出氮的含量，然后乘以相應(yīng)的換算因子，既得蛋白質(zhì)的含量 反應(yīng)式為： (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO3氨基酸（Amino acid）：構(gòu)成蛋白質(zhì)(protein)的基本單位，是含有氨基的羧酸，賦予蛋

19、白質(zhì)特定的分子結(jié)構(gòu)形態(tài)，使它的分子具有生化活性。生物體內(nèi)的各種蛋白質(zhì)是由20種基本氨基酸構(gòu)成的。除甘氨酸外均為L氨基酸其中（脯氨酸是一種L亞氨基酸），其結(jié)構(gòu)通式如圖（R基為可變基團(tuán)）。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸都是一類含有羧基并在與羧基相連的碳原子下連有氨基的有機(jī)化合物，目前自然界中尚未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中有氨基和羧基不連在同一個(gè)碳原子上的氨基酸。除甘氨酸外，其它蛋白質(zhì)氨基酸的碳原子均為不對稱碳原子（即與碳原子鍵合的四個(gè)取代基各不相同），因此氨基酸可以有立體異構(gòu)體，即可以有不同的構(gòu)型（D型與L型兩種構(gòu)型）。 氨基酸結(jié)構(gòu)通式紙層析法（paper chromatography）依據(jù)極性相似相容原理，是以濾紙纖維的

20、結(jié)合水為固定相，而以有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。由于樣品中各物質(zhì)分配系數(shù)不同，因而擴(kuò)散速度不同，從而達(dá)到分離的目的。紙層析法是生物化學(xué)上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定。紙層析法又稱紙色譜法，是用濾紙為支持物，所用展層溶劑大多由水和有機(jī)溶劑組成，濾紙纖維與水的親和力強(qiáng)，與有機(jī)溶劑的親和力弱，因此在展層時(shí)，紙纖維上吸附的水分是固定相，有機(jī)溶劑是流動(dòng)相。溶劑由下向上移動(dòng)的，稱上行法；由上向下移動(dòng)的，稱下行法。一般操作是將樣品溶解在適當(dāng)溶劑中，點(diǎn)樣在濾紙的一端；再選用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)，從點(diǎn)樣的一端通過毛細(xì)現(xiàn)象向另一端進(jìn)行展層，樣品中的各種氨基酸在兩相溶劑中不斷進(jìn)行

21、分配。由于它們的分配系數(shù)不同，不同氨基酸隨流動(dòng)相移動(dòng)的速率就不同，于是就將這些氨基酸分離開來，形成距原點(diǎn)距離不等的層析點(diǎn)。展開完畢，取出濾紙晾干或烘干，再以適當(dāng)?shù)娘@色劑或紫外燈、熒光燈下觀察其圖譜。根據(jù)組分移動(dòng)距離（Rf值）與已知樣比較，進(jìn)行定性。紙層析法可分為一般紙層析法，圓形紙層析法、反相紙層析法和雙向紙層析法等。將樣品點(diǎn)在濾紙上(此點(diǎn)稱為原點(diǎn))，溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速率用Rf值表示：v：v v 在一定條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、溫度、濕度、層析濾紙的型號和質(zhì)量等因素有關(guān)。只要條件(如溫度、展層溶劑的組成)不變，Rf值是常數(shù)，故可根據(jù)Rf值作定性判

22、斷。樣品中如有多種氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此時(shí)如只用一種溶劑展層，就不能將它們分開。為此，當(dāng)用一種溶劑展層后，將濾紙轉(zhuǎn)動(dòng)90度，再用另一溶劑展層，從而達(dá)到分離目的，這種方法稱為雙向紙層析法。氨基酸無色，可利用茚三酮顯色反應(yīng)，將氨基酸層析點(diǎn)顯色作定性、定量用。氨基酸與茚三酮水合物在弱酸條件下共加熱時(shí)，氨基酸被氧化脫氨、脫羧，而茚三酮水合物被還原，其還原物可與氨基酸加熱分解產(chǎn)生的氨結(jié)合，再與另一分子茚三酮縮合成為藍(lán)紫色化合物，稱為羅曼紫（Ruhemann's purple）。所有氨基酸及具有游離-氨基的肽與茚三酮反應(yīng)都產(chǎn)生藍(lán)紫色物質(zhì)，只有脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生（

23、亮）黃色物質(zhì)。茚三酮顯色反應(yīng)受溫度、pH，時(shí)間影響較大。如果要使結(jié)果重復(fù)，必須嚴(yán)格控制上述條件。樣品中如含有大量鹽酸會使氨基酸不顯出顏色。樣品中含大量鹽時(shí)顯色點(diǎn)上會出現(xiàn)白斑，空氣中其它的雜質(zhì)如氨，硫化氫或酚等皆會影響顯色結(jié)果。銅離子可以與氨基酸-茚三酮顯色物形成絡(luò)合物，顏色較穩(wěn)定，用硫酸銅乙醇溶液洗脫層析后的顯色斑點(diǎn)，可以通過比色法定量測定氨基酸含量。由于紙上層析設(shè)備條件較簡單，操作比較簡便，并可以分離微量樣品，因此紙層析方法已成為生化分析和研究的主要方法之一，廣泛應(yīng)用于氨基酸、肽、核苷酸，糖、維生素以及脂肪酸等的分離鑒定。二、實(shí)驗(yàn)2-1實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)一 生物制品中水分的測定，掌握直接干燥法原理

24、及方法實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)含量的測定，了解凱氏定氮法的原理及操作流程實(shí)驗(yàn)三 學(xué)習(xí)氨基酸的分離與鑒定，了解紙層析法的原理和操作方法2-2實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)一 生物制品中水分的測定此次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用直接干燥法測量奶粉中水分的含量。其原理基于生物制品中的水分受熱以后,產(chǎn)生的蒸汽壓高于空氣在電熱干燥箱重中的分壓,使制品中的水分蒸發(fā)出來,同時(shí),由于不斷的加熱和排走水蒸汽,而達(dá)到完全干燥的目的,制品干燥的速度取決于整個(gè)壓差的大小5。實(shí)驗(yàn)二 生物制品中蛋白質(zhì)含量的測定此次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用經(jīng)典的凱氏定氮法測量蛋白質(zhì)含量，其原理是樣品用濃硫酸消化時(shí)，其中的含氮有機(jī)物分解放出氨，氨與硫酸化合生成硫酸銨。在消化時(shí)常加入硫酸銅和硫酸鉀作催化

25、劑，以加速分解速度并提高消化的溫度。消化完畢，加入強(qiáng)堿使消化液中的硫酸銨分解，放出氨。利用蒸汽蒸餾法，用硼酸溶液吸收蒸餾出來的氨，氨與硼酸溶液中的氫離子結(jié)合生成離子，使吸收液中的氨離子濃度下降，然后用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定，使吸收液中的氫離子恢復(fù)到原先的濃度，即可從消耗的酸量，計(jì)算樣品中的含氮量。樣品消化，蒸餾的化學(xué)反應(yīng)可歸納如下16：(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O實(shí)驗(yàn)三 氨基酸的分離鑒定紙層析法此次試驗(yàn)運(yùn)用紙層析法，其原理是用濾紙作為惰性支持物，層析溶劑由有機(jī)溶劑和水組成的物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值（比移）來表示的：Rf=原點(diǎn)到層析中心的距離/原點(diǎn)到層

26、析劑前沿的距離在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)10。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本試驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸11。2-3材料與試劑：實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)樣品：實(shí)驗(yàn)樣品為奶粉。器材：電子天平，烘箱，稱量瓶實(shí)驗(yàn)二 儀器藥品：凱氏蒸餾器、凱氏燒瓶、消化架、三角燒瓶、滴定管、移液管、量筒 燒杯、天平、2%硼酸、濃硫酸、催化劑：硫酸銅和硫酸鉀按31混合，研細(xì)?；旌现甘緞?.1%溴甲酚綠酒精溶液10ml，0.1%甲基紅酒精溶液2ml，混合即得，貯于棕色瓶內(nèi)。實(shí)驗(yàn)三 實(shí)驗(yàn)儀器：層析缸；毛細(xì)管；噴霧器；層析濾紙。試劑：擴(kuò)展劑（將20ml的正丁醇和5毫升的的冰醋酸

27、放入分液漏斗中，與15毫升水混合，充分振蕩，靜止后分層，放出下層水層備用）；氨基酸溶液（0.5%的賴氨酸，脯氨酸，結(jié)氨酸，苯丙氨酸，亮甘酸溶液及他們的混合液）；顯色劑50-100毫升0.1%水和茚三酮正丁醇溶液2-4實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)一測定時(shí)，精確稱取奶粉210g（視樣品性質(zhì)和水分含量而定），置于已干燥、冷卻并稱至恒重的有蓋稱量瓶中，移入95105常壓烘箱中，開蓋24小時(shí)后取出，加蓋置干燥內(nèi)冷卻0.5小時(shí)后稱重6。再烘1小時(shí)左右，又冷卻0.5小時(shí)后稱重。重復(fù)此操作，直至前后兩次質(zhì)量差不超過2mg即算恒重7。實(shí)驗(yàn)二 1樣品的消化(1)在分析天平上準(zhǔn)確稱取生物制品干粉（4060目過篩）100500mg

28、（視樣品中含氮量而定）2份。(2)取50ml凱氏燒瓶3只，將稱好的樣品分別送入第1、2只燒瓶底部，第3只燒瓶不加樣品，作為空白對照，以測定試劑中的微量含氮化合物。于各個(gè)燒瓶中加入催化劑0.3g，濃硫酸5ml，然后將燒瓶置于通風(fēng)櫥消化架上，先用小火加熱，待瓶內(nèi)水分蒸完，硫酸開始放出SO2白煙，可加大火焰，使液體保持微沸狀，直至溶液呈透明藍(lán)綠色為止。在消化過程中，要經(jīng)常轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶，使得瓶壁上的碳化顆粒，為濃硫酸回流至瓶底，使消化完全。為了縮短消化時(shí)間，當(dāng)溶液變?yōu)闇\棕色時(shí)，可加34滴30%過氧化氫。消化完畢，冷卻，待蒸餾。2氨的蒸餾(1)蒸餾裝置的洗滌：先用自來水將凱氏定氮儀清洗干凈，按圖1裝置好。在

29、蒸汽發(fā)生瓶中（燒瓶1）加入約2/3體積的蒸餾水，加入濃硫酸數(shù)滴（在酸性情況下，水中氨不會蒸餾出來）及沸石（或毛細(xì)管數(shù)根）使沸騰均勻，關(guān)閉活塞A和B，將燒瓶1中的水煮沸，使蒸汽充分洗滌儀器，并檢查裝置的各個(gè)部分有無漏氣現(xiàn)象，然后打開活塞B，讓蒸汽洗滌漏斗約5分鐘，再將活塞B關(guān)閉，繼續(xù)蒸餾約5分鐘，使全部蒸餾器洗滌干凈。先移去三角燒瓶，再移去煤氣燈，略等數(shù)秒鐘，此時(shí)燒瓶1內(nèi)氣壓下降，積聚在蒸餾瓶3內(nèi)的水，被吸到管2內(nèi)，開啟活塞A，廢液即從管2底部放出。以后每個(gè)樣品蒸餾完畢，都需進(jìn)行上述的洗滌過程23次。(2)消化液的蒸餾：先打開活塞A和B，再將事先準(zhǔn)備好的盛有5ml2%硼酸及2滴混合指示劑的三角燒

30、瓶，放在冷凝管下端，使管口浸入液面下。取蒸餾水1ml加到凱氏燒瓶中，使與消化液混合，小心地將此溶液從漏斗倒入蒸餾瓶3中，再用少量蒸餾水洗滌克氏燒瓶，洗液也從漏斗倒入蒸餾瓶3中，如此洗滌3次。然后從漏斗加入30%NaOH7ml，用蒸餾水少許洗滌漏斗2次，每次放液時(shí)都應(yīng)控制活塞B，保留少許蒸餾水于漏斗內(nèi)，密封之以防逸出氨氣。關(guān)閉活塞A和B，立即將燒瓶1加熱沸騰，開始蒸餾。三角燒瓶中的液體由棕紫色變?yōu)樗{(lán)綠色，再繼續(xù)蒸3分鐘，將三角燒瓶下降，使冷凝管口離開液面約1cm，繼續(xù)蒸餾1分鐘。用少量蒸餾水沖洗冷凝管下端，洗滌液直接流入三角燒瓶中，然后移去三角燒瓶，再移煤氣燈，使蒸餾瓶3中的廢液吸到管2中，開啟

31、活塞A放出廢液。然后按上述步驟洗滌蒸餾器備用。3. 滴定蒸餾完畢后，將三角燒瓶內(nèi)的溶液，用0.01mol/L鹽酸滴定，使溶液從藍(lán)綠色變?yōu)榈仙?，即為終點(diǎn)。分別記下樣品和空白所消耗的0.01mol/L鹽酸ml數(shù)，分別以Vs和V0表示之8。實(shí)驗(yàn)三1、取層析紙一張。在紙的一端距邊緣2厘米處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔1-1.5厘米作一記號。2、點(diǎn)樣 用毛細(xì)管將各氨基酸樣品分別點(diǎn)在這六個(gè)位置上，干后再點(diǎn)一次。每點(diǎn)在紙上的擴(kuò)散直徑最大不超過3毫米。3、擴(kuò)展 用線將濾紙縫成筒狀，只得兩邊不能接觸。將盛有擴(kuò)展劑的培養(yǎng)皿迅速的置于密封的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點(diǎn)樣的一端在下，擴(kuò)展劑的液面需低于

32、點(diǎn)樣線1厘米）到溶劑上升15-20厘米時(shí)即取出濾紙，用鉛筆描繪出溶劑前沿線，自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干。4、顯色 用噴霧器均勻的噴上0.1%的茚三酮正丁醇溶液；然后置于烘干箱烘干5分鐘就可顯現(xiàn)出各個(gè)層析斑點(diǎn)2-5數(shù)據(jù)記錄與處理：實(shí)驗(yàn)一水分測定結(jié)果按下式計(jì)算9：水分（%）= %-干燥前樣品與稱量瓶質(zhì)量，g m-干燥后樣品與稱量瓶質(zhì)量，gm 3 -稱量瓶質(zhì)量 ， gm1=30.8389gm2=30.7764gm3=28.8340g 實(shí)驗(yàn)二按下式計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)含量：Vs為滴定樣品用去的鹽酸mL數(shù)；V0為滴定空白用去的鹽酸mL數(shù)；C為標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的摩爾濃度(mol/L)；14為氮的原子量；W為樣品重量

33、 mg-6.25為氮蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)的平均值。材料不同轉(zhuǎn)換系數(shù)也不同。1蛋白質(zhì)含量的測定Vs=(20.9+20.6+24.0+26.1+27.2)/5=23.76mLV0=2.56mLW=65mg 實(shí)驗(yàn)三1、判斷氨基酸中的單組分。從下向上依次為：賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸。2、氨基酸的分離鑒定計(jì)算分析：Rf=原點(diǎn)到層析中心的距離/原點(diǎn)到層析劑前沿的距離各種氨基酸的Rf值（各種單組分、混合氨基酸液）。氨基酸種類賴氨酸脯氨酸結(jié)氨酸苯丙氨酸亮氨酸混合液原點(diǎn)距層析中心距離cm1.62.74.1 4.3 5.21.35.3原點(diǎn)距層/析前沿距離cm8.58.58.58.58.58.5氨基酸類種

34、類賴氨酸脯氨酸結(jié)氨酸苯丙氨酸亮氨酸Rf0.1880.3180.4820.5060.612混合液Rf 0.153 0.624 2-6結(jié)果與討論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定，奶粉樣品水含量為.；蛋白質(zhì)含量為0.029%；紙層析法分離鑒定氨基酸，從顯色劑噴淋烘干后的濾紙清晰看見單組分氨基酸的層析斑點(diǎn)，黃色的斑點(diǎn)是脯氨酸，其余氨基酸均為粉紅色斑點(diǎn)。通過計(jì)算比較Rf值可以分辨出氨基酸的種類，分析結(jié)果如上表所示。實(shí)驗(yàn)討論：1、實(shí)驗(yàn)以小組為單位進(jìn)行，每位組員都進(jìn)行了獨(dú)立完善的操作，分工合作明確，使每位同學(xué)的實(shí)際操作能力得到了鍛煉。但同時(shí)要注意到，由于每位組員的操作水平和操作習(xí)慣存在較大差異，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成

35、了一定影響。因此在實(shí)驗(yàn)過程中必須嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟，規(guī)范操作，盡量避免人為因素造成的操作誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2、實(shí)驗(yàn)前必須嚴(yán)格檢查實(shí)驗(yàn)器材和實(shí)驗(yàn)試劑。確保實(shí)驗(yàn)器材的干凈整潔（排除殘留物對實(shí)驗(yàn)的干擾），試劑合格無污染。對測量性實(shí)驗(yàn)儀器盡量進(jìn)行校正。盡量減少系統(tǒng)誤差。3、測定奶粉中水分含量時(shí)，當(dāng)稱量皿從烘箱中取出后，應(yīng)迅速放入干燥器中進(jìn)行冷卻，避免因奶粉吸收空氣中水分而造成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏高。前后兩次稱量的差量在2mg以內(nèi)（2mg）才能視作為恒重。4、蛋白質(zhì)含量測定時(shí)，要嚴(yán)格洗滌蒸餾裝置，避免上次實(shí)驗(yàn)殘留影響。蛋白質(zhì)分解時(shí)要嚴(yán)格水密封，冷凝管必須沒入硼酸吸收夜下部，防止氨氣泄漏造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏低。樣品不可粘附在燒瓶頸部,否則頸部粘附的含氮化合物在無硫酸存在的情況下不能消化完全而造成氮損失；滴定用鹽酸依次為：20.9ml、20.6ml、24.0ml、26.1ml、27.2ml，鹽酸消耗量上升明顯，可能是殘留氨洗滌不凈造成，實(shí)驗(yàn)時(shí)要特別注意。5紙層析法分離氨基酸的實(shí)驗(yàn)中，整個(gè)操作過程必