DGGE技術及其在環(huán)境微生物中的應用_圖文

1、第33卷第10期2008年10月環(huán)境科學與管理ENV IRONM ENTAL SCIENCE AND M ANAG EM ENT Vol 133N o 110Oct .2008收稿日期:2008-06-21作者簡介:李懷(1982-,男,碩士研究生,主要研究方向:水污染控制工程。通訊聯(lián)系人:關衛(wèi)省文章編號:1673-1212(200810-0093-04DGGE 技術及其在環(huán)境微生物中的應用李懷1,關衛(wèi)省1,歐陽二明2,王曉慧2,張杰2(1.長安大學環(huán)境科學與工程學院,陜西西安710054;2.清華大學環(huán)境科學與工程系,北京100084摘 要:變性梯度凝膠電泳(D GGE 具有可靠性強、重復性

2、好、方便快捷等優(yōu)點,已被廣泛應用于環(huán)境科學和污染防治研究領域。介紹了變性梯度凝膠電泳(DGGE 的基本原理和技術路線,重點介紹和討論了DGGE 技術在廢水生物處理、廢氣生物處理和固廢生物處理中的應用現(xiàn)狀,并對該技術的應用前景進行了展望。關鍵詞:DGGE ;微生物多樣性;活性污泥中圖分類號:X703.1文獻標識碼:ADGGE (Denat ured G radient G el E lectrophoresisand its App li catio ni n the R esearch of Enviro n m enta lM icrob i ologyL iH ua i 1,GuanW e

3、 i s heng 1,Ou Yanger m i n g 2,Wang X iaohui 2,Zhang Jie2(1.Depart m ent of Envir on m e n tal Science and E ng i neeri ng ,Chang p an U nivers ity ,X i p an 710054,Ch i na ;2.D e part m ent of Envir on m e n tal Science and Eng i neeri ng ,Ts i nghua Un i versity ,Beiji ng 100084,Ch i naA b stract

4、 :Denaturi ng gradient gel el ectro phoresis(DGGEhas the a dvantages of h i gh reli abilit y ,good re petiti on and easy op 2erati on ,and been w i del y used i n e nviro n m e ntal scie nce a nd Poll utio n p r eventio n resear ch ar eas .I n th is paper ,it is briefly i ntro 2duce d that DGGE(dena

5、turing gr ad i ent gel el ectro phoresisis app li ed i nW aste water b i ological treat m en,t waste gas b i ological treat 2ment and solid waste b i ologi cal treat me nt a nd its p ri nci pa,l Techn ical r ou te ,as well as t he f utur e of t h is technol ogy was e xpecte d .K ey words :DGGE ;m i

6、cr ob ial d i versity ;acti vated sludge變性梯度凝膠電泳(Denatur i n g grad ient gel elec 2trophoresis ,DGGE 技術是由F ischer 和Ler m an 于1979年最先提出的用于檢測D NA 突變的一種電泳技術1。1993年Muzyer 等2首次將DGGE 技術應用于微生物生態(tài)學研究,并證實了這種技術在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優(yōu)越性?；钚晕勰辔⑸锓N類極其豐富,優(yōu)勢種群及其微生物多樣性在活性污泥生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。目前在環(huán)境科學和污染防治研究領域,關于活性污泥

7、中微生物多樣性的研究越來越受到重視;而傳統(tǒng)的純培養(yǎng)分離技術研究活性污泥微生物多樣性有很大的缺陷,不能獲得未被培養(yǎng)的微生物的信息,只能分離出占活性污泥總數(shù)011%1%的微生物種類。而分子生物學技術如PCR-D GGE ,PCR-SSCP 和T-RFLP 等能夠在分子水平上對活性污泥微生物多樣性進行快速和精確的分子診斷,并可以監(jiān)測未被培養(yǎng)的微生物種類。所以與傳統(tǒng)方法相比DGGE 技術能夠快速、準確地鑒定在自然生境或人工生境中的微生物種群,并進行復雜微生物群落結構演替規(guī)律、微生物種群動態(tài)、基因定位、表達調控的評價分析。由于DG GE 具有可靠性強、重現(xiàn)性高、方便快捷等優(yōu)點,短短的十年內,已經(jīng)成為微生

8、物群落遺傳多樣性和動態(tài)分析的強有力工具,并被廣泛用于活性污泥、生物膜、土壤、底泥等環(huán)境樣品中的微生物多樣性檢測和種群演替的研究。1 D GGE 的基本原理DGG E 技術主要原理如圖1所示,在堿基序列存在差異的D NA 雙鏈解鏈時需要不同的變性劑濃度,他們一旦解鏈,在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳行為將發(fā)生很大的變化。因此,將PC R 擴增得到的等長DN A 片段在含有變性劑梯度的凝膠中進行電泳,序列不同的D NA 片段就會在各自相應的變性劑濃度下變性,發(fā)生空間構型的變化,導致電泳的速度急劇下降,以#93#至停留在相應變性劑梯度凝膠中,染色后在凝膠上呈現(xiàn)為分開的條帶,每個條帶代表一個特定序列的D N

9、A 片段。在不同泳道中停留在相同位置的條帶,一般可視為具有相同的D N A 序列。該技術可以分辨具有相同大小片段的序列差異,可以用于檢測單一堿基的變化,微生物群落遺傳多樣性以及PC R 擴增D NA 片段的多態(tài)性。 圖1 D GGE 反應原理為了提高DGGE 的檢測敏感性,通常在一側引物的5c 端設計增加一段富含GC 的區(qū)域(GC -Cla mp ,其長度通常為3050個核苷酸,避免了D NA 的完全解鏈,從而提高了不同堿基的檢出率,使相差一個堿基的序列也能分辨分離。2 技術步驟該技術主要操作過程(圖2如下:(1樣品總D NA 提取;(2樣品16Sr D NA 片段的PCR 擴增;(3D GG

10、E 條件優(yōu)化與分析;(4割膠測序等后續(xù)處理。 圖2 微生物群落結構的16SrD NA 分析方法2.1 樣品總D NA 提取沉淀物、活性污泥和生物膜等樣品中細菌種類復雜且混雜有大量有毒物質,如何使所有細胞裂解、充分釋放D NA 、有效去除雜質,建立高效、可靠的D N A 提取方法成為研究者關注的熱點。當前主要使用超聲波法、基于S DS 的裂解法、改進的化學裂解法、微波法、凍融+玻璃珠+溶菌酶+S DS 和土壤提取D N A 試劑盒法等6種活性污泥D NA 提取方法。2.2 樣品16Sr D NA 片段的PCR 擴增PCR 擴增是PCR-D GGE 技術中至關重要的步驟。PCR 全過程包括三個基本

11、步驟,如圖3所示:雙鏈D NA (模板D NA 加熱變性為單鏈(變性;在低溫下引物與模板D NA 單鏈互補配對(退火;在適宜溫度下TaqDNA 聚合酶催化引物沿著模板D NA 延伸(延伸。反復進行變性、復性和延伸的循環(huán),從而使擴增D NA 產(chǎn)量呈指數(shù)上升,經(jīng)2530個循環(huán)后,擴增倍數(shù)可達106倍。圖3 PCR 反應原理通常采用16Sr D NA 中的保守區(qū)作為引物進行PCR 反應。這是由于16Sr D NA 具有以下幾個特點:(116Sr D NA 約為1500個核苷酸長,序列長短適中,適合用作分類學上的研究;(2任何一種原核生物體都具有16Sr D NA ;(316Sr D NA 非常保守;

12、(416Sr D NA 不會在不同的個體間進行基因交換,各物種具自己的獨特序列;(5目前已有相當完備的16Sr D NA 基因資料庫,經(jīng)過GenBank 和R i b oso ma l D atabase Project(RDP基因資料庫作對比分析,并可進行親源關系分析、鑒定等。Yu 等8研究了16Sr D NA 不同可變區(qū)V1、V3、V5、V6、V8及V1V3、V3V5、V6V8區(qū)的PCR 擴增產(chǎn)物及其DGGE 結果。結果表明擴增V3區(qū)及V3V5區(qū)的引物為最佳引物選擇。V3區(qū)的PCR -DG GE 條帶數(shù)最多、分離效果最好。如果需要較長的擴增產(chǎn)物,則選擇V3V5區(qū)。2.3 D GGE 條件的

13、優(yōu)化通常根據(jù)基因片段的大小來確定聚丙烯酰胺凝膠濃度,當片段大小在200bp 左右時,一般采用8%的凝膠,片段在500bp 時用6%的凝膠。為提高分辨效果,也可以采用梯度凝膠進行分離,對于200bp 的片段,可以采用6%12%的丙烯酰胺凝膠。變性劑的梯度范圍要根據(jù)垂直DGGE 實驗來確定,垂直實驗曲線斜率較大的部分代表解鏈區(qū)域的T m (解鏈溫度值,此時低溫解鏈區(qū)的不同分子達到最佳分離狀態(tài)。通常選擇水平膠的的變性劑梯度范圍為30%(相當于T m 范圍10e 左右,對于不同的樣品還需要進行調整。對大多數(shù)D NA 片段50e #94#65e是比較適合的,通常電泳的溫度要低于樣品解鏈區(qū)域的T m值。電

14、泳時間取決于樣品的片段大小、凝膠濃度、變性劑梯度、電泳時的電壓等因素,一個條件的改變都可能引起電泳時間的不同,可以用時間進程法來優(yōu)化出最佳電泳時間。為了更好的顯示D GGE條帶,可以選擇不同的染色方式(EB、S YBR Green I和銀染。其中,S YBR GreenÑ染色的優(yōu)點是背景色低,可以觀察到盡可能多的條帶;銀染的靈敏度最高,但銀染過后的條帶不能用于雜交分析。2.4割膠測序對D GGE圖譜上的優(yōu)勢條帶進行割膠回收,將回收條帶的PCR產(chǎn)物進行測序分析。3D GGE在環(huán)境微生物中的應用3.1在廢水生物處理研究中的應用D GGE技術在廢水生物處理研究中的應用使人們對廢水處理過程中

15、微生物群落的變化產(chǎn)生了新的認識。Lapara等3研究了升高溫度對廢水好氧生物處理過程中細菌群落結構和功能的影響,DG GE分析細菌群落的結果表示不同溫度下有不同的細菌群落。Santegoeds等4用DGGE研究了來自污水處理廠的生物膜中S RB種群的變化和硫酸還原的優(yōu)化。在生物膜的生長過程中,微生物群落的遺傳多樣性增多。用專一性寡核苷酸探針對DG GE條帶進行雜交分析,在所有的生物膜和活性污泥樣品中,D esulf obu l b us和Desulf-ovi b rio是主要的S RB,在好氧層內部的厭氧區(qū)存在一種隸屬于Desu lf-one m a的絲狀SRB。但是,在第6周和第8周,可以發(fā)

16、現(xiàn)不同種類的Desu lf obulbus和Desul-f ovi b rio。劉新春等5應用DG GE方法,對在相同的操作條件下分別用低溫菌和常溫菌接種的兩套活性污泥系統(tǒng)中的微生物群落結構的動態(tài)變化進行了追蹤。由于工藝相同,使得接種的低溫菌群和常溫菌群在相同的操作條件下,產(chǎn)生了相似的微生物群落結構。隨著運行時間的增加,其菌群結構相似程度也越來越高。硝化作用是廢水處理系統(tǒng)中實現(xiàn)氨氮去除的關鍵步驟。而氨氧化細菌在硝化作用過程中負責將氨氧化為亞硝酸鹽,實現(xiàn)亞硝化作用,是硝化過程中必不可少的步驟。由于氨氧化細菌的生長速率相當?shù)?生物量很少,采用傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)分析法研究氨氧化細菌相當費時、繁瑣。A

17、vraha m i等6研究了溫度對水處理反應器中AOB(氨化細菌菌種群結構的直接或間接影響。許玫英等7采用PCR擴增16Sr D NA、擴增功能基因、隨機克隆測序等技術,分析處理含高濃度氨氮廢水處理系統(tǒng)不同馴化時期的4個活性污泥樣品氨氧化細菌的種類和氨單加氧酶的活性,并在國內首次采用PC R-DGGE相結合的技術對樣品中總的細菌類群的差異進行研究。結果表明采用PCR-DG GE技術有利于更全面地了解氨氧化細菌的類群和功能,進而改善廢水處理系統(tǒng)的處理效果。許春紅8等對處理抗生素廢水的厭氧復合床中的微生物種群多樣性進行研究。結果顯示,厭氧復合床反應器中微生物種群豐富,距底部3m以下種群最多且相似性

18、較高,3m以上的填料層部位微生物種群明顯減少,除產(chǎn)甲烷菌為主外,污泥床層與填料層中分別有不同的優(yōu)勢菌種與產(chǎn)甲烷菌協(xié)同作用。王峰等9應用PCR-DG GE技術對城市污水化學-生物絮凝強化一級處理工藝與傳統(tǒng)的完全混合式處理工藝反應池活性污泥樣品微生物種群結構進行了對比研究,對同一反應器不同位置微生物分布以及不同工況下的微生物種群結構進行了初步探討。結果表明兩種城市污水處理工藝中微生物種群多樣性都相當豐富,但是種群結構相差很大,說明化學生物絮凝處理工藝的微生物作用與成分相近的城市污水處理工藝中微生物作用機理可能存在相當大的差別。Rowan等10采用生物滴濾反應器和生物濾池處理同種廢水,運用PCR-D

19、GGE考察了不同反應器中的氨氧化細菌菌群的組成。雖然不同形式反應器或是同一反應器的不同位置中的氨氧化細菌菌群組成不同,但是主要種群是不依賴反應器的形式或是在反應器中所處的位置不同而改變的,也正是這些主要種群在整個處理過程中發(fā)揮著重要的作用。Curtis等11采用PCR-DGGE比較了不同污水處理廠的活性污泥中總微生物群落的多樣性。裘湛等12采用PC R-DGGE技術對處理采油廢水的水解酸化-缺氧法不同生物反應器中污泥樣品進行研究,確定了微生物的優(yōu)勢菌種,并進行了多樣性分析,結果顯示了在不同環(huán)境條件下微生物群落結構的連續(xù)動態(tài)變化過程。3.2在廢氣生物處理研究中的應用生物過濾作為一種能夠有效處理惡

20、臭和揮發(fā)性有機廢氣的污染控制技術,由于其簡單高效,得到了快速的發(fā)展。生物濾池和生物濾塔作為生物處理氣體的典型。陳桐生13等采用PC R-DGG E技術研究除臭生物濾池中試裝置中分別處于較強酸性和中性的兩種不同運行環(huán)境下微生物種群的多樣性和生物種群的結構變化。通過擴增細菌16Sr RNA基因的V3可變區(qū),結合應用DG GE技術分析除臭生物濾池的生物種群的結構變化,并回收主要的D NA片段,結合PCR測序及T載體克隆測序,明確優(yōu)勢菌群的系統(tǒng)發(fā)育地位。結果表明,除臭生物濾池在不同的p H條件下,微生物的多樣性及其豐度存在較大差別,強酸性對微生物具有較高的選擇作用,與中性條件相比,微生物種群多樣性相對

21、較低。同時在濾池的不同層次#95#上也表現(xiàn)出明顯的空間分布多樣性差異,序列比對結果顯示硫氧化細菌在除臭過程中占有優(yōu)勢地位,為更好地處理惡臭氣體提供可靠的科學依據(jù),同時也為生物除臭的應用提供一定的理論基礎。李建軍等14利用D GGE技術對處理甲苯廢氣的生物滴濾池中微生物生態(tài)學進行了研究,在運行過程中,隨著生物滴濾池對甲苯去除能力的不斷增加,填料當中的微生物種群也發(fā)生了明顯的變化。在甲苯的選擇壓力下,隨時間的遷延,微生物種類減少,優(yōu)勢種群的相對豐度增加,處于不同層面填料上的微生物分布也趨向于一致。殷峻等15應用D GGE技術對處理含氨廢氣的生物濾塔中微生物多樣性隨時間的變化進行了研究,通過比較反應

22、器不同填料、不同時期微生物多樣性得出結論:填料中微生物的多樣性都隨著反應器運行時間的延長而有所減少;與污泥填料和混合填料相比,堆肥填料的微生物多樣性程度最高,反應器的去除能力也最好。3.3在固廢生物處理研究中的應用在固廢處理過程中,污泥的穩(wěn)定化和餐廚垃圾的處理是當前要解決的重要問題。微生物的穩(wěn)定化過程對于系統(tǒng)達到穩(wěn)定狀態(tài)具有更直接的指導意義。李竺等16利用DG GE對快速高效堆肥處理城市污泥中微生物進行了多樣性研究,結果表明污泥中的微生物種群有顯著的改變,同時對堆肥后污泥中的微生物進行了嘗試性探討。原泥中無明顯亮帶,而堆肥高溫期物料(反應8d與回流物料和出料(均反應16d有較為明顯的亮帶,這說

23、明該堆肥工藝對污泥中微生物的種群構成有明顯的作用,原泥中并無明顯優(yōu)勢菌種,而經(jīng)堆肥后泥樣中有明顯優(yōu)勢菌種出現(xiàn),這可能是堆肥過程中起積極作用的微生物實現(xiàn)了污泥的減量化和穩(wěn)定化。傅以鋼等17用D GGE指紋圖譜技術對污泥堆肥工藝中的細菌種群動態(tài)變化及多樣性進行了研究。結果表明,生物法污泥堆肥周期小于8d。對污泥堆肥各工藝環(huán)節(jié)樣品進行DG GE指紋圖譜和相似性系數(shù)Cs值分析,發(fā)現(xiàn)隨著反應的持續(xù)進行,微生態(tài)結構的Cs值越來越高,說明微生物種群結構愈趨穩(wěn)定。證實污泥微生態(tài)能迅速進行優(yōu)勝劣汰的篩選,調整內部細菌種群結構,從而達到適應環(huán)境的目的,在發(fā)酵過程中形成的優(yōu)勢細菌種群能長時間保持穩(wěn)定。劉有勝等18利

24、用D GGE技術對城市餐廚垃圾堆肥過程中細菌種群結構隨時間的變化進行了研究。D GGE圖譜顯示,不同時間堆肥樣中細菌D GGE圖譜有著明顯的差異性;堆肥升溫期細菌種群豐富,優(yōu)勢種群不明顯;高溫期細菌種群減少,優(yōu)勢種群明顯;降溫期細菌種群結構基本保持穩(wěn)定。溫度對堆肥過程中細菌種群具有明顯的篩選作用。堆肥各階段D GGE圖譜相似性Cs值比較低,堆肥處理后細菌種群結構與堆肥原料之間存在明顯差異。4不足與展望在短短十年內,DGGE技術已經(jīng)成為微生物群落遺傳多樣性和動態(tài)分析的強有力工具,還存在著不足:實際微生物細胞壁的堅實度不同獲得樣品中所有種類微生物的r D N A難度加大,容易導致提取DNA不完全;

25、實際PCR擴增過程中不均等擴增(Bi2 as、有些微生物r D NA條數(shù)不同等都會造成PCR結果的代表性下降;理論上對于500bp以內含GC堆積r D NA,DGGE可以分離其所有點變異的95%,但實際上來自一種微生物的DN A量不到樣品D NA量的1%時,肉眼難以檢測其條帶。因此,D GGE技術作為一項新興的研究手段和工具,還需要在以下幾個方面進行加強和改進:(1需要摸索適合具體樣品的D NA提取方法和最佳PC R條件;(2優(yōu)化DG GE條件和仔細分析具體結果。此外,還應該加強DG GE技術與其它技術的聯(lián)用:D GGE方法可能采用雙梯度D GGE/TG GE,如聯(lián)合使用一個丙烯酰胺梯度或溫度

26、梯度以達到更好的分辨率;利用末端標記的熒光PCR產(chǎn)物、附加熒光內泳道標準化檢測稀少群落組成和精確的樣品對樣品比較。使用功能型基因作為分子標記也能區(qū)別關系相近但生態(tài)差異的種群;DG GE與克隆文庫等技術結合,可克服局限性,充分發(fā)揮分離的優(yōu)勢。目前的發(fā)展趨勢是PC R-D GGE/TG GE與其他分子技術以及微生物學、地球化學方法聯(lián)合使用,這樣可以減少不同技術的弊端與局限性,綜合各種技術的優(yōu)勢,從而更真實地揭示環(huán)境微生物群落結構和功能的本質。5結語DGGE技術作為一項新興有力的研究工具,已成為環(huán)境微生物群落遺傳多樣性和動態(tài)分析的強有力工具,DGGE技術及其它分子生物學技術的引入將為中國環(huán)境科學和污

27、染防治研究領域的基礎理論研究提供強有力的武器,同時也會促進工程實踐的快速發(fā)展,對中國的環(huán)境污染控制作出貢獻。參考文獻:1Muyzer G,S m a lla K.App lica ti o n of denatur i ng gradient ge l electrophoresi s(D GGEand te m perature gradient ge l e l ectro2 phoresis(T GGEi n m i cro b ial ecol ogyJ.Antonie van Leeu wen2 hoek,1998,73:127-141.2Muyzer G,W aa l EC,U i

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29、of elevated te mperat ure on bacterial co mmunity st ructure and func2 tio n i n b i oreactors t reati ng a synt heti c waste waterJ.M icro b i o.l Biotechno.l,2001,24(2:140-145.(下轉第99頁#96 #第33卷第10期2008年10月卓燕等#C AS T工藝在制革廢水處理中的應用Vol133N o110Oct.2008表2制革廢水處理效果m g/l月份進水C OD c r B OD5S2-總Cr p H值出水C OD

30、c r B OD5S2-總Cr pH值5主要經(jīng)濟技術指標該工程總投資為175萬元,總占地面積為600 m2。該廢水處理站總裝機功率為4515K W,使用功率為3918K W。運行成本為1.52元/,t其中人工費0105元/t、電費0182元/t、藥劑費0155元/,t污泥外運費0110元/t。6結論(1通過分流和采用物化作為預處理工藝,取得較理想的COD和色度去除效果,對COD的去除率達到了50%以上,大大地降低了后續(xù)生物處理的負擔,為達標排放提供保障。(2CAS T工藝保持了典型的完全混合特性,處理效果好,抗沖擊能力強的特點,對COD cr、B OD5、S2-、總Cr的去除率均在90%以上,

31、處理出水優(yōu)于國家二級標準。(3CAS T設置生物選擇器,促進絮凝型細菌的生長和繁殖,從而抑制了污泥膨脹的發(fā)生,高效地進行硝化反硝化,脫氮除磷效果顯著。(4應用物化-CAST工藝處理制革污水,工藝流程簡單,采用矩形結構,節(jié)約工程基建投資,運行時,不需要大量的污泥回流,自動化程度高,實現(xiàn)自動控制,運行靈活,方便維護管理,降低處理費用,所以建設和運行費用低。參考文獻:1卓燕,滕國,楊剛,等.南海皮廠有限公司污水處理工程竣工驗收及報告R.睢寧縣環(huán)境監(jiān)測站,2004:6-8.2張自杰.排水工程(下冊M.中國建筑工業(yè)出版社,1994:216-219.4陶如鈞.物化-水解酸化-CAST工藝處理制革廢水.工業(yè)

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